DNA重組技術(shù)與基因操作課件

1、DNA重組技術(shù)要有四個必要條件：工具酶、基因、載體、受體細(xì)胞第1頁，共84頁。DNA限制性內(nèi)切酶可分為三類：、 類限制性內(nèi)切酶是基因工程中所用的主要工具酶 、限制性內(nèi)切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性。類酶在識別位點上切割DNA，然后從底物上解離下來。類酶結(jié)合于特定的識別位點，但卻沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進(jìn)行隨機切割，很難形成穩(wěn)定的、特異性切割末端。、酶在基因工程中基本不用 第一節(jié)限制性內(nèi)切酶第2頁，共84頁。一、II類限制性內(nèi)切酶的特點識別特定的核苷酸序列，其長度一般為4、5或6個核苷酸且呈二重對稱，但有少數(shù)酶識別更長的序列或兼并序列；具有特定的酶切

2、位點 ，產(chǎn)生出特定的酶切末端5突出粘末端、3突出粘末端、平末端；類限制修飾系統(tǒng)是由兩種酶分子組成的二元系統(tǒng)；限制性內(nèi)切酶、獨立的甲基化酶。第3頁，共84頁。5突出粘性末端 EcoRI的識別序列為3突出粘性末端 Pst識別位點平端 Sma識別位點5G AATTC33CTTAA G5切割5-G -CTTAAAATTC-3 G-5+5CTGCA G33G ACGTC55-CTGCA 3-G G-3ACGTC-5+5CCC GGG3 GGG CCC5CCC GGGGGG3CCC+第4頁，共84頁。二、使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)注意的問題1、仔細(xì)查閱酶的識別序列和切割位點。同裂酶：不同來源但是識別同樣順序和相

3、同切割位點的限制性內(nèi)切酶。同尾酶：有時有兩種限制性內(nèi)切酶識別不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所產(chǎn)生的粘性末端卻相同，這類酶為具不同酶切位點的DNA片段重組提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA連接酶連接后，都不能再被其切割了。第5頁，共84頁。2、注意酶反應(yīng)條件，相同反應(yīng)條件的酶可以同時酶解DNA樣品。3、注意說明書中所列出的comments的內(nèi)容，會提供有關(guān)限制性內(nèi)切酶識別序列中位點特異性甲基化的信息以及引起酶產(chǎn)生star activity的原因。star activity：指當(dāng)酶的反應(yīng)條件改變時，其在識別序列中的酶切位點發(fā)生改變。產(chǎn)生的原因：反應(yīng)體系中甘油的濃度12；酶：D

4、NA比率25u/g；缺少Nacl和存在Mn2。第6頁，共84頁。4、注意酶的濃度，酶切時不是酶加得越多越好。一般以在20l反應(yīng)體積中，37，每小時水解1微克DNA的酶量定為一個酶單位。5、注意酶在保溫過程中的活性變化。ACC在5 小時內(nèi)具有全部活力BamH在第一個小時內(nèi)具有全部活力，在第二小時具有部分活力，而在2小時以后就無活力了。Cfo僅在第一個小時內(nèi)具有全部活力，一個小時以后就沒有活力了。第7頁，共84頁。三、連接酶定義：用于將兩端乃至數(shù)段DNA片段拼接起來的酶。用途：（1）、連接帶匹配粘末端的DNA分子；（2）、使平末端的雙鏈DNA分子相互連接或與合成的寡核苷酸接頭相連接。這類反應(yīng)要比粘

5、末端之間連接慢得多，但單價陽離子（150-200mmol/LNacl）或低濃度的聚乙二醇（PEG）可提高連接效率。第8頁，共84頁。四、修飾酶1、DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I，大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（klenow fragment）、T4噬菌體DNA聚合酶、T7噬菌體DNA聚合酶、耐高溫DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）、反轉(zhuǎn)錄酶、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶等2、依賴于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌體及T7和T3噬菌體RNA聚合酶用途:在in vitro條件，合成單鏈RNA作為雜交探針。第9頁，共84頁。3、T4噬菌體多核苷酸激酶：催化ATP的磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA片段的5末端

