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文檔簡介

1、._PAGE :.;本指南由中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心艾滋病參比實驗室組織有關(guān)專家撰寫,由中國疾病預(yù)防控制中心同意執(zhí)行。編寫主持人:蔣巖編寫人員: 潘品良 蔣巖 李敬云 鐘平 尚紅 李太生審核咨詢專家及技術(shù)人員:邵一鳴 康來儀 朱效科 王佑春 汪寧 朱紅 郭志宏 季陽 劉海林 肖瑤 邱茂鋒 馬春濤編寫單位:中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心 參編單位:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海市疾病預(yù)防控制中心中國醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院技術(shù)顧問:Mike Ussery, Hao Zhang美國國立衛(wèi)生研討院 過敏及傳染病研討所James W. Bremer美國Rush 大學(xué)醫(yī)學(xué)中心

2、VQA實驗室Trever Peter克林頓基金中國艾滋病防治工程實驗室專家Donald J. Brambilla美國華盛頓大學(xué)新英格蘭研討所Francis F. Mandy加拿大公共衛(wèi)生局疾病預(yù)防控制中心國家免疫學(xué)實驗室前 言隨著HIV-病毒載量檢測在艾滋病臨床輔助診斷和抗病毒治療監(jiān)測以及艾滋病科研任務(wù)中的廣泛運用,我國開展該項檢測任務(wù)的實驗室日益增多。自年艾滋病實驗室初次引進HIV-病毒載量檢測技術(shù),截至年底,全國曾經(jīng)配備了近臺HIV-病毒載量檢測儀,覆蓋了疾控、醫(yī)院、檢疫、軍隊等系統(tǒng)。目前,雖然許多實驗室曾經(jīng)將病毒載量檢測納入艾滋病相關(guān)輔助診斷和治療監(jiān)測任務(wù),但大多數(shù)實驗室開展任務(wù)的時間較

3、短,閱歷缺乏,因此,急需加強該領(lǐng)域的培訓(xùn)和質(zhì)量控制任務(wù),以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。為了加強質(zhì)控和保證檢測質(zhì)量,并得到國際上的認(rèn)可,艾滋病參比實驗室年開場參與美國NIH組織的HIV-病毒載量檢測才干驗證任務(wù)。在經(jīng)過考核和積累閱歷的根底上,年啟動了國內(nèi)HIV-病毒載量檢測才干驗證任務(wù)。在積極組織實驗室才干驗證的同時,艾滋病參比實驗室也對實驗室技術(shù)人員進展培訓(xùn),積極開展室內(nèi)質(zhì)控。這些任務(wù)對提高HIV-病毒載量的檢測技術(shù),保證質(zhì)量起到了重要作用。為了進一步規(guī)范艾滋病實驗室HIV-病毒載量檢測,建立規(guī)范化質(zhì)量控制程序,準(zhǔn)確開展各項檢測及質(zhì)量控制任務(wù),特制定本指南。本指南是根據(jù)各種HIV-病毒載量檢

4、測方法的技術(shù)要求,結(jié)合現(xiàn)行的國內(nèi)外相關(guān)技術(shù)規(guī)范而制定。本指南針對HIV-病毒載量檢測的實驗室設(shè)置、樣品管理、檢測技術(shù)、質(zhì)量控制、生物平安等方面提出指點。本指南自年初正式開場編寫,性病艾滋病預(yù)防控制中心多次組織了有國內(nèi)外專家參與的指南編寫專項技術(shù)咨詢會,與會專家對指南提出了很多建立性意見和建議,美國NIH病毒載量檢測質(zhì)量保證明驗室專家多次對指南進展仔細的審閱和詳細指點。指南編寫過程中,也仔細聽取了實驗室一線檢測人員的詳細需求和建議,并補充了大量的實驗數(shù)據(jù),包括HIV-病毒載量檢測值的穩(wěn)定性、凍融影響實驗與不同檢測方法之間比較的實驗數(shù)據(jù)等。在此根底上,經(jīng)過多次修訂、補充和審定,于年月完成的最后定稿

5、。由于國內(nèi)外還沒有可作為參考的HIV-病毒載量檢測及質(zhì)量控制的相關(guān)指南,因此本指南主要提出一些原那么上的參考建議,其中定有不妥之處,希望寬廣同仁提出意見,以便不斷完善。致 謝在本指南的編寫過程中,世界衛(wèi)生組織、克林頓基金中國艾滋病防治工程和美國NIH等國際組織與機構(gòu)給予了大力支持,全國HIV-病毒載量檢測實驗室一線操作人員提出了許多建立性的意見和詳細需求,艾滋病參比實驗室任務(wù)人員毛瑋、陶曉霞進展了大量的補充實驗和文字編輯任務(wù),才保證本指南的編寫順利完成,在此一并向他們表示真誠的贊賞。中國疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心主任吳尊友研討員在本指南編寫過程中提出了重要的修正意見,在此特別致謝。

