乳酸菌檢驗(yàn)操作規(guī)范培訓(xùn)匯總課件

1、乳酸菌檢驗(yàn)操作規(guī)范培訓(xùn)質(zhì)量管理部目錄一、乳酸菌二、儀器設(shè)備三、 培養(yǎng)基四、無菌室準(zhǔn)備五、接種培養(yǎng)六、菌落計(jì)數(shù)七、乳酸菌在改良MC培養(yǎng)基上菌落特征八、過氧化氫酶試驗(yàn)一、乳酸菌1、乳酸菌的概念乳酸菌一詞并非生物分類學(xué)名詞，而是指能夠利用發(fā)酵性糖類產(chǎn)生大量乳酸的一類微生物的統(tǒng)稱。通常將乳酸細(xì)菌之類群稱為乳酸菌。2、乳酸菌主要分布乳桿菌屬（Lactobacillus） 鏈球菌屬（Streptococcus）明串珠菌屬（Leuconostoc）片球菌屬（Pediococcus）雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）（一）乳桿菌屬（Lactobacillus）1乳桿菌屬的形態(tài)特征 細(xì)胞呈桿狀，多為長

2、桿狀、短桿狀及棒桿狀，一般成短鏈排列。革蘭氏染色陽性，通常不運(yùn)動(dòng)，無芽孢。2乳桿菌屬的生物學(xué)特點(diǎn) 化能異養(yǎng)型，營養(yǎng)要求嚴(yán)格，生長繁殖需要多種氨基酸、維生素、肽、核酸衍生物。 厭氧、耐氧性厭氧或兼性厭氧 生長最適pH為5.56.2，在pH5的環(huán)境中可生長，而中性或初始?jí)A性條件下生長速率降低。生長溫度范圍，253，最適生長溫度3040。 3乳桿菌屬的代表種 3.1保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）細(xì)胞形態(tài)長桿狀，兩端鈍圓。固體培養(yǎng)基生長的菌落呈棉花狀，易與其它乳酸菌區(qū)別。能利用葡萄糖、果糖、乳糖進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生D型乳酸（有酸澀味，適口性差），不能利用蔗糖。該菌是乳酸菌中產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的菌

3、種。蛋白質(zhì)分解力較弱，發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)乙醛。最適生長溫度3745，溫度高于50或低于20不生長。常作為發(fā)酵酸奶的生產(chǎn)菌。 3.2嗜酸乳桿菌（L.acidophilus） 細(xì)胞形態(tài)比保加利亞乳桿菌小，呈細(xì)長桿狀，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。最適生長溫度37，20以下不生長，耐熱性差。蛋白質(zhì)分解力較弱。 最適生長pH 5.56.0，耐酸性強(qiáng)，能在其它乳酸菌不能生長的酸性環(huán)境中生長繁殖。嗜酸乳桿菌是能夠在人體腸道定殖的少數(shù)有益微生物菌群之一，其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸和抗菌物質(zhì)乳桿菌素可抑制病原菌和腐敗菌的生長。 （二）鏈球菌屬（Streptococcus）1鏈球菌屬的形態(tài)特

4、征 細(xì)胞呈球形或卵圓形，成對(duì)或成鏈排列。革蘭氏染色陽性，無芽孢，一般不運(yùn)動(dòng)，不產(chǎn)生色素。2鏈球菌屬的生物學(xué)特點(diǎn) 化能異養(yǎng)型，同型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生右旋乳酸；兼性厭氧型，接觸酶反應(yīng)陰性，厭氧培養(yǎng)生長良好。 3鏈球菌屬的代表種 嗜熱鏈球菌（St.thermophilus） 細(xì)胞形態(tài)呈鏈球狀。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生乳酸 。蛋白質(zhì)分解力較弱，在發(fā)酵乳中可產(chǎn)生香味物質(zhì)雙乙酰。 該菌主要特征是能在高溫條件下產(chǎn)酸，最適生長溫度4045，溫度低于20不產(chǎn)酸。耐熱性強(qiáng)，能耐6568的高溫。（三）明串珠菌屬（Leuconostoc） 菌落一般小于1.0mm，光滑、圓形、灰白色 細(xì)胞球形或豆?fàn)?，成?duì)或

5、成鏈排列 。革蘭氏染色陽性，不運(yùn)動(dòng)，無芽孢。（四）雙歧桿菌屬（Bifidobacterium） 1雙歧桿菌屬的形態(tài)特征 細(xì)胞呈多樣形態(tài)：Y字型、V字型、彎曲狀、勺型，典型形態(tài)為分叉桿菌 革蘭氏染色陽性，亞甲基蘭染色菌體著色不規(guī)則。無芽孢和鞭毛，不運(yùn)動(dòng)。 2雙歧桿菌屬的生物學(xué)特點(diǎn) 化能異養(yǎng)型，對(duì)營養(yǎng)要求苛刻，生長繁殖需要多種雙歧因子 。能利用葡萄糖、果糖、乳糖和半乳糖，生成乳酸和乙酸及少量的甲酸和琥珀酸。 蛋白質(zhì)分解力微弱。專性厭氧，但不同菌種或菌株對(duì)氧的敏感性存在差異，多次傳代培養(yǎng)后，菌株的耐氧性增強(qiáng)。生長溫度范圍2545，最適生長溫度37。生長pH值范圍4.58.5，最適生長起始pH值6.5