6、。用途：標(biāo)記DNA片段的5端，制備雜交探針；基因化學(xué)合成中，寡核苷酸片段5磷酸化；用于測序引物的5標(biāo)記。5 HOOH 3HOOH355突出末端5隱蔽末端532 POH 3HO32P3532P ATP第10頁，共84頁。4、堿性磷酸酶：用途：去除DNA片段5末端的磷酸，以防止在重組中自身環(huán)化，從而提高重組效率；在用32pATP標(biāo)記DNA或RNA的5末端前，去除DNA或RNA片段的非標(biāo)記的5磷酸。5 POH 3HOP355突出末端5隱蔽末端OHHO5HOOH 335第11頁，共84頁。第二節(jié)克隆載體基因工程載體應(yīng)具備的條件：能自我復(fù)制并能帶動插入的外源基因一起復(fù)制；具有合適的限制性內(nèi)切酶位點： 在

7、載體上單一的限制性酶切位點越多越好，這樣可以將不同限制性內(nèi)切酶切割后的外源DNA片段方便的插入載體；在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)要多，這樣才能使外源基因得以擴增；載體的分子量要小，這樣可以容納較大的外源DNA插入片段：在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失；應(yīng)該有一個或多個選擇標(biāo)記。第12頁，共84頁。大腸桿菌表達(dá)載體應(yīng)具備：強的啟動子，一個強的可誘導(dǎo)的啟動子可使外源基因有效的轉(zhuǎn)錄；在啟動子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個好的核糖體結(jié)合位點序列（SD）；在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個強的轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。第13頁，共84頁。一、質(zhì)粒定義：質(zhì)粒是能

8、自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們在細(xì)菌中以獨立于染色體之外的方式存在。ABOCSCL第14頁，共84頁。F質(zhì)粒：有些攜帶有幫助其自身從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一個細(xì)胞的信息的質(zhì)粒。R質(zhì)粒：表達(dá)對一種抗生素的抗性的質(zhì)粒。降解質(zhì)粒：攜帶參與或控制一些不同尋常的代謝途徑的基因的質(zhì)粒。穿梭載體：在大腸桿菌的載體上放上第二個復(fù)制起始位點，使它在另一個宿主細(xì)胞中也能進(jìn)行復(fù)制。第15頁，共84頁。1、質(zhì)粒載體pBR322大小為4363bp；含有兩個抗生素基因（抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素）；有單一的BamH、Hind和Sal的識別位點（在四環(huán)素抗性基因內(nèi)）、Pst識別位點（在氨芐青霉素抗性基因內(nèi)）； 外源片段在BamH、

9、 Hind、 Pst位點插入時，可引起抗生素失活來篩選重組體。帶有一個復(fù)制起始點，可以保證這個質(zhì)粒只在大腸桿菌里行使復(fù)制功能，在大腸桿菌里pBR322以高拷貝數(shù)存在。第16頁，共84頁。第17頁，共84頁。2、質(zhì)粒載體pUC19大小為2686bp；帶有pBR322的復(fù)制起始位點，一個氨芐青霉素抗性基因；一個大腸桿菌乳糖操縱子半乳糖苷酶基因的調(diào)節(jié)片段（lacZ）,一個調(diào)節(jié)lacZ基因表達(dá)的阻遏蛋白的基因lacI；含有多個單克隆位點。第18頁，共84頁。第19頁，共84頁。第20頁，共84頁。pUC19的篩選：培養(yǎng)基中含有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操縱子的一個誘導(dǎo)物）時，lacI的產(chǎn)物就

10、不能與lacZ的啟動子區(qū)域結(jié)合，質(zhì)粒pUC19的lacZ就可以轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯，lacZ蛋白會與染色體DNA編碼的一個蛋白形成具有活性的雜合半乳糖苷酶。在底物5溴4氯3吲哚半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal會被雜合半乳糖苷酶水解成藍(lán)色的產(chǎn)物，沒有插入外源DNA序列的pUC19質(zhì)粒克隆就呈藍(lán)色。由于pUC19的單克隆位點的序列是整合在lacZ之中的，若pUC19質(zhì)粒中插入有目的DNA片段，就會破環(huán)lacZ的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞無法產(chǎn)生功能性的lacZ蛋白，也就無法形成雜合的半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。第21頁，共84頁。穿梭質(zhì)粒:人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點和選擇記號，可在兩種不同的寄主細(xì)胞