6、HIV-病毒載量檢測及質(zhì)量保證指南版目錄總那么實驗室設(shè)置樣品的采集、處置、保管、運輸常用HIV-病毒載量檢測方法簡介室內(nèi)質(zhì)量控制外部質(zhì)量控制實驗室生物平安附表 常見問題分析和處置附表 HIV-病毒載量檢測樣品送檢及接納單附表 HIV-病毒載量檢測才干驗證樣品接納公用單附表 HIV-病毒載量檢測報告單附表 HIV-病毒載量才干驗證結(jié)果公用報告單NASBA)附表 HIV-病毒載量才干驗證結(jié)果公用報告單RT-PCR)參考文獻縮略語第一章 總 那么.意義 HIV-病毒載量是艾滋病防治任務(wù)中一項重要的實驗室檢測目的。檢測HIV-病毒載量可以監(jiān)控和預(yù)測病程,指點艾滋病患者的抗病毒治療,包括確定治療時機、選

7、擇治療方案、評價治療效果;結(jié)合疾病臨床病癥和其它實驗?zāi)康?,可作為早期感染診斷的輔助手段;還可用于嬰兒早期感染的輔助診斷以及采供血機構(gòu)樣品的窗口期檢測。為了準(zhǔn)確地檢測HIV-病毒載量,必需對開展HIV-病毒載量檢測的實驗室進展規(guī)范化管理和質(zhì)量控制,才干保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。.目的 指點HIV-病毒載量檢測任務(wù),規(guī)范實驗室質(zhì)量控制與管理。.適用范圍 適用于我國開展HIV-病毒載量檢測任務(wù)的一切實驗室。第二章 實驗室設(shè)置各種HIV-病毒載量檢測方法需求相應(yīng)的輔助設(shè)備才干完成檢測。以下為HIV-病毒載量檢測實驗室不同分區(qū)內(nèi)必備的輔助設(shè)備及耗材。.樣品處置區(qū):.生物平安柜:二級.離心機g,可離心

8、.mL 管子.冰箱:,-,-.水浴箱:準(zhǔn)確度小于.加樣器套L、L、L,為公用設(shè)備.有濾芯的一次性吸頭無DNA和RNA酶.計時器.旋渦振蕩器:震動頻率可調(diào). 一次性任務(wù)服、帽、口罩、無粉手套、鞋套.試劑預(yù)備區(qū):.超凈任務(wù)臺或密閉任務(wù)臺.加樣器套L、L、L,為公用設(shè)備.離心機g,可離心.mL 管子.冰箱:,-. 計時器.旋渦振蕩器,震動頻率可調(diào).有濾芯的一次性吸頭無DNA、RNA酶. .mL 管子無DNA和RNA酶和.mL 試管架.一次性任務(wù)服、帽、口罩、無粉手套、鞋套.擴增產(chǎn)物分析區(qū):. HIV-病毒載量檢測儀.加樣器套L、L、L.冰箱:,-.水浴箱 ( ).旋渦振蕩器:震動頻率可調(diào).有濾芯的一

9、次性吸頭無DNA、RNA酶.一次性任務(wù)服、帽、口罩、無粉手套、鞋套. HIV-病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布表示圖HIV-病毒載量檢測實驗室設(shè)備分布表示圖病毒載量儀,加樣器離心機冰箱-,水浴箱洗手池紫外燈擴增產(chǎn)物分析區(qū)生物平安柜加樣器離心機冰箱-,-冰箱水浴箱洗手池紫外燈樣品處置區(qū)超凈任務(wù)臺加樣器漩渦振蕩器冰箱-,實驗臺紫外燈試劑預(yù)備區(qū).總體原那么:各區(qū)獨立、控制風(fēng)向、因地制宜、方便任務(wù)。詳細來說: .各區(qū)必需是相互獨立的,有條件各區(qū)內(nèi)可分別設(shè)置緩沖間,以保證不同區(qū)之間一直完全分隔開。.各區(qū)的儀器設(shè)備以及各種物品必需是公用的。. 試劑預(yù)備區(qū)和樣品處置區(qū)可堅持低度正壓或常壓形狀,使空氣流向一直由室內(nèi)

10、向外,以防止擴增污染物進入此區(qū)域。. 擴增產(chǎn)物分析區(qū)可堅持低度負(fù)壓形狀,使空氣流向一直由室外向內(nèi),以防止擴增產(chǎn)物呵斥其他區(qū)域的交叉污染??砂惭b排風(fēng)扇或其他排風(fēng)安裝。.擴增產(chǎn)物分析區(qū)可以設(shè)在遠離其他各區(qū)的地方。.任務(wù)時必需遵照單一任務(wù)流向進展,即任務(wù)流向只能從試劑預(yù)備區(qū)開場,到樣品處置區(qū),然后再到擴增產(chǎn)物分析區(qū)。第三章 樣品的采集、處置、保管和運輸 樣品采集、處置、保管和運輸,按照所運用檢測方法的要求嚴(yán)厲執(zhí)行。用于HIV-病毒載量檢測的樣品引薦采用抗凝血漿。. 樣品的采集采樣器材:一次性抗凝真空采血管、持針器、蝶形針等??鼓齽?通常采用EDTA乙二胺四乙酸或ACD枸櫞酸鈉 ,并符合不同檢測方法

11、對樣品的要求。樣品標(biāo)識:在采血管上貼對應(yīng)的樣品編號,并填寫HIV-病毒載量檢測樣品送檢及接納單附表。樣品采集量:通常采集全血ml, 采集的樣品量應(yīng)盡能夠與定量采血管的刻度一致,采集量過多或缺乏,會呵斥血液凝固或被稀釋。樣品的混勻:采集血液后,立刻悄然上下顛倒抗凝管約次,使血液與抗凝劑充分混勻。獲取其它信息:包括采集對象的根本信息和流行病學(xué)資料,抗病毒藥物運用情況,以往的實驗室檢測結(jié)果,在HIV-病毒載量檢測樣品送檢及接納單附表上備注欄注明。. 樣品的處置. 普通要求在采血后小時內(nèi)進展離心,室溫下-xg離心分鐘。. 分別后,吸出血漿,分裝到無菌的聚丙烯螺口凍存管中,并注明分裝時間。在凍存管上貼樣

