WesternBlot實戰(zhàn)指南：從電泳到定量

1、【轉】esternlo實戰(zhàn)指南：從電泳到定量1樣品制備：變性條件直接裂解：用常溫或者高溫預熱過（預熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，久煮某些性質會改變）的1（或者略高15直接加到細胞或者組織上并煮樣。通?？装寮毎?以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，都是過量的（因此不一定要嚴格參考稀釋比）；如果不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣后會發(fā)現(xiàn)tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。這時候常規(guī)做法有兩種，1再煮min常規(guī)煮樣時間，樣品過濃時就煮10min；2如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當增加，繼續(xù)煮；也可以對樣品進行超聲。煮樣時間若

2、過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續(xù)的意義，請丟棄（判斷標準：出現(xiàn)明顯的蛋白沉淀和水分層）此方法的缺點，煮過的樣品如果用來做，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細胞器分離等等了，其實類似）裂解細胞請盡量冰上操作，減緩酶解作用。俺前bossnature文章上的裂解液配方是：20mris/l,p,100mal,20ml,1mgl2,040andproteaseinhibitors（20pg/mlleupeptin,10pg/mlpepstatinAand10pg/mlaprotinin（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很復雜也很貴，其實

3、用替代這三種就好了；如果還要做磷酸化蛋白，加（現(xiàn)加現(xiàn)用），a此方法的優(yōu)點：濃度略低于生理狀態(tài)，保證裂解細胞的方式較為溫和，便于隨后的等試驗。其他鹽濃度的細胞裂解液也很常見，諸如（生理鹽濃度）、（高鹽系列，裂解細胞時染色體會析出，細胞碎片和沉淀非常粘稠）及-及以下適合試驗，及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強的復合體，要得到純化的一些復合體的組成蛋白一般采用極端的高鹽裂解細胞。用于核蛋白的裂解的原因是，用于破壞核膜結構；可用到但此時染色體會析出，沉淀粘稠。組織塊裂解：組織塊較大用勻漿的方法最合適，現(xiàn)在有不少轉頭很小的勻漿器。當組織超微量的時候，比如新鮮癌組織，我采用的方法是低溫（剪）攪碎，成肉糜

4、狀。錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進一步破碎；反復多次。用上述細胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，收集上清液用于檢測；如果含量過低，需要用沉淀富集。理論上，從普通培養(yǎng)基中收集分泌蛋白，此時對細胞生長條件的影響最小，是最佳的實驗條件；但是這存在隱憂。因為含血清的培養(yǎng)基中含有非常豐富的（牛血清白蛋白）之類的蛋白質，除非你進一步分離純化，否則直接用這種樣品去會有非常大的麻煩，尤其當你的蛋白在之間的時候;用“任何”抗體去檢測這一區(qū)間的蛋白，會有一片非常強的信號。因為此區(qū)間蛋白（主要是）濃度過于富集，會非特異性粘附“任意”抗體，從而最終被識別。

5、同理，采用裂解細胞制備樣品前，通常要用洗滌，其目的之一是去除培養(yǎng)基中的。采用無血清培養(yǎng)基收集細胞上清除了改變細胞的生理狀態(tài)外（可能激活未知信號途徑，諸如等），還會出現(xiàn)的問題是：即使采用了無血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對好很多。選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用沉淀富集，再重新溶解。沉淀對半定量操作要求非常高，因為很容易沉淀不充分或者離心操作丟失,尤其在離心過程，離心管的擺放非常講究，要度翻轉離心兩次。b。重新溶解時，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對麻煩。實際上，如果你不是非常強調蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測上清，尤其半定量的實