11、中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。第22頁，共84頁。二、噬菌體噬菌體可以進(jìn)入裂解循環(huán)，20分鐘后就可使宿主細(xì)胞發(fā)生裂解，同時釋放出大約100個噬菌體顆粒。噬菌體也可以進(jìn)入溶源循環(huán)，即注入的DNA整合到大腸桿菌的染色體中，以前噬菌體的形式潛伏起來，永久保留；但在某種營養(yǎng)條件或是環(huán)境脅迫條件下，整合的噬菌體DNA可以切割出來進(jìn)入溶源循環(huán)。第23頁，共84頁。第24頁，共84頁。噬菌體DNA大約長50kb，其中大約20kb對于整合切割過程極為關(guān)鍵，稱為整合切割（I/E）區(qū)域。 對于構(gòu)建文庫，可將這20kbDNA片段去掉，強迫重組的噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。整合切割區(qū)域尾部基因頭部基因粘性末端粘性末端負(fù)責(zé)DNA復(fù)制

12、的基因細(xì)胞裂解基因噬菌體的DNA示意圖左臂右臂第25頁，共84頁。噬菌體頭的大小足以裝下50kb單元的線性DNA， DNA52kb,則無法包裝進(jìn)頭部。cos位點（cos site）就是保證在超長線性DNA分子上每兩個cos位點之間為50kb,使DNA分子能正確的裝配進(jìn)噬菌體。 在頭的入口處有一種酶，它能識別雙鏈線性DNA分子上的cos序列，并在cos序列處切斷DNA分子，使適當(dāng)大小的DNA進(jìn)入噬菌體的頭部。第26頁，共84頁。噬菌體DNA分子示意圖第27頁，共84頁。第28頁，共84頁。三、柯斯質(zhì)粒（cosmid）可攜帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載

13、體二者的優(yōu)勢?？滤官|(zhì)粒上帶有多個單克隆位點、兩個cos位點、DNA復(fù)制起始位點和抗生素抗性基因，在兩個cos位點之間含有一個限制性內(nèi)切酶位點（RE）。第29頁，共84頁。四、YAC載體目前能容納最大外源DNA片段的載體是YAC（酵母人工染色體，yeast artificial chromosome）。真核生物染色體三個關(guān)鍵部分：著絲粒（centromere,CEN）,它主管染色體在細(xì)胞分裂過程中正確的分配到各子細(xì)胞中；端粒（telomere,TEL）, 位于染色體的末端，對染色體末端的復(fù)制以及防止染色體被核酸外切酶切斷具有重要的意義；自主復(fù)制序列（autonomously replicatin

14、g sequence,ARS）,即在染色體上的多處DNA復(fù)制起始位點。第30頁，共84頁。作為真核基因表達(dá)載體應(yīng)具備如下條件：含有原核基因的復(fù)制起始序列（如ColE1起始序列ori）篩選標(biāo)記；含有真核基因的復(fù)制起始序列（如SV40病毒的復(fù)制序列、酵母的2質(zhì)粒的復(fù)制起始序列ARS、以及真核細(xì)胞篩選標(biāo)記（如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母細(xì)胞中與自養(yǎng)有關(guān)的基因）；含有有效地啟動子序列（可包含增強子序列等各種順式作用元件）；RNA聚合酶所需的轉(zhuǎn)錄終止和poly(A)加入的信號序列；合適的供外源基因插入的限制性內(nèi)切酶位點。第31頁，共84頁。第32頁，共84頁。應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體進(jìn)行基因克隆的一般程序第