12、品編號。. 血漿樣品不能滅活。. 做好樣品處置記錄。. 樣品的保管.保管條件:根據(jù)血漿檢測時間而定,天內(nèi)可在暫時保管,個月以內(nèi)應(yīng)凍存于-以下,個月以上應(yīng)置于-以下。不引薦運用自動除霜冰箱。.血漿樣品凍融不應(yīng)超越次。.監(jiān)控并記錄保管溫度以及樣品形狀的變化。.防止樣品蛻變、走漏及污染。. 樣品的運輸根據(jù)的要求運輸,并嚴(yán)厲控制運輸?shù)睦鋬鲂螤?,防止樣品凍融? 樣品的發(fā)送和接納.發(fā)送樣品時必需填寫樣品HIV-病毒載量檢測樣品送檢及接納單附表。.接納樣品時,核對樣品數(shù)量,檢查樣品情況,按HIV-病毒載量檢測樣品送檢及接納單附表核對。. 樣品管破損呵斥樣品溢出、出現(xiàn)明顯溶血、凝血的樣品,不宜作HIV-病毒

13、載量檢測;假設(shè)樣品曾經(jīng)融化, 保管并盡快檢測,記錄凍融一次。第四章 常用HIV-病毒載量檢測方法簡介目前常用的HIV RNA測定方法為核酸序列依賴性擴增(NASBA) 技術(shù),代表產(chǎn)品為NucliSens ECL 及其晉級產(chǎn)品熒光實時PCR技術(shù)NucliSens EasyQ儀;逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)RT-PCR技術(shù),代表產(chǎn)品為AMPLICOR HIV- MONITOR assay;分枝DNA信號放大系統(tǒng)bDNA技術(shù),代表產(chǎn)品為bDNA 分析儀;實時熒光定量PCR擴增技術(shù)real-time PCR,M與國產(chǎn)試劑盒均屬此類技術(shù)。 核酸序列依賴性擴增(NASBA)技術(shù)最早產(chǎn)品為NucliSens ECL定量

14、RNA測定方法,最近被NucliSens EasyQ新一代熒光實時定量PCR所取代。NASBA技術(shù)是一種等溫擴增系統(tǒng),其擴增根底在于系統(tǒng)內(nèi)的混合酶系統(tǒng),此系統(tǒng)內(nèi)含有逆轉(zhuǎn)錄酶AMV-RT和T-DNA多聚酶在體外模擬逆轉(zhuǎn)錄病毒體內(nèi)復(fù)制過程。此方法可分成四個步驟:核酸釋放、提取、擴增和測定。擴增后的產(chǎn)物運用NASBA QR電化學(xué)發(fā)光ECL系統(tǒng)進展檢測和定量,此系統(tǒng)包括親和素標(biāo)志的磁珠、生物素標(biāo)志的核苷酸片段此片段可與新合成的RNA產(chǎn)物的一端互補結(jié)合及可特異與四種產(chǎn)物結(jié)合的探針探針上標(biāo)志有銣元素,這四種探針可分別與不同的RNA產(chǎn)物結(jié)合。將四種探針分別置于不同的反響管內(nèi),在適當(dāng)?shù)臈l件下C幾種成分將結(jié)合在

15、一同,構(gòu)成復(fù)合體。這些復(fù)合體可在ECL讀數(shù)儀中被分別讀取銣元素的激發(fā)信號,根據(jù)野生型病毒核酸測定值與其他三個內(nèi)標(biāo)物測定值的比較可得到野生型病毒的拷貝數(shù)。Nuclisens EasyQ 結(jié)合NASBA核酸序列根底分析技術(shù)與分子熒光探針技術(shù)Molecular Beacon檢測血漿中的HIV RNA程度。這種結(jié)合的方法運用了實時擴增分析real-time amplification assay,提高了對診斷質(zhì)量的要求。 逆轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)技術(shù)目前用得最廣泛的儀器為COBAS AMPLICOR和相應(yīng)的檢測試劑COBAS AMPLICOR HIV- MONITORTM .版。聚合酶鏈反響人類免疫缺陷病毒H

16、IV-定量檢測試劑盒.版是在聚合酶鏈反響全自動診斷儀上定量測定人血漿中人類免疫缺陷病毒I型HIV-RNA程度的體外核酸擴增檢測試劑盒。該檢測試劑盒可以經(jīng)過兩種樣品處置程序進展檢測,即規(guī)范的和超敏感的操作步驟,定量測定含量為-,拷貝/毫升 HIV- RNA。規(guī)范的樣品處置程序中,HIV- RNA經(jīng)過運用裂解液裂解病毒顆粒從而直接從血漿中分別出來,然后用乙醇沉淀RNA。采用超敏感的制備方法,血漿中HIV-病毒顆粒首先經(jīng)過高速離心濃縮,然后用裂解試劑裂解病毒顆粒。再用乙醇沉淀RNA。COBAS AMPLICOR HIV- MONITORTM試劑盒.版包括個主要步驟:試劑預(yù)備;樣品制備;靶RNA的逆轉(zhuǎn)