6、驗檢測不同樣品間的差異。這里面有實驗操作細節(jié)的麻煩經(jīng)驗之談，我曾經(jīng)參與的文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但的數(shù)據(jù)是；偶爾用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為進一步分析做準備。樣品制備完，應立即低溫保存（度短期（幾天）；度長期；例外，用樣品應直接進行，避免凍融破壞蛋白質間弱的相互作用）。煮沸過的樣品凍融會存在另一個問題，沉淀；度就會沉淀，何況度。上樣前應加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（不夠，樣品未充分溶解也會出現(xiàn)類似拖尾；上樣過大也會）。在樣品制備過程中，另一個需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問題；本身系統(tǒng)誤差有，太細微的差別經(jīng)常忽略不計。細胞樣品可以先計數(shù)再接種，

7、短時間內即使細胞生長有差異也不會對結果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大小（稱重）開始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過程也盡量避免蛋白損失。有人會說可以電泳前蛋白定量，我將下一節(jié)討論蛋白定量的不科學性，以及裂解液成分對定量的干擾。蛋白電泳：電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請參考分子克隆。經(jīng)驗之談，8%膠最底邊約，最底邊約，最底部約。膠可以跑之間的任意蛋白，轉膜效率對結果的的影響都問題不大。，左右，轉膜效率對結果的影響都問題不大（蛋白如何，沒有嘗試過）。電泳一般采用恒流，（應根據(jù)電泳儀器適當調整，要注意儀器最高限壓；此條件適合型，膠寬）。采用恒流的優(yōu)點，保證最快速度完成電泳（電壓會逐漸增大）

8、，省時且減少擴散；但是由于電泳速度過快時會發(fā)熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現(xiàn)波浪狀。注意事項：1聚丙烯酰胺的30母%液會降解，要4度避光保存。會失效，一般保質期才一個月左右。度分裝長期保存。注意的值，以及平時所用的水的值。值改變會使帶型非常怪異，所有蛋白和溴酚藍壓成一條細線（即便在分離膠中），如果溴酚藍前有紅色染料，那么此染料彗星式拖尾從溴酚藍一直延伸到膠底部（溴酚藍此時涌動極緩慢，位于膠中上部）上下層式電泳裝置若漏液，哪邊漏液，電泳條帶往哪邊傾斜。內外式電泳裝置漏液，則裝置處于短路狀態(tài)，液體會過熱。膠可能局部自溶，條帶扭曲、變形。配膠用玻璃板和邊條應及時洗凈。玻板未洗凈的壞

9、處很多。盡管玻璃看似平滑，但是一些細微的凹陷處會凝結肉眼無法分辨的膠顆粒（摸上去疙疙瘩瘩），其壞處是，在該部位極易導致不均勻的膠塊，樣品經(jīng)過該處或電泳散熱不好，條帶變形。如果是的超薄膠，膠板的顆粒會導致局部巨大氣泡，非常難于清除；蛋白膠也會導致一些小氣泡的產生。玻板沒洗凈的另一個壞處是，由中學物理知識可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗凈的玻板會削弱和膠體間的粘附力，拔梳子或邊條時會產生微小的錯動，膠體下部出現(xiàn)大量氣泡（夾在玻板和膠之間，這個關系不大）；嚴重的錯動會使上樣時，樣品從膠和玻璃之間的間隙漏光，或者甚至膠和玻板分開。為避免拔梳子時的錯動，可在電泳緩沖液中拔梳子（比水更好，有潤滑）。判斷

10、玻板是否洗干凈，用手摸一下有沒有疙疙瘩瘩的；最好用洗潔精之類，洗衣組細胞裂解液樣品，前者通常洗脫體積為，剛好達到常規(guī)粉、肥皂都不好用。上樣時，不要把深入膠孔過深（或者采用細的尖端拉長的專用上樣槍頭），可能會錯開膠和玻板，樣品會泄露。未加樣的孔應添加高濃度平衡，否則最外側條帶會拉寬變形。通常樣品（含*,可用平衡。同理，點的也要加入同樣體積的。若在室溫放置太久和新鮮的在比重上會有差異，在新舊靠近的地方，條帶會拉寬或擠壓變形。因此，同一塊膠上，煮樣及填空白所用應一致。應度保存。增加上樣量不一定會提高熒光信號強度。增加上樣量的后果通常只能是讓你的內參粘連，所有的蛋白條帶都扭曲變形。因為增加上樣量最多只