15、33頁，共84頁。利用柯斯質(zhì)?？寺〈笃蜠NA第34頁，共84頁。pYAC4結(jié)構(gòu)圖第35頁，共84頁。YAC的構(gòu)建示意圖第36頁，共84頁。第三節(jié) 重組基因的導(dǎo)入和篩選氯化鈣法電穿孔： 將宿主細(xì)胞置于一個高強電場中，通過電場脈沖在細(xì)胞壁上打孔，DNA分子隨即進(jìn)入細(xì)胞。聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法： 常用于轉(zhuǎn)化酵母以及其他真菌細(xì)胞活躍生長的細(xì)胞或菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶處理變成球形后，在適當(dāng)濃度的聚乙二醇6000（PEG-6000）的介導(dǎo)下將外源DNA轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞中。第37頁，共84頁。磷酸鈣或DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染： 將外源基因?qū)氩溉轭惣?xì)胞中瞬時表達(dá)的常規(guī)方法。 磷酸鈣和DNA共沉淀：將被

16、轉(zhuǎn)染的DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞。 DEAE葡聚糖作用：可能是其與DNA結(jié)合從而抑制核酸酶的作用或與細(xì)胞結(jié)合從而促進(jìn)DNA的內(nèi)吞作用。第38頁，共84頁。原生質(zhì)體融合： 通過帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞直接融合。脂質(zhì)體法： 將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合將基因?qū)?。?xì)胞核的顯微注射法： 即將目的基因重組體通過顯微注射裝置直接注入細(xì)胞核中。 第39頁，共84頁?；蛑亟M的方法：根據(jù)外源DNA片段末端的性質(zhì)同載體上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c相連實現(xiàn)基因的體外重組。當(dāng)在載體的以及外源DNA片段兩端的限制酶切位點之間，不可

17、能找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r，可采用下述方法解決： 在線狀質(zhì)粒的末端或外源DNA片段的末端用DNA連接酶接上接頭或銜接頭，這種接頭可以是含單一的或多個限制性酶切位點，然后通過適當(dāng)?shù)南拗泼附夂筮M(jìn)行重組。第40頁，共84頁。使用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段部分補平3凹端。3凹端轉(zhuǎn)變成粘端。使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3凹端完全補平或用S1核酸酶、綠豆核酸酶、Klenow酶、T4DNA聚合酶去除3突出端產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA分子相連。可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體酶切位點處和外源DNA片段的3端加上相互補的同聚尾同聚物加尾法，常用于雙鏈cDNA的分子克隆。第41頁，

18、共84頁。Pst1質(zhì)粒pGCTGCAACGTCGpCTGCAGGGGGGpGGpGGGGGGACGTCAAAAAAAmRNAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAACCCCCCTTTTTTTCCCCCC用末端轉(zhuǎn)移酶加（dG）殘基用末端轉(zhuǎn)移酶加（dC）殘基以oligo(dT)作引物合成cDNA第一鏈合成cDNA第二鏈退火第42頁，共84頁。CTGCAGGGGGAAAAAAACCCCCC G G CCCCCCTTTTTTTGGGGGGACGTC轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌菌株選擇抗生素抗性轉(zhuǎn)化過程中，DNA上的缺口為宿主酶所修復(fù)，從而在cDNA兩端恢復(fù)Pst1位點Pst1Pst

19、1cDNA第43頁，共84頁。多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）為基因定向重組和構(gòu)建外源基因高效表達(dá)治理提供了一個通用方法。 根據(jù)載體上的克隆位點設(shè)計PCR引物，使引物上帶有與載體克隆位點相匹配的限制性內(nèi)切酶識別序列。第44頁，共84頁。篩選1、重組質(zhì)粒的快速鑒定：根據(jù)有外源基因插入的重組質(zhì)粒同載體DNA之間大小的差異區(qū)分。2、重組質(zhì)粒的限制酶解分析。3、通過互補使菌落產(chǎn)生的顏色反應(yīng)來篩選重組體。4、外源DNA片段插入失活。如果載體帶有兩個或多個抗生素抗性基因并在其上分布適宜的可供外源DNA插入的限制性內(nèi)切酶位點時，當(dāng)外源DNA片段插入到一個抗性基因中去時可導(dǎo)致此抗性基因失活。第45頁，共84頁。5、分子