17、錄產(chǎn)生cDNA;用HIV-特異互補引物進展靶cDNA PCR擴增;經(jīng)過比色與探針結(jié)合的擴增產(chǎn)物的測定。HIV-病毒RNA的定量檢測是采用HIV-定量規(guī)范品來完成的。HIV-定量規(guī)范品是包括作為HIV- 靶RNA引物結(jié)合部位和HIV-擴增子單一探針結(jié)合區(qū)的非感染性RNA 轉(zhuǎn)錄物。將知拷貝數(shù)的HIV-定量規(guī)范品加到每一個樣品中和HIV-靶序列一同共同進展樣品制備、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增、雜交和檢測并和HIV-靶序列一同擴增。COBAS AMPLICOR 分析儀根據(jù)HIV-定量規(guī)范品的數(shù)據(jù)計算每一個樣品的HIV- RNA的含量。該定量規(guī)范品補償了抑制要素的影響并且擴增過程的質(zhì)控使每一個樣品的HIV RN

18、A得以準(zhǔn)確定量。 分枝DNAbDNA技術(shù)分枝DNA測定技術(shù)基于其獨特的信號放大系統(tǒng),即分枝DNA信號放大系統(tǒng),這是一個人工合成的分枝DNA,分枝DNA的分枝可結(jié)合多個酶標(biāo)志物,從而將病毒的信號放大,以便進展檢測。此檢測系統(tǒng)不涉及核酸擴增反響。本方法定量系統(tǒng)中沒有內(nèi)標(biāo)志物,每次實驗設(shè)置一系列外部標(biāo)志,經(jīng)過實驗樣品反響強度與外部標(biāo)志樣品強度的比較確定實驗樣品的病毒拷貝數(shù)。每一種bDNA檢測都有各自的步驟或試劑。bDNA檢測通常包括以下步驟:將患者血清或血漿連同含有特異的合成寡聚核苷酸靶探針的裂解液加到微孔中;孵育。此步驟可釋放病毒核酸,降解RNA酶或使DNA變性, 然后靶探針結(jié)合到靶RNA或DNA

19、并固定在固相板上;冷卻洗板;加信號放大探針(bDNA)到各孔內(nèi);孵育. 此步驟使bDNA雜交到靶探針的相應(yīng)部位;冷卻洗板;加標(biāo)志探針到各孔內(nèi);孵育,此步驟使酶標(biāo)志的探針雜交到bDNA上;冷卻洗板;加化學(xué)發(fā)光底物到各孔中;孵育,此步驟讓酶和底物相互作用,產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號。發(fā)射的光強以相對光量值(RLUs)表示。產(chǎn)生的光強直接與各樣品中病毒RNA或DNA的載量成正比。各樣品中病毒核酸的含量由與樣品一同處置的規(guī)范所制造的規(guī)范曲線計算獲得。 實時real-time熒光定量PCR擴增實時熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反響體系中參與熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,最后經(jīng)過規(guī)范曲線對未知

20、模板進展定量分析的方法。每個反響管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所閱歷的循環(huán)數(shù)Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。利用知起始拷貝數(shù)的規(guī)范品可作出規(guī)范曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值。因此,只需獲得未知樣品的Ct值,即可從規(guī)范曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。實時熒光定量PCR擴增的實驗檢測過程可分為:樣品制備,抽提和濃縮目的RNA分子,并除去能夠存在的抑制因子。Real-time PCR,檢測PCR的產(chǎn)物運用熒光標(biāo)志的寡核苷酸探針。檢測的原理基于熒光信號增長曲線與循環(huán)數(shù)相關(guān)。RT-PCR反響,病毒RNA利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后經(jīng)過DNA聚合酶對特定

21、片段進展擴增。擴增產(chǎn)物的檢測,基于檢測閾值的設(shè)定,當(dāng)病毒載量高時,低循環(huán)數(shù)即能檢測到熒光信號,當(dāng)病毒載量低時,高循環(huán)數(shù)時才干檢測到熒光。循環(huán)數(shù)與樣品載量成線性關(guān)系。利用規(guī)范品制造循環(huán)數(shù)與載量的規(guī)范曲線就能對樣品載量進展定量檢測。第五章 室內(nèi)質(zhì)量控制內(nèi)部質(zhì)量控制是在良好實驗室整體環(huán)境支持下,從樣品接納到發(fā)出報告整個過程每個環(huán)節(jié)的管理過程,包括:人員;實驗室分區(qū)和環(huán)境;儀器;檢測過程試劑、操作過程,質(zhì)控品運用;數(shù)據(jù)。.人員HIV-病毒載量檢測人員分為檢驗人、復(fù)核人、簽發(fā)人。. 一切相關(guān)檢驗人員需經(jīng)操作培訓(xùn),能獨立熟練地操作,并經(jīng)考核合格,持證上崗。.復(fù)核人、簽發(fā)人應(yīng)具備對檢測過程進展分析、處理問題