11、能提高幾倍，而靈敏度是以的幾次冪量級的，所有目的蛋白信號的唯一方案就是富集（可特異提高目的蛋白濃度數(shù)百數(shù)千倍，并去除其它雜蛋白干擾）。增加上樣量的另一個壞處是，本來高表達的蛋白，諸如內參，在同樣條件下，可能出現(xiàn)熒光灼燒式粹滅（一晃而滅）或者條帶中空。仍以孔板以上匯合度為例，細胞裂解液和通常都是投入（最少，這樣面積的培養(yǎng)板如果裂解液投入太少，回收時的損失就太大，上樣就很難做到一致），而這種濃度條件下制備的樣品，電泳時上樣量要控制在5-，6最少，最多，時內參基本已經(jīng)開始粘連成一條線，帶型出現(xiàn)波浪紋；當然并非不可以多上樣，再多對結果影響不大（沒有的仍然沒有），且條帶都很丑。不同樣品上樣時，可考慮將樣

12、品體積調成一致或類似。如果一組樣品和一上樣體積；后者第點提到只上，同樣（比重同，不會互相擠壓）,最好補加使總體積一致。通常這樣不同條件獲得的樣品，中間最好用“空白”泳道隔開（空白僅指無蛋白，仍應加入），這樣才能確保每條帶都很美觀。膠配好暫時不用時，需用電泳緩沖液灌滿空間（拔去梳子和底邊邊條后的間隙），用保鮮膜包裹防止液體蒸發(fā)，短期室溫或稍長期4度保存。個人習慣為，灌好分離膠用飽和的正丁醇灌滿上層，保鮮膜包裹，次日再灌堆積膠。兩種方案都可以。所以如果預計次日工作量較大，可以提前灌好。樣品是否一定需要定量再上樣？不是的，這是浪費時間的一個操作。我們首先來討論一下蛋白定量的科學性。蛋白定量首先需要一

13、個參照系（標準蛋白），參照蛋白通常選擇，也就是說你所謂的定量是對應于的濃度的一個參照值。這里面存在一個問題，即忽略了蛋白折疊和空間構象對光吸收、折射的影響；不同的蛋白折疊和構象還會影響顏料分子的嵌入。因此你其實默認將所有的蛋白等同于在溶液中的折疊狀態(tài)、光吸收情況下，然后做出的一個相對判斷，這就存在一個“系統(tǒng)誤差”還不算上測量誤差等等，就已經(jīng)很不準確了。其次，裂解組織或細胞的時候，那些裂解液中，某些溶劑本身會使或者法（實際也是染色）顯色，尤其是去污劑之類；例如4就會使顯藍色，可以完全覆蓋掉蛋白與作用產生的藍色。因此，如果你的裂解液里面含有這類物質，所謂的蛋白定量實際是顏色和蛋白染色的疊加，根本不

14、會符合標準蛋白曲線的線性規(guī)律，自然定不準。【需要說明：我目前只知道會這樣，因為我們從來不去定量，沒有做過更深入的研究。】實際上保證你的內參一致，是從樣品制備開始的，上節(jié)末尾有提到，不贅述。如果你從制備樣品時就注意過定量問題，實際上通常內參差別不會太大。如果真的有差別，通常我們會先跑少量的樣品，目的是讓或更清晰、不會粘連、不會過曝光。從而在第二輪跑正式結果前，根據(jù)第一輪的內參的熒光信號做微調，大致能做到相當；最多可能需要第三輪。以上的試驗可以精確到0.1差異（我很多體外生化試驗之前的調整酶量就是這樣進行，此時根本不可能有足夠的蛋白讓你去定量）。當然憑曝光強弱調整上樣量的前提是，你的技術很穩(wěn)定，很