20、雜交篩選法：原位雜交點雜交和southern雜交5353變性、轉(zhuǎn)膜5335加入經(jīng)標(biāo)記、變性的探針進(jìn)行分子雜交53353355* * * * *含有雜交信號的DNA分子第46頁，共84頁。6、表達(dá)文庫的免疫學(xué)篩選：絕大多數(shù)構(gòu)建噬菌體的cDNA文庫選用gt11、ZAP或ORF8作為表達(dá)載體。這些噬菌體帶有一拷貝的大腸桿菌LacZ基因，克隆位點位于翻譯終止密碼子上游53bp處。cDNA插入方向和閱讀框正確時，可以表達(dá)氨基端為半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列將暴露出可用特異抗體檢測的抗原表位。第47頁，共84頁。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落轉(zhuǎn)膜菌落的蛋白質(zhì)裸露出來一抗與裸露的蛋白質(zhì)結(jié)

21、合二抗與一抗結(jié)合顯色找出陽性克隆裂解加一抗洗去游離的一抗，加二抗洗去游離的二抗，加顯色劑第48頁，共84頁。7、利用PCR方法來確定基因的重組體?？寺CR產(chǎn)物；通用引物：pUC/M13 primer第49頁，共84頁。8、DNA的序列分析： 這是最后確定分離的基因是否具有與天然基因相同序列的唯一方法，也是最確定的方法。 第50頁，共84頁。第四節(jié) 獲得真核生物目的基因的方法一、cDNA的方法分離表達(dá)目的基因的組織或細(xì)胞：所用材料要盡量新鮮mRNA的分離第一鏈cDNA鏈的合成第二條cDNA鏈的合成cDNA的甲基化和接頭的加入雙鏈cDNA與載體相連：插入片段：載體1：13：1基因文庫的建立 第5

22、1頁，共84頁。mRNA的分離 poly(A)尾巴可以用來把mRNA同rRNA和tRNA分離開來： 1、先提取真核細(xì)胞的總RNA； 2、把總RNA通過一個用纖維素填充的柱子； 在纖維素上結(jié)合有許多長度大約為15個核苷酸的短鏈寡聚dToligo(dT)或dT15，真核基因mRNA分子的poly(A)尾巴通過堿基配對作用與oligo(dT)結(jié)合，而其它的RNA成分因為沒有poly(A)尾巴而不能結(jié)合 3、真核生物mRNA可以用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫下來。第52頁，共84頁。第一鏈cDNA鏈的合成mRNA純化以后，樣品中加入短的oligo(dT)或隨機引物分子作為引物，同時加入逆轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液

23、和4種脫氧核糖核苷三磷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。 優(yōu)點：可以最大限度的減少poly(A)模板合成 cDNA的可能性； 缺點：cDNA合成總是從mRNA3端開始，在最后 的cDNA文庫中，代表mRNA3區(qū)域的組分所占的比例會高，而且對于一些較長的mRNA分子來說，由于反轉(zhuǎn)錄酶在cDNA合成過程中易從mRNA分子上脫開，從而造成第一條鏈合成不完整。oligo(dT)作為引物第53頁，共84頁。 優(yōu)點：合成的cDNA文庫可能更好地代表最初RNA模板 所代表的組份； 缺點：由于cDNA在RNA鏈上的合成是隨機的，易產(chǎn)生較大量的非全長的RNA模板轉(zhuǎn)錄物，從而影響到全長的cDNA分子的

24、獲得率。因此用總體RNA和oligo(dT)引物是最有效的組合。用逆轉(zhuǎn)錄酶在體外合成的DNA鏈往往不完整，但有一個特點：在合成停止前，DNA鏈會自己折轉(zhuǎn)回來幾個核苷酸形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)。隨機引物第54頁，共84頁。第二條cDNA鏈的合成自身引導(dǎo)法：利用經(jīng)一條鏈上的3端序列的折回或發(fā)卡自引導(dǎo)法來合成效率低，目前已不多用。cDNA第二條鏈的置換合成法：作為第一條鏈合成反應(yīng)產(chǎn)物的cDNA：mRNA雜交分子充當(dāng)切口平移的模板。RNaseH在雜交分子上的mRNA鏈上造成切口，產(chǎn)生一系列的RNA引物，它們被E.coli的DNA聚合酶I用以合成第二鏈效率高，直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，無須進(jìn)一步處理和純化；省去S