6、7.0，不耐酸，酸性環(huán)境（pH5.5）對(duì)菌體存活不利。 3、代表種 人體腸道中共有8種，其中數(shù)量最多的5種為：兩歧雙歧桿菌（B.bifidum）嬰兒雙歧桿菌（B.infantis）青春雙歧桿菌（B.adolescentis）長雙歧桿菌（B.longum）短雙歧桿菌(B.breve)4、雙歧桿菌功能是人體腸道有益菌群，它可定殖在宿主的腸粘膜上形成生物學(xué)屏障 具有拮抗致病菌、改善微生態(tài)平衡、合成多種微生素、提供營養(yǎng)、抗腫瘤、降低內(nèi)毒素、提高免疫力、保護(hù)造血器官、降低膽固醇水平等重要生理功能，其促進(jìn)人體健康的有益作用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其它乳酸菌。 二、檢測儀器設(shè)備 冰箱：04恒溫培養(yǎng)箱：361恒溫水浴鍋：4

7、61微生物顯微鏡架盤藥物天平：0g500g，精確至0.5g三角瓶：500ml滅菌刻度吸管：1ml、10ml 滅菌平皿：直徑90mm三、 培養(yǎng)基 1、改良MC培養(yǎng)基 成分：大豆蛋白胨，5g；牛肉浸膏，5g;酵母浸膏，5g；葡萄糖，20g；乳糖， 20g；碳酸鈣， 10g；瓊脂，15g；蒸餾水，1000mL；1的中性紅溶液，5mL；硫酸多粘菌素B，10萬IU。 11515分鐘高壓滅菌備用。2、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備使用前，將滅菌培養(yǎng)基用微波爐或水浴鍋加熱溶解，在4045水浴中保溫待用。四、無菌室準(zhǔn)備無菌室使用前后，用紫外燈照射3040min。將工作服、工作帽和工作鞋放入無菌室進(jìn)行滅菌，進(jìn)入無菌室前換上工作服

8、、工作帽和工作鞋。超凈工作臺(tái)面，使用前用75%酒精擦拭消毒后，用紫外燈照射4045min；操作結(jié)束后，用潔凈抹布將操作臺(tái)面擦拭干凈后，用75%的酒精棉球進(jìn)行擦拭，開啟紫外燈照射4045min。五、接種培養(yǎng) 以無菌操作，用1ml滅菌刻度吸管吸取1ml樣品原液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，充分振搖，制成1:10的稀釋液。注意：刻度吸管尖端不要觸及試管內(nèi)生理鹽水。用1ml滅菌刻度吸管吸取1ml1:10的稀釋液，注入含有滅菌生理鹽水的試管內(nèi)，振搖試管，混合均勻。注意：吸取稀釋液前，用刻度吸管吹打，使稀 釋混合均勻。刻度吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液。另取1ml滅菌刻度吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀

9、釋液，如此每遞增一次，即換用1支1ml滅菌刻度吸管。在無菌操作條件下，用1ml滅菌刻度吸管吸取選定的樣品稀釋液或原液至滅菌平皿內(nèi)。 同上對(duì)同一樣品重復(fù)操作，即每個(gè)選定的適當(dāng)?shù)臉悠废♂屢鹤鰞蓚€(gè)平皿。 按以上步驟，以1ml滅菌生理鹽水作為空白操作對(duì)照。 在無菌操作條件下，將約15ml的改良MC培養(yǎng)基傾入樣品平皿中，將平皿置于操作臺(tái)面上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使樣品和培養(yǎng)基混合均勻。 接種培養(yǎng)操作錄像檢測乳酸菌檢測.MPG討論錄像中存在細(xì)節(jié)問題：1、拿平板前先消毒手2、倒培養(yǎng)基前要對(duì)培養(yǎng)基的瓶進(jìn)行消毒，可以酒精棉球消毒和酒精燈外焰消毒。待培養(yǎng)基凝固后，將平皿翻轉(zhuǎn)，即有培養(yǎng)基的一面向上。 將所有平皿置于361培養(yǎng)箱

10、中，培養(yǎng)723h，觀察乳酸菌菌落特征。 六、菌落計(jì)數(shù) 選取菌落數(shù)在30300之間的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。 計(jì)數(shù)后，隨機(jī)挑取五個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡檢查并做過氧化氫酶試驗(yàn)。 革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽孢的球菌或桿菌可定為乳酸菌。根據(jù)證實(shí)為乳酸菌菌落計(jì)算出該皿內(nèi)的乳酸菌數(shù)，乘以其稀釋倍數(shù)即得每毫升樣品中乳酸菌數(shù)。例如檢樣10-4的稀釋液在改良MC平板上，生成可疑菌落為35個(gè)，取五個(gè)鑒定，證實(shí)為乳酸菌的是四個(gè)，則1ml樣品中乳酸菌數(shù)為：35*4/5*104=2.8*105。 七、乳酸菌在改良MC培養(yǎng)基上菌落特征菌體改 良 MC桿菌平皿底為粉紅色，菌落較小，圓形、紅色、邊緣似星狀，直徑2mm1mm，可有淡淡的暈球菌平皿底為粉紅色，菌落較小，圓形、紅色、邊緣整齊，可有淡淡的暈八、過氧化氫酶試驗(yàn) 試劑：3%過氧化氫，臨用時(shí)配制試驗(yàn)方法 挑取固體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán),置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液2ml，觀察結(jié)果.結(jié)果判斷：于半分鐘內(nèi)產(chǎn)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性。人