15、可靠，這是需要相當多的經(jīng)驗積累，如果你一時掌握不了，可以讓經(jīng)驗更豐富的師兄師姐或者導師幫忙。順便提到，有人問過用等定量軟件對光密度定量后計算差別從而調整上樣體積是否可以？不可以。因為結果經(jīng)過多重放大，精確計量只代表相對于對照組的相對比值，與實際比值還是有誤差，所以按計算值更改上樣量仍會出現(xiàn)偏差。如果非要做定量的話，要注意你的裂解液配方，把每種溶劑都先加入到顯色液中嘗試一下，避免那些本身會顯色的物質出現(xiàn)在你的裂解液中；當然，某些物質的去除可能影響對組織蛋白的提取。所以這是一個兩難的問題。轉印一轉印效率對結果的影響并不如書本和網(wǎng)絡上宣揚的那么大！首先必須澄清的是，很多時候新手會把結果無信號歸咎于轉

16、膜不夠充分，實際上轉膜效率對最終結果的影響所占比重并不高，真正取決定性因素的是抗體識別能力的強弱，以及如何正確使用抗體，這個問題下節(jié)討論。有一個簡單的例證，提供的厚濾紙初次使用時，通常轉膜效果不理想（從預染的ma深淺可知），但對多數(shù)一般豐度的蛋白的檢測沒有任何影響（建議少用這種新濾紙做那種含量特別稀少或者轉膜非常困難的蛋白）。沒有很好的策略可以解決這個新濾紙的問題；嘗試過浸泡（會泡爛的）、預電泳（會稍微好點）等等，效果均不理想。通常，最初一兩次的使用就是用于轉一般蛋白。每次用完后清水稍微沖洗一下表面鹽分（要控制水流；水流太大，紙張會爛掉的），晾干再用；只要沒沖爛可以一直反復使用。其次，盡管轉膜

17、效率不起決定性作用，但由于的流程相對較長，所以每個步驟的疊加作用會被級數(shù)放大，因此在試驗的每個步驟我們仍會力求更好，因此以下仍會深入探討如何提高轉膜效率。針對提高轉膜的效率，個人認為最先應該考慮到的是儀器的選用。這里不是歧視“madeinChina”，國內的廠家很少注重不斷提高自己產品的品質，走低端策略，對于電泳儀這種技術含量不高的儀器倒可以湊合；但說到轉膜儀，能把一個簡單的勻場電極做好的還真不多（就我道聽途說的，國外廠家為了使電極之間場強更加均勻，那種大塊金屬板表面是鍍過極薄的白金層）；因此轉膜效率和均勻方面孰優(yōu)孰劣不言而喻。目前，個人使用過的國產電轉槽（濕轉）唯an仿i的還可以（算替它們免

18、費打個廣告吧，an仿iadmi型電泳儀，在某些方面（主要是操作）上還優(yōu)于i原裝；目前我認為“中國制造”的靈魂就是仿造并超越前者）；半干轉儀一律進口，用過i、dneham和英國公司的Teoa:批評一下i、adi的c半干轉儀，其硬質塑料外殼會莫名其妙的碎裂（絕非摔裂、磕碰，因為底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除殘留鹽漬，基本不會移動；即便如此它自然就會碎裂），以致于其核心組件未壞的情況下，因外殼碎裂不得不報廢該儀器（其外殼里包裹電源線，外殼碎裂，電源則無法接通，導致儀器報廢我們先后買過3臺都是這樣的毛病，其間間隔了3年，不能肯定近來有沒有改進這個問題；如果沒有，我想市場遲早會被其他公司所取代）對