22、的才干。.實驗室分區(qū)和環(huán)境.實驗室分區(qū)的功能HIV-病毒載量檢測實驗室原那么上應(yīng)分為三個獨立任務(wù)區(qū):試劑預(yù)備區(qū)、樣品處置區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū),并設(shè)在不同房間。不同檢測方法的分區(qū)功能和要求可有所不同。. 試劑預(yù)備區(qū):擴增試劑的配制、分裝和保管;. 樣品處置區(qū):樣品登記、分裝,核酸提取、保管和加樣;. 擴增產(chǎn)物分析區(qū):產(chǎn)物擴增的測定、結(jié)果分析、登記及報告。嚴(yán)厲要求三區(qū)的空氣流向:從試劑預(yù)備區(qū)到樣品處置區(qū),然后到擴增產(chǎn)物分析區(qū),不能逆向流動。實驗室的設(shè)置及輔助設(shè)備的詳細要求參見第二章。. 實驗室環(huán)境的要求.實驗室有足夠的空間;.采光好,應(yīng)防止陽光直射設(shè)備;.室溫控制在;.室內(nèi)相對濕度控制在%;.電源穩(wěn)

23、定,HIV-病毒載量檢測儀應(yīng)配備穩(wěn)壓電源;.室內(nèi)堅持干凈整潔,無灰塵。.實驗前后,用%乙醇或.%次氯酸鈉及時處置操作臺面。. 儀器設(shè)備質(zhì)控.加樣器、溫濕度計須經(jīng)計量部門校準(zhǔn),每年一次。每季度期間核對一次。. HIV-病毒載量檢測儀、離心機可以委托公司校準(zhǔn),每年一次。.冰箱、水浴箱用校準(zhǔn)合格的溫度計丈量溫度,并做好記錄。.檢測過程質(zhì)控 .試劑質(zhì)控. 一切試劑盒須嚴(yán)厲按要求條件保管。.試劑盒拆封時,要記錄拆封時間,一切試劑嚴(yán)厲控制在有效期內(nèi)運用。.運用經(jīng)中國食品藥品監(jiān)視管理局注冊的試劑。. 實驗用水:要求運用無DNA和RNA酶的水。. 操作過程質(zhì)控嚴(yán)厲執(zhí)行儀器和試劑的規(guī)范操作程序SOP,不得擅自修

24、正。.質(zhì)控品的運用每次實驗需同時運用試劑盒內(nèi)的質(zhì)控品以及一個HIV- RNA為-拷貝/毫升的外部質(zhì)控品。.外部質(zhì)控品的制備按實踐運用量的要求配制大樣品量的血漿引薦每次配置量可運用兩年,用.m濾膜過濾除菌,充分混勻。用無菌凍存管定量分裝,標(biāo)志,封口,凍存于-以下非自動除霜冰箱內(nèi)。.外部質(zhì)控品的定值隨機選出管外部質(zhì)控品,按照實驗室的檢測條件進展HIV-病毒載量檢測,將拷貝值換算成Log值,計算算術(shù)平均值m和規(guī)范偏向s。.質(zhì)控圖的繪制和運用根據(jù)外部質(zhì)控品的定值,繪制質(zhì)控圖。在質(zhì)控圖上顯示一切次質(zhì)控品檢測值的Log值、平均值以及.s 值范圍。每次檢測都應(yīng)帶個外部對照,將得到的外部對照Log值標(biāo)在質(zhì)控圖

25、上,根據(jù)能否在.s 值范圍判別實驗結(jié)果能否有效,每次測得值在平均值.S內(nèi)方為有效。運用新批次的外部對照質(zhì)控品時,必需重新繪制質(zhì)控圖。. 試劑盒質(zhì)控品的運用每次實驗按照試劑盒闡明書的要求運用試劑盒提供的質(zhì)控品,并滿足質(zhì)控品的要求。. 數(shù)據(jù)分析、結(jié)果報告. 在試劑盒及外部質(zhì)控品結(jié)果滿足要求的前提下,對樣品進展分析。. 外部質(zhì)控品不合格,樣品需求重新檢測。. 結(jié)果超越檢測上限的樣品應(yīng)稀釋以后重新檢測。. 復(fù)核人對檢測結(jié)果進展仔細復(fù)核并對結(jié)果提出結(jié)論、簽字。. 簽發(fā)人對結(jié)果的結(jié)論進展審核、分析、總結(jié)、簽字。. 按不同方法的要求,以拷貝/毫升或國際單位/毫升為單位報告樣品的HIV-病毒載量值。第六章 外

26、部質(zhì)量控制HIV-病毒載量檢測的外部質(zhì)量控制可以經(jīng)過參與外部質(zhì)量評價,提高實驗結(jié)果的可比性,發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)誤差,改良實驗室任務(wù),提高檢測質(zhì)量。艾滋病參比實驗室自年開場參與由美國國立衛(wèi)生研討院NIH組織的HIV-病毒載量檢測考核任務(wù),考核盤有個樣品組成,分別考核實驗室檢測的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,經(jīng)過將結(jié)果與國際上參與考核的一切實驗室結(jié)果進展比對評價,給出綜合評價結(jié)果。經(jīng)過參與考核,保證艾滋病參比實驗室的不同HIV-病毒載量檢測系統(tǒng)的有效性。目前,艾滋病檢測實驗室經(jīng)過參與艾滋病參比實驗室組織的HIV-病毒載量檢測才干驗證來實施外部質(zhì)量控制。. HIV-病毒載量檢測才干驗證PT的組織艾滋病參比實

