豬繁殖與呼吸綜合征乳膠凝集試驗（LAT）

1、豬繁殖與呼吸綜合征乳膠凝集試驗（LAT）診斷試劑盒使用說明書豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是近年來發(fā)現(xiàn)一種新的病毒病。該病引起妊娠母豬發(fā)熱、厭食和流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙；引起仔豬發(fā)熱、呼吸困難、腹瀉、消瘦及高死亡率；病豬在耳、腹側(cè)和陰部皮膚出現(xiàn)藍紫色斑塊；少數(shù)豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。本病給養(yǎng)豬業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失。豬繁殖與呼吸綜合征乳膠凝集試驗是將疫苗弱毒株致敏乳膠，研制成為抗原，檢測豬血清中PRRS抗體達到診斷的目的，具有簡便、特異、敏感的優(yōu)點。1試劑盒的內(nèi)容： 包括豬繁殖與呼吸綜合征致敏乳膠抗原、陽性血清、陰性血清、稀釋液、玻片、吸頭及使用說明書。2用途： 用于豬繁殖與呼吸綜合征血清

2、學診斷。3使用方法：1 定性試驗： 取待檢樣品（血清）、陽性血清、陰性血清、稀釋液各一滴，分置于玻片上，各加乳膠抗原一滴，用牙簽混勻，攪拌并搖動1-2分鐘，于3-5分鐘內(nèi)觀察結(jié)果。2 定量試驗： 先將血清作邊續(xù)稀釋，各取1滴依次滴加于乳膠凝集反應板上，另設對照同上，隨后再各加乳膠抗原一滴，如上攪拌并搖動，判定。結(jié)果判定：1 對照試驗： 出現(xiàn)如下結(jié)果試驗方可成立，否則應重試：陽性血清加抗原呈“+”；陰性血清加抗原呈“”；抗原加稀釋液呈“”。42 判定標準： “+”全部乳膠凝聚，顆粒聚于液滴邊緣，液體完全透明； “+” 大部分乳膠凝集，顆粒明顯，液體稍混濁； “+” 約50%乳膠凝集，但顆粒較細，

3、液體較混濁； “+” 有少許凝集，液體呈混濁； “” 液滴呈原有的均勻乳狀。 以出現(xiàn)“+”以上凝集為陽性凝集。貯藏： 在2-8冷暗處保存，暫定1年。附注： 被檢樣品采集及處理方法。61血清：按常規(guī)方法采血及分離血清，要求無腐敗無嚴重溶血。62使用前應輕輕搖勻乳膠抗原。（吳 斌）豬繁殖呼吸障礙綜合癥（PRRS）ELISA試劑盒（IDEXX公司）使用說明書試劑儲存于2-7，只用于獸醫(yī) 裝量豬繁殖呼吸障礙綜合癥病毒抗原/正常宿主細胞抗原 5塊 PRRSV/NHC包被板B 抗豬辣根過氧化物酶連結(jié)構(gòu)用慶大霉素作為保護劑 60mlC 樣品稀釋液 150ml含蛋白穩(wěn)定劑的磷酸鹽緩沖液，用NaN3作為防腐劑D

4、 TMB（底物）稀釋液 40ml 磷酸鹽檸檬酸緩沖液，用慶大霉素作為保護劑E TMB濃縮液 40ml 用慶大霉素作為保護劑F PRRS陽性對照（血清） 4ml 溶解在磷酸鹽緩沖液內(nèi)的豬抗PRRSV抗體，含蛋白穩(wěn)定劑以NaN3作為防腐劑G 洗滌液 200ml10倍含吐溫磷酸鹽緩沖液，用慶大霉素作為保護劑H 豬陰性血清對照 4ml與PRRSV不反應的豬血清終止劑 60ml含氫氟酸，用時小心樣品的準備 用樣品稀釋液以1 ：40稀釋待檢樣品（如10ul樣品加390ul樣品稀釋液）注意：陰性對照陽性對照不用稀釋。 每個樣品吸取一定要換吸咀并記錄每個樣品在板上的位置。樣品在加到ELISA板孔之前應混合均勻

5、。PRRSVNHCPRRSVNHCPRRSVNHCA陽性孔陽性孔553737B陽性孔陽性孔663838C陰性孔陰性孔773939D陰性孔陰性孔884040E11994141F2210104242G3311114343H4412124444 1 2 3 4 11 12注：P：加陽性對照；N：加陰性對照；1、2、3：加待檢樣品1、3、5、7、9、11列已用PRRSV包被；2、4、6、8、10、12列已用正常宿主細胞抗原包被。TMB底物溶液的配制 在應用之前，TMB溶液必須加到TMB稀釋液內(nèi)，（如每55mlTMB溶液加TMB稀釋液55ml），TMB底物溶液應儲存在室溫并在稀釋后1小時內(nèi)使用。TMB稀

6、釋液在使用時不要弄到金屬表面。洗滌液的配制洗滌液（濃）應儲存室溫下并搖勻確保已沉淀的鹽溶解；使用前洗滌液用蒸鎦水或去離子水以1 ：10稀釋，（如每30ul洗滌液加270ul蒸鎦水或去離子水，可用于1塊板）試驗程序 在試驗前所有試劑必須放在室溫，且各種試劑應輕輕搖動或渦旋。 1拿出抗原包被板并記錄樣品在板上的位置。 2加100ul不稀釋的陰性血清對照到酶標板上的C1、C2、D1、D2孔內(nèi)（共4孔）。 3加100ul不稀釋的陽性血清對照到酶標板上的A1、A2、B1、B2孔內(nèi)（共4孔）。 4加100ul按1 ：40稀釋的血清（待檢）到酶標板的PRRSV和NHC孔內(nèi)，每個樣品只用2孔即PRRSV和NH

7、C各1孔。 5置室溫作用30分鐘。 6棄去孔內(nèi)液體到廢液缸內(nèi)。 7每孔約用300ul的洗滌液（稀釋后）洗滌3-5次。洗滌后棄去孔內(nèi)液體。在板洗滌后加酶標抗體之前應避免酶標板干燥。在最后1次的洗滌棄去后，在吸水紙上輕輕拍酶標板。 8每孔加100ul酶標抗體（稀釋后）。 9在室溫作用30分鐘，此時TMB底物溶液應配制好。 10重復步驟6和7。 11每孔加入TMB底物溶液100ul。 12室溫作用15分鐘。 13每孔加入終止液100ul以終止反應。 14在650nm處測量并記錄樣品與對照的吸光值（OD值）。 15計算結(jié)果。結(jié)果 為了確保試驗成立以下條件必須滿足： 與PRRSV反應的陽性對照平均OD值

8、減NHC與陽性對照反應的平均OD值之差必須大于或等于0150，通過計算樣品與陽性對照的比率（S/P）來確定對PRRSV的抗體的有無。結(jié)果的解釋 每一樣品內(nèi)PRRSV抗體的出現(xiàn)與否由樣品與陽性對照的比率來確定。 1假如S/P是小于04，樣品確定為PRRSV陰性。 2假如S/P是等于或大于04，樣品確定為PRRSV陽性。計算 1陰性對照平均值（NC：PRRS）的計算：PRRSV抗原（孔C1、D1） C1（A650）+D1（A650） 011+013NC：PRRS= 如： =0122 2陽性對照平均值（PC：PRRS），PC（NHC）的計算PRRSV抗原（孔A1、B1） A1（A650）+B1（A650） 0360+0384PC：PRRS= 如： =0372 2NHC（孔A2、B2） A2（A650）+B2（A650） 006+007PC：NHC= 如： =00652樣品（S）對陽性（P）的比率計算