19、這三款產品，的外殼有明顯的質量缺陷，容易過早報廢；獨特的蜂窩式設計確實對轉膜效率有所提高，但蜂窩式使得與“三明治”的接觸面減少，電轉時散熱不太好，做大蛋白（半干轉儀也可以做大蛋白轉膜，效率確實不如濕轉，但抗體好、蛋白豐度一般時仍可采用）長時程（）轉膜需要在度冰柜或進行；英國的產品，價格較高，公司不太出名國內不一定有代理，但質量和散熱都非常好。這里談到了半干轉和濕轉。這兩種轉印方法各有優(yōu)劣。濕轉適合所有的蛋白，轉膜效率最佳，但靡費試劑、溶液，對普通分子量大小的蛋白轉染操作時間長于半干轉（下文會具體給出條件）；半干轉適合分子量較小的蛋白，省時、省試劑。蛋白分子大小如何界定呢？習慣上認為以上為大蛋白

20、，其他均屬于小蛋白，當然這只是一個相對標準。因此，通常對大蛋白的轉印多數(shù)人會選擇長時程的濕轉，那么剛才提到的半干轉儀的缺陷實際上沒太多實質意義，何況還可以外加條件彌補；而且用半干轉做大蛋白轉印本來就是高手在懸崖上跳舞此時轉膜效率是否更高已經(jīng)沒有任何意義我說過轉印效率對結果不起決定因素。濕轉、半干轉緩沖液配方請參考分子克隆，有必要指出的是，實際上用半干轉緩沖液進行濕轉效果也非常理想，通常這種緩沖液可以反復使用多次（=5次常規(guī)電轉，如有長時程轉染，緩沖液使用次數(shù)會減少），不過要注意初始電流（同樣溫度下，初始電流高，表明緩沖液中電解質剩余不多，為確保轉膜溫度，可開始或中途更換新鮮轉膜液）。電轉液中增

21、加蛋白的水溶性，促進蛋白在電轉液中泳動。若不加，蛋白會沉淀在膠上，但過多會影響蛋白與膜的吸附。甲醇能使與蛋白分離，甲醇濃度越高與蛋白分離越快，但高濃度的甲醇對蛋白會有固定作用，不利于蛋白從膠里跑出來。一般來說甲醇的濃度為，但膜截留上交聯(lián)的小分子顏料的能力很差，可考慮提升甲醇的濃度至25（%它對普通蛋白的轉膜影響不太，顏料截留更多）；大蛋白轉印可考慮降低甲醇濃度，另外必須添加。甲醇的另一個作用是降溫，舊的電轉液由于電解質的消耗和甲醇的揮發(fā)，電轉時電流或電壓變化更快、溫度升高也更快，因此可考慮增加額外的甲醇；這點對半干轉緩沖液的意義較大，因為半干轉緩沖液消耗很慢，緩沖液放臵的時間較久，甲醇揮發(fā)比較

22、嚴重，可臨時少量補加。濕轉一般采用穩(wěn)壓，電壓控制在，時長（小蛋白控制在，大蛋白），有人會選擇過夜，從實驗的效率來講太浪費時間，對轉膜到底有多大程度的增益難說，不太推薦；半干轉一般穩(wěn)流，依膜附帶說明書，當，電壓2半干儀額定值不能超過；半干轉儀，限壓。通常跑不到這么大的電壓，除非是新的濾紙或很久的轉膜液，或常溫放置的轉膜液，或超大的膠），時間一般（常規(guī)用）；如果是，時間不要超過。這兩款儀器的限壓要求，可能出于保護儀器的目的；為防止過載，當電壓，附近的時候，保險會自動跳掉、切斷電轉儀電源。至于的，即使整張大板膠室溫電轉以后，最大電壓仍為（因此足見其散熱性能的優(yōu)良）。注明：以上半干轉儀時間的要求是針對