27、驗室為HIV-病毒載量檢測才干驗證PT的組織者,擔(dān)任制定國內(nèi)HIV-病毒載量檢測才干驗證的方案并組織實施。建議國內(nèi)一切從事HIV-病毒載量檢測的實驗室參與該PT工程,在規(guī)定時間內(nèi)運用有效試劑與實驗樣品一同檢測,填寫HIV-病毒載量實驗結(jié)果報告單附表-,上報艾滋病參比實驗室。鼓勵有條件的實驗室參與國際組織的PT活動。 . HIV-病毒載量檢測才干驗證PT的實施. PT樣品組成:每次份。包括陰性、不同拷貝數(shù)的陽性樣品。. PT頻率:一年次,分別為月和月。. PT樣品的接納與保管:要求參與PT的實驗室收到考核樣品后,立刻進展核對、檢查,填寫HIV-病毒載量檢測才干驗證樣品接納公用單附表,天內(nèi)將接納公

28、用單傳回艾滋病參比實驗室。如發(fā)現(xiàn)考核樣品缺失、量缺乏、空管等情況,及時書面報答,艾滋病參比實驗室擔(dān)任補寄或改換。收到樣品后應(yīng)及時檢測或在-度以下保管。. PT樣品的檢測:要求將考核樣品同實驗室常規(guī)樣品一同檢測,由常規(guī)檢測人員進展,不應(yīng)作為特殊樣品處置。. PT結(jié)果的報告和處置:參與PT的實驗室必需在規(guī)定的時間內(nèi)收到樣品個月內(nèi),用電子郵件報告實驗結(jié)果,并將HIV-病毒載量實驗結(jié)果報告單附表-和打印的儀器原始記錄一同上報給艾滋病參比實驗室,后者將擔(dān)任結(jié)果錄入和處置。評分原那么:比n呢體要求參與考核裝和保管。及抗病毒治療.評分原那么:沒有任何問題者為優(yōu)秀;出現(xiàn).中的一條為良好;出現(xiàn)至少.中的兩條或至

29、少.中的一條為不合格。.次要問題:一個樣品結(jié)果在.S內(nèi);一個假陽性;一個無效結(jié)果;一個謄寫錯誤。.主要問題:兩個樣品結(jié)果超越.S;兩個及以上假陽性;兩個及以上無效結(jié)果;兩個及以上謄寫錯誤。. 評價結(jié)果反響:艾滋病參比實驗室根據(jù)各實驗室的兩次考核結(jié)果,每年反響最后的評價結(jié)果。.埋怨和申訴:參評實驗室如對評價結(jié)果或其它方面存有異議,可以在收到結(jié)果后天內(nèi)向艾滋病參比實驗室提出異議,后者在核實情況后予以回答。. 現(xiàn)場督導(dǎo):根據(jù)考核情況的需求,艾滋病參比實驗室組成技術(shù)專家組對不合格實驗室進展現(xiàn)場檢查。檢查內(nèi)容包括:實驗原始數(shù)據(jù)、實驗室規(guī)劃、儀器運轉(zhuǎn)情況、輔助設(shè)備校準(zhǔn)情況、實驗耗材質(zhì)量、樣品保管、試劑盒運

30、用形狀、人員培訓(xùn)情況、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制等。第七章 實驗室生物平安.相關(guān)根據(jù)、和。.平安細那么.進入實驗室應(yīng)穿任務(wù)服、戴口罩、戴一次性乳膠手套。嚴(yán)禁在實驗室內(nèi)進食、飲水和吸煙以及運用化裝品。.一切樣品包括試劑盒中的人源性成份如陰、陽性對照都應(yīng)在生物平安柜內(nèi)進展處置。.樣品應(yīng)盛裝在有螺旋蓋的管子中,以防樣品濺出或產(chǎn)生交叉污染。當(dāng)具有潛在傳染性的物質(zhì)溢出時,立刻用.%次氯酸鈉溶液或其它消毒劑處置污染區(qū)及器材;接觸過標(biāo)本的器材應(yīng)置有公用消毒劑的容器,與一次性物品一同在丟棄前進展高壓滅菌處置。.防止試劑盒中各種有毒有害化學(xué)成分如疊氮鈉、二甲基亞砜、異硫氰酸胍對人體或環(huán)境能夠呵斥的危害。.生物平安培訓(xùn).

31、一切涉及HIV-病毒載量檢測的人員都應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)厲的技術(shù)培訓(xùn),要掌握生物平安保證的原那么、措施。每個人的平安教育均應(yīng)記錄在實驗室和人事檔案中。.省級及以上疾控中心艾滋病實驗室擔(dān)任HIV/AIDS檢測生物平安培訓(xùn)及HIV-病毒載量檢測培訓(xùn)。.檢測相關(guān)人員應(yīng)自動接受實驗室生物平安員以及平安擔(dān)任人的監(jiān)視。一切實驗室不測事件均應(yīng)進展記錄和報告。.一切人員要維護本身和環(huán)境的平安。.參照實驗室平安指南和規(guī)范操作程序的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行詳細操作。.職業(yè)暴露處置.實驗室應(yīng)建立完善的艾滋病職業(yè)暴露后的預(yù)防機制。.發(fā)生職業(yè)暴露后,首先進展應(yīng)急處置,然后根據(jù)暴露級別和暴露源頭嚴(yán)重程度,評價風(fēng)險級別,并決議能否進展預(yù)防性用藥和