25、1酶的處理，改善了cDNA的質(zhì)量，使產(chǎn)生全長的cDNA的機率大大提高。引物銜接頭法合成雙鏈cDNA：通過將cDNA兩端加上限制性內(nèi)切酶位點，使其較方便的克隆入相應(yīng)的載體。第55頁，共84頁。自身引導(dǎo)法第56頁，共84頁。反轉(zhuǎn)錄酶RNaseH（部分降解）DNA聚合酶DNA聚合酶DNA連接酶RNA55cDNA第一鏈33RNA55555555cDNA第一鏈3cDNA第二鏈置換合成法第57頁，共84頁?；蛭膸斓慕⒒蛭膸欤褐笇⒒蚪MDNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后（必要時對這些DNA片段進(jìn)行密度梯度離心或經(jīng)制備型凝膠電泳進(jìn)行分級分離，以選擇長度適合于插入載體的片段）所產(chǎn)生的基因組DNA片段隨機地同

26、相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組DNA的所有序列。第58頁，共84頁。二、DNA的化學(xué)合成1、基因片段的全化學(xué)合成特點：首先合成組成一個基因的所有片段，相鄰的片段間有46堿基的重疊互補，在適當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)退火后，用T4DNA連接酶將各片段以磷酸二酯鍵的共價鍵形式連接成一個完整的基因。化學(xué)合成的DNA片段純化后其5和3端都為羥基，在組建基因前要將DNA片段的5端磷酸化（處于基因5端的兩個寡核苷酸片段不進(jìn)行磷酸化，以防止基因本身在DNA重組時自身環(huán)化）。第59頁，共84頁?；虻幕瘜W(xué)合成及克隆圖解535353退火DNA連接酶退火DNA連接酶退火DNA連接酶退火T4DNA連接酶Eco

27、RBamH合成的DNA全基因AmpTetEcoRBamH合成的基因轉(zhuǎn)化EcoRBamHAmpr TettAmpEcoRBamHAmpr Tett合成的基因第60頁，共84頁。2、基因的化學(xué)酶促合成特點：不需要合成組成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片斷，相鄰的3末端有一短的序列互補，在適當(dāng)?shù)臈l件下通過退火形成模板引物的復(fù)合體，然后在存在四種dNTP的條件下，用E.coli的DNA聚合酶大片段（klenow大片段）去填補互補片段之間的缺口，最后用T4DNA連接酶連接及適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割后重組入載體。第61頁，共84頁?；虻幕瘜W(xué)酶促合成圖解磷酸化退火DNA多聚酶Iklenow片段

28、dNTP限制性內(nèi)切酶分子克隆5555第62頁，共84頁。三、利用PCR或RT-PCR分離基因1、反應(yīng)體系具備的條件：要有與被分離的目的基因5和3端序列互補的DNA引物（約20個堿基左右）；具有熱穩(wěn)定性的酶，如Taq DNA聚合酶；dNTP；作為模板的DNA分子。 第63頁，共84頁。2、過程：變性：模板DNA置于95的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開變成單鏈；退火：將反應(yīng)體系的溫度降至55左右，使得一對引物能分別與變性后的兩條模板鏈相配對；延伸：將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到Taq DNA聚合酶作用的最適溫度72，然后以目的基因為模板，合成新的DNA鏈。第64頁，共84頁。3、引物設(shè)計原則：3末端序列不能