23、膜的，這里面有一個很有趣的問題。盡管廠家一再表明膜比膜對蛋白的截留更高（但帶負電性，理論上它的吸附量應該更高，所以通常同樣使用這種低鹽洗液背景比膜高），但膜對小分子的截留明顯不如膜，因此交聯(lián)在預染上的顏料小分子很容易穿過膜，造成轉膜過度的假象（除可考慮提升甲醇濃度至外，也可以考慮增加的上樣量）；膜沒有這種問題，所以通常它的轉膜時間也是小蛋白、大蛋白，電流控制在0大膠，如果膠面積小很多可以考慮降低，實際上相當于左右）。膜唯一不如膜的地方，在我看來是它的強度：干燥的膜易碎。當然目前某些廠家為解決這個問題，將成分涂在另一種介質的表面，這種膜的支持強度和膜類似，但轉膜效率稍差于純膜，且有明顯的正反面；

24、因此制作轉印三明治的時候要特別注意正反面。此外，以下的蛋白宜采用孔徑的轉印膜，但也不是一定必須。對于大蛋白轉印，很多書本建議采用低濃度膠，如。但實際操作發(fā)現(xiàn)，太軟，制作轉印三明治的操作非常麻煩；且內參如、都在附近，而膠底邊溴酚藍指示左右，除非采用壇子上有人提過的灌不同濃度的膠或者梯度膠，否則需要同時跑兩塊膠，因此也不是很推薦。個人經(jīng)驗認為以下膠（底邊）都可以勝任，可以適當調整選擇膠可以兼顧內參和大蛋白。轉膜最好在低溫進行（高溫會局部溶膠或降低轉膜效率），盡管很多半干轉儀沒有具體要求，但用預冷過的電轉液濕濾紙比未預冷的轉印效率更高。因此，有條件建議濕轉、半干轉均在低溫（4度）進行。此外，濕轉緩沖

25、液可以考慮轉印前度預冷，時間不能長于，否則電泳液凍結；型有內置冰槽的，冰槽置度預冷。制作轉膜三明治的過程中，書中強調過濾紙、膠、膜的大小最好一致，否則沒有膠、膜隔開部分的濾紙會因為直接接觸而產生局部短路，降低內阻增加電（壓）流，造成升溫過快。但進口儀器隨廠原包裝附帶的濾紙有限，如果每次都切割新濾紙，消耗過快、初次使用的膜轉膜效率不高，且增加額外的操作。因此，實際上濾紙大一些也不太要緊，但是我會選擇已經(jīng)切割好的和膠面積最接近的濾紙；通常膜的大小會嚴格控制在與膠面積一致或略小一點點。操作時在保證每一層均無氣泡的前提下，疊好后再碾壓幾個來回，力道要均勻、恰好；力量過大，膠會被拉伸，條帶會扭曲、變形。

26、碾壓的目的不是為了驅趕氣泡（完全可以做到疊加的時候每一層都無任何氣泡；諸如采用多層薄濾紙時可以一張張的疊加），更重要的作用是讓膜和膠貼得更緊密?？梢岳斫獾氖?，對于蛋白分子的大小而言，膠和膜之間的間距是數(shù)十萬倍計的，因此更緊密的接觸無疑是轉膜成敗的關鍵。膠和膜需不需要泡呢？不少公司實驗講座時提出泡膠、泡膜，實際操作中沒有發(fā)現(xiàn)泡和不泡的轉膜效率有多大差別。實際上，膠只需要在電轉液中浸一下即可（可以減少與濾紙或者膜之間的氣泡）；而膜也只要濕掉沾上電轉液即可，同樣多沾些緩沖液會有利于減少氣泡（要先用甲醇濕潤再投入緩沖液；直接進緩沖液）如何監(jiān)控轉膜的效率呢？在早期，鄙人亦依據(jù)分子克隆的介紹，采用立春紅染