32、用藥程序,如需求時,盡早開場服用抗病毒藥物。.按規(guī)定進展職業(yè)暴露登記、檢測和報告,留意做好嚴(yán)密任務(wù)。附表 常見問題分析一NASBA問題緣由 處置方法血清或血漿樣品中有特殊物質(zhì) 化凍緩慢引起的細胞裂解離心至上清清亮 硅膠難以重新懸浮 樣品中核酸程度太高 猛烈震蕩混懸,由于洗滌/洗脫效率不高可影響敏感度。樣品最多帶有相當(dāng)于個細胞的DNA。 硅膠枯燥不佳 丙酮剩余太多 用- l槍頭吸干凈枯燥溫度太低 枯燥時間最多延伸分鐘 檢查加熱模塊的溫度 參與硅膠的樣品離心后難以溶解 硅膠孵育時間太長 ( min) 添加震蕩時間和強度 無效結(jié)果;信號太低 酶未完全溶解保證酶稀釋和運用前平衡至室溫,充分溶解并在一小

33、時內(nèi)運用 磁珠未充分混勻或參與的量太少每次參與前先震蕩混勻,保證磁珠快速沉在管底樣品濃度太高 檢查檢測稀釋液、樣品及已稀釋樣品參與的量 擴增時溫度偏向 調(diào)整加熱溫度,應(yīng)該在.C. 二RT-PCR問題緣由 處置方法QS_無效QS_INVALIDQS稀釋系列的A數(shù)值未在檢測的吸光度范圍內(nèi)。該樣品檢測的結(jié)果無效。結(jié)果無效的樣品應(yīng)從樣品和質(zhì)控的制備開場重新進展逆轉(zhuǎn)錄、擴增和檢測。靶序列吸光度偏低(TARGETOD LO)一切HIV-的稀釋度的A數(shù)值低于檢測的線性范圍。報告結(jié)果根據(jù)所采取的規(guī)范的或極度敏感的提取方法可以是“HIV- RNA 沒有檢測到HIV- RNA低于拷貝/毫升或“HIV- RNA 沒

34、有檢測到低于拷貝/毫升。靶序列吸光度偏高(TARGETOD HI)一切HIV-的稀釋度的A數(shù)值高于檢測的線性范圍。報告結(jié)果方式為“不能確定。假設(shè)采用規(guī)范樣品處置程序,用HIV陰性的人血漿稀釋原始樣品并用規(guī)范的樣品處置程序重新檢測。報告的結(jié)果應(yīng)乘以稀釋因子。假設(shè)采用極度敏感的樣品處置程序,稀釋原始血漿樣品,用規(guī)范的樣品處置程序重新檢測。報告的結(jié)果應(yīng)乘以稀釋因子。結(jié)果偏低RESULT_LO計算的拷貝數(shù)低于測定下限。對于規(guī)范的樣品處置程序,結(jié)果可以報告為“檢測到HIV- RNA, 含量低于拷貝/毫升。假設(shè)需求定量的結(jié)果,原始樣品應(yīng)該運用極度敏感的樣品處置程序重新檢測。對于極度敏感的樣品處置程序,可以

35、報告為“檢測到HIV- RNA, 含量低于拷貝/毫升。結(jié)果偏高RESULT_HI計算的拷貝數(shù)高于測定上限。對于規(guī)范的樣品處置程序,結(jié)果可以報告為“HIV- RNA含量高于.拷貝/毫升。假設(shè)需求定量的結(jié)果,原始樣品可以用HIV-陰性的人血漿稀釋并重新檢測。報告的結(jié)果應(yīng)乘以稀釋因子。對于極度敏感的樣品處置程序,重新檢測。對于極度敏感的樣品處置程序,結(jié)果可以報告為“HIV- RNA含量高于.拷貝/毫升。假設(shè)需求定量的結(jié)果,稀釋原始樣品用規(guī)范的樣品處置程序重新檢測。TARG_GANGE一切靶模板的A數(shù)值都不在線性測定范圍之內(nèi)??梢詧蟾鏋椤拔礄z出。重新檢測原始樣品,反復(fù)樣品和質(zhì)控制備、逆轉(zhuǎn)錄、擴增和檢測

36、步驟。OD_SEQUENCE提示有不符合稀釋順序的A值出現(xiàn)。反復(fù)整個實驗步驟包括樣品和質(zhì)控的制備、擴增和檢測。QS_SEQUENCE提示QS有不符合稀釋順序的A值出現(xiàn)。反復(fù)整個實驗步驟包括樣品和質(zhì)控的制備、擴增和檢測。三Easy Q問題緣由 處置方法分子信標(biāo)沒有檢測絕對信號程度太低用洗脫液重新檢測Q值設(shè)定的大小不同于WT值設(shè)定的大小內(nèi)參照數(shù)據(jù)設(shè)定的大小不同于WT數(shù)據(jù)設(shè)定的大小重新設(shè)定內(nèi)參照數(shù)據(jù)測定的曲線不延續(xù)所測定曲線不延續(xù)性用洗脫液重新檢測沒有擴增內(nèi)參照和WT最大/最小信號的比值都低于閾值用洗脫液或者樣品再開場測擴增弱曲線斜率太低用洗脫液重新檢測計算錯誤曲線擬合程序產(chǎn)生錯誤用洗脫液重新檢測不