29、有明顯的互補性易造成引物間二聚體，導(dǎo)致非特異DNA片段的合成；避免引物分子內(nèi)序列互補導(dǎo)致引物分子內(nèi)雙鏈區(qū)或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，引物3端形成的發(fā)夾環(huán)會引起引物內(nèi)延伸，而發(fā)生在近5端對PCR的影響不大；注意熔點溫度。注意引物內(nèi)穩(wěn)定性：5末端穩(wěn)定而其3末端不穩(wěn)定的引物是進(jìn)行PCR合成的好引物。當(dāng)利用哺乳動物類基因組序列作為PCR模板時，對所用的引物要檢查其同Alu序列或其它短的重復(fù)序列的互補性。第65頁，共84頁。逆轉(zhuǎn)錄PCR（retrotranscription PCR,RT-PCR）:以RNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得與RNA互補的DNA鏈即cDNA,然后以cDNA鏈為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)。帽子AAAA

30、A mRNA35TTTTT以其為模板進(jìn)行PCR擴增逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA互補鏈并退火寡聚dT引物第66頁，共84頁。是檢測RNA分子的良好方法，也是獲取測序用模板DNA的有效手段，同時還是克隆mRNA之cDNA的重要步驟。RT-PCR具有很高的敏感性,可以用來分析不同組織或是相同組織不同發(fā)育階段中mRNA表達(dá)狀況的相關(guān)性；可以用來研究低表達(dá)活性基因的mRNA生理變化動態(tài)。 第67頁，共84頁。判斷 根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳中樣品條帶的強度比較，便能確定兩種PCR反應(yīng)產(chǎn)物之間的數(shù)量關(guān)系。前提條件 所測定的mRNA分子必須來自由一個或數(shù)個間隔子的基因。第68頁，共84頁。錨定PCR：特別適合預(yù)擴增那些只知道

31、一段序列的目的DNA。對于一端序列已知，一端序列未知的DNA片段，可以通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶給未知序列的那一端加上一段多聚dG的尾巴，然后用多聚dC和已知序列作為引物進(jìn)行PCR擴增。第69頁，共84頁。53DNA序列GGGGG 353GGGGG5GGGGG 353GGGGG5錨定引物CCCCC（多聚dC引物）進(jìn)行PCR擴增5GGGGG 3CCCCC加多聚dG尾巴加入引物已知序列擴出的未知序列第70頁，共84頁。反向PCR特別適合用于擴增已知序列兩端的未知序列方法：選擇一個在已知序列中沒有，而在其兩側(cè)都存在的限制性內(nèi)切酶位點，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶解后，將酶切的片段在連接酶的作用下環(huán)化，使得已知序

32、列位于環(huán)狀分子上，根據(jù)已知序列的兩端序列設(shè)計兩個引物，以環(huán)狀分子為模板進(jìn)行PCR，就可以擴增出已知序列兩側(cè)的未知序列。第71頁，共84頁。53LR酶切位點酶切位點LRLRLR53已知序列限制性內(nèi)切酶酶解環(huán)化變性并加入根據(jù)已知序列合成的引物PCR擴增第72頁，共84頁。四、SSH與mRNADD 差減雜交是利用目的基因在兩種組織或細(xì)胞中表達(dá)的差異，其mRNA或單鏈cDNA進(jìn)行液相雜交，除去兩者之間相同的基因成分取得。 抑制消減雜交法(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)是抑制PCR和消減雜交法為基礎(chǔ)，在一輪反應(yīng)中實現(xiàn)mRNA的均等化和消減步驟，從而有

33、效鑒別兩個不同細(xì)胞群差異表達(dá)基因。第73頁，共84頁。mRNA差異性顯示(differential display,DD)，又稱差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR），是判斷特定條件下基因差異性表達(dá)的常用方法。所有真核生物成熟的mRNA3，端均有poly(A)結(jié)構(gòu)，而且其3端與poly(A)相鄰的12組堿基組合，設(shè)計的引物的12組針對mRNA與poly(A)相鄰的12組堿基的配對堿基稱為錨定堿基：mRNA 3GG GC GT GA CC CG CA CT TT TG TC TA錨定堿基5CC CG CA CT GG GC GT GA AA AC AG AT第74頁，共84頁。它通過利用錨定引物5-d(T)11MN-3 (M=A,G,C;N=A,G,C,T),從mRNA的poly(A)處反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。然后利用10bp的任意引物在不嚴(yán)格的溫度條件下（38-42）與cDNA模板復(fù)性2分