27、膜。只是后來發(fā)現(xiàn)此操作不僅增加額外的操作時間，而且不能說明任何問題，于是拋棄之。首先，立春紅（也包括考染膠）的靈敏度和體系的靈敏度相差太遠，即使立春紅染膜無顏色，也無法提示結果會不會失敗（考染膠無顏色也不能說明轉膜充分了，除非你銀染），你仍然得繼續(xù)后面的操作；相反靶蛋白區(qū)域有顏色，亦無法提示靶蛋白就轉膜完全了，也許只是另外一個分子量大小相近的蛋白。因此，無論立春紅染膜失敗或成功，你都必須進行后續(xù)的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時間，而且增加一輪漂洗的操作，對膜和膜上的蛋白都不好。那么為什么不采用更直觀的預染做轉膜監(jiān)控的依據(jù)呢？理論上，同時轉膜、顏色是交聯(lián)到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多

28、少蛋白轉印到膜上，非常直觀、不會增加任何額外的操作（固定的上樣量非常必要）。當然上面提到針對膜，由于對小分子截留的局限，顏料分子會在高強度的轉印過程中從交聯(lián)的蛋白上脫落并穿過膜（顏料與蛋白交聯(lián)得過深會使整個糊掉；太緊（多）可改變蛋白構象使遷移率改變。所以多數(shù)情況下顏料和蛋白之間是一種不穩(wěn)定的交聯(lián)，這意味著在某些條件下，顏料會從交聯(lián)的蛋白上脫落，又因為膜分子孔徑以及膜對不同物質吸附能力的差異，顏料小分子會輕易穿過膜到濾紙背面，而蛋白則被牢固的截留在膜上），造成轉膜過度的假象。現(xiàn)在你知道有這種局限，要么更換膜；要么采用上面提到的非常穩(wěn)定的轉膜條件、注意必要的細節(jié)，就可從根本上忽略掉其對轉膜效率的指

29、示，而把預染的僅僅作為一個分子量大小的指針，當然同時可確認之前的轉膜操作無誤（沒有插反電極，放反膜），也可為后續(xù)抗體孵育操作時膜的正反面做必要的提示。不同公司預染的m效果不太相同，一般B和的常規(guī)分子量預染m要上80MBI的只要（膠大小20X30cm）,Bm型3（8.2X7.4cm）MBI最低2.轉膜后就足夠清晰?？贵w孵育B真正的難點：抗體的使用是一種藝術，一種抗體一個脾氣。對B結果有決定性影響的因素是抗體的效價和如果正確使用手中的抗體。無論你如何提高自己的轉膜技術，高效和低效之間往往只有數(shù)倍的差異，而抗體的效價可以差數(shù)千倍以上；同樣，正確使用抗體可以保證抗體效價不被過分的拮抗，謀求特異性和非特

30、異性背景之間差異的最大化。封閉最短可以縮減到m：很多人把高背景或者黑板，認定為封閉不充分，其實這也是沒有吃透B（說實話，經(jīng)?？吹綁由虾芏嗳诉@樣給人答疑，非常的無語）；實際上封閉（極端點）也是個可有可無的步驟，真正對降低背景起核心作用的是抗體稀釋液中的組分。當你的抗體使用次數(shù)較多時，基本不用封閉也可以有較低的背景；如果抗體很新，其實封閉最短可以縮減到m（沒試過更短的，不一定不可以）。那什么導致高背景甚至黑板呢？抗體的質量不太好（主因），或者抗體稀釋液的配方有問題（增大抗體稀釋比略微有所改善）。封閉液的配方可以和抗體稀釋液相同，也可以不同；通常封閉液是最簡單（單方）的抗體稀釋液，而抗體稀釋液可能是復方。封閉很少出狀況。不過在m做封閉劑的封閉液中，m顆粒未完全溶解時，微小的顆粒會粘附在膜上增加星點狀背景緊接封閉操作的是抗體孵育，之間不要用漂洗。抗體孵育成敗的關鍵首要在抗體本身的質量，包括抗體的效價和背景的強弱，然而歷來商品化的抗體質量參差不齊。各家生產的抗體中質量問題最嚴重的是的抗體，但它們的價格卻是最便宜的。其實，在美國的售后服務還是相當不錯的，只要按他們的要求操作仍然能舉證抗體的質量問題，可以更換、交換（你指