37、正確的擴增動力學(xué)擬合曲線沒有正確地描畫所察看的數(shù)據(jù)用洗脫液重新檢測延遲時間太短起始熒光添加的速度太快用洗脫液重新檢測。確信參與酶和開場此輪運轉(zhuǎn)之間的時間少于分鐘。擴增弱內(nèi)參照值和WT值都沒有到達一個平臺值用洗脫液重新檢測沒有測到內(nèi)參照。沒加內(nèi)參照或者樣品的參與程度太高沒有測到內(nèi)參照的信號,能夠是由于在核酸的分別物中沒有加內(nèi)參照或者WT的參與太高用稀釋過的樣品重新檢測四bDNA問題緣由 處置方法注射器含有氣泡洗液瓶, 水瓶, 漂白液瓶是空的或管道銜接松弛。加適量的溶液在空瓶里;管路都在各自的瓶內(nèi)液面下。分析儀底部的加熱托盤上有液體管路銜接松弛或一洗頭的分液或吸液針管堵塞。檢查管路銜接。管路有堵塞

38、或細菌繁殖管路和試劑瓶沒有正確保養(yǎng)。每次實驗后清洗并晾干洗液瓶和水瓶,倒空廢液瓶;每周清洗洗液瓶, 水瓶和廢液瓶,管路系統(tǒng)。分析儀不能從孔內(nèi)汲取足夠的液體洗頭中有堵塞, 洗頭針頭彎曲, 廢液管銜接松弛, 吸液泵損壞。檢查廢液管銜接頭RLU值低試劑漏掉, 用錯試劑, 某種試劑配制錯誤, 漂白液污染, 孵育時間或溫度不正確, 或檢測板冷卻缺乏。在實驗前確定盛水試劑瓶已滿。確定按產(chǎn)品要求儲存、配制試劑;環(huán)境溫度在-;試劑盒沒有過期;實驗中所運用的試劑同一批次;每周清洗過程中在管道和試劑瓶中沒有殘留。RLU值高實驗被污染, 清洗不充分, 或有光泄露。確定全運用干凈的一次性無菌實驗資料;運用防氣溶膠的加

39、樣槍頭;殘留的底物沒有倒回原瓶;用%乙醇定期擦洗微量加樣器;盛洗液的試劑瓶內(nèi)有足夠量的洗液;檢查分液、吸液操作;每周進展保養(yǎng);分析倉門封鎖嚴(yán)實;檢查背景RLU值。變異系數(shù)(CV)高移液操作錯誤,樣質(zhì)量量差, 孔有污染, 清洗不充分, 試劑沒有預(yù)熱充分, 試劑沒有充分混勻, 孔內(nèi)樣液蒸發(fā), 孔內(nèi)樣液濺灑, 有光漏。確定微量加樣器經(jīng)校準(zhǔn);運用防氣溶膠的槍頭;槍頭嚴(yán)密套在加樣器上;加試劑時槍頭位置在孔的中部;樣品凝塊或殘渣沒有被汲?。粯悠芳拥奈恢门c樣品ID和DMS規(guī)定的位置一致;樣品按產(chǎn)品闡明搜集,處置和儲存;只運用干凈的一次性無菌實驗資料;檢查分液吸液操作;盛洗液的試劑瓶內(nèi)已裝有足夠量的洗液;每種

40、試劑在實驗開場前被悄然混勻;每種試劑預(yù)熱充分,以防有沉淀;封鎖墊組裝正確;孔內(nèi)樣液沒有濺灑;分析倉門封鎖嚴(yán)實;檢查RLU背景。規(guī)范曲線平坦或不正常加規(guī)范時板的缺口在右邊,或規(guī)范參與順序有誤。加規(guī)范時板的缺口在左邊強或弱對照定量高強陽性對照受污染, 汲取誤差, 或規(guī)范曲線有問題。 確定各孔仔細加樣, 未觸及鄰孔;運用無菌槍頭;封鎖墊組裝無誤;加樣器定期校準(zhǔn);運用防氣溶膠的槍頭;規(guī)范和對照加樣位置正確;按產(chǎn)品闡明要求儲存, 配制。強或弱對照定量低對照降解, 對照濺灑, 對照孔液蒸發(fā), 對照加樣有誤, 或?qū)φ諞]有充分混勻。確定試劑盒在運輸和到貨后儲存在正確的溫度;運用無菌槍頭;沒有汲取氣泡;封鎖墊組裝無誤;加樣器經(jīng)校準(zhǔn);小心處置測試板,防止濺灑;規(guī)范和對照加樣位置正確;按產(chǎn)品闡明要求儲存, 配制;樣品,規(guī)范,對照在汲取前至少震蕩秒。附表 HIV-病毒載量檢測樣品送檢/接納單送檢單位送檢日期接納單位接納時間采樣時間采樣管抗凝劑樣品保管溫度樣品運輸條件姓 名性 別年齡職業(yè)國籍或民族戶籍所在地既往病史運用藥物抗HIV病毒藥物樣品編號樣品性質(zhì)樣品量ml備 注送樣人接納人附表 HIV-病毒載量檢測才干驗證樣品接納公用單實驗室稱號接納日期收到樣品量編號體積ul樣品形狀外包裝能否完好是 否冰塊能否融化是 否樣品能否融化是 否方案檢測日期檢測方法接納樣品后存放溫度 - - 其它接納人

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