固定化酶技術(shù)

1、關(guān)于固定化酶技術(shù)第一張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1 原理2 特點3 制備方法4 應(yīng)用5 發(fā)展趨勢及建議第二張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月水溶性酶1 原理 水不溶性載體固定化技術(shù) 水不溶性酶 （固定化酶） 第三張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 2 特點穩(wěn)定性高；酶可反復(fù)使用；產(chǎn)物純度高，極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開；固定化酶的反應(yīng)條件易于控制生產(chǎn)可連續(xù)化和自動化，節(jié)約勞動力；設(shè)備小型化、可節(jié)約能源。固定化酶同自由酶相比，具有以下優(yōu)點：第四張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月缺點：固定化所需載體和試劑較貴，成本高，投資大固定化時，酶活力有損失長期生產(chǎn)，易

2、污染，載體易降解，酶易失活只能用于可溶性底物，較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)第五張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 3 制備方法必須注意維持酶的催化活性及專一性。酶與載體的結(jié)合部位不應(yīng)當是酶的活性部位（酶活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化）避免那些可能導致酶蛋白高級結(jié)構(gòu)破壞的條件。由于酶蛋白的高級結(jié)構(gòu)是憑借氫鍵、疏水鍵和離子鍵等弱鍵維持，所以固定化時要采取盡量溫和的條件，盡可能保護好酶蛋白的活性基團?；驹瓌t：第六張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化應(yīng)該有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化。載體能抗一定的機械力。固定化酶應(yīng)有最

3、小的空間位阻。酶與載體必須結(jié)合牢固，利于固定化酶的回收及反復(fù)使用。固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學反應(yīng)。固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。第七張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1 固定化酶的傳統(tǒng)制備方法3.1.1吸附法吸附法是利用物理吸附法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式。顯著特點是：工藝簡便及條件溫和，包括無機、有機高分子材料，吸附過程可同時達到純化和固定化；酶失活后可重新活化，載體也可再生。但要求載體的比表面積要求較大，有活潑的表面。3.1.2包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等

4、多空載體中，而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸。這個方法比較簡便，酶分子僅僅是被包埋起來，生物活性被破壞的程度低，但此法對大分子底物不適用。第八張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)網(wǎng)格型將酶包埋在凝膠細微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法。(2)微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。由于形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。第九張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1.3結(jié)合法酶蛋白分子上與不溶性固相支持物表面上通過離子鍵結(jié)合而使酶固定的方法，叫離子鍵結(jié)合法。其間形成化學共價鍵結(jié)合的固定化方法叫共價鍵

5、結(jié)合法。共價鍵結(jié)合法結(jié)合力牢固，使用過程中不易發(fā)生酶的脫落，穩(wěn)定性能好。該法的缺點是載體的活化或固定化操作比較復(fù)雜，反應(yīng)條件也比較強烈，所以往往需要嚴格控制條件才能獲得活力較高的固定化酶。第十張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月1.4交聯(lián)法交聯(lián)法是用多功能試劑進行酶蛋白之間的交聯(lián)，使酶分子和多功能試劑之間形成共價鍵，得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在著一定的分子內(nèi)交聯(lián)。多功能試劑制備固定化酶方法可分為：(1) 單獨與酶作用；( 2) 酶吸附在載體表面上再經(jīng)受交聯(lián)；( 3) 多功能團試劑與載體反應(yīng)得到有功能團的載體，再連接酶。交聯(lián)劑的種類很多，最常用的是戊二醛，其他的

6、還有異氰酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N，N-乙烯馬來酰亞胺等。交聯(lián)法的優(yōu)點是酶與載體結(jié)合牢固，穩(wěn)定性較高；缺點是有的方法固定化操作較復(fù)雜，進行化學修飾時易造成酶失活。第十一張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2固定化酶的新型制備方法3.2.1共價固定法酶分子表面存在很多可供利用的化學基團。選擇性地利用酶分子表面遠離活性位點的特定稀有基團(如巰基)進行反應(yīng)，使該基團與載體上另一基團共價交聯(lián)來同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達到控制其空間取向的目的。3.2.2氨基酸置換法利用基因定點突變技術(shù)在蛋白質(zhì)分子表面合適位置置換一個氨基酸分子，通過該氨基酸殘基特殊的側(cè)鏈基團控制固定方向。通過

7、定點突變在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子表面遠離活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)殘基。經(jīng)蛋白質(zhì)空間折疊后暴露出Cys，然后利用Cys殘基上的巰基固定枯草蛋白酶分子，取得了較好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。第十二張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2.3抗體耦聯(lián)法大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法?？贵w分子中很多可供偶聯(lián)用的官能團可以通過賴氨酸的-氨基或末端氨基、天冬氨酸的-氨基、谷氨酸的-氨基或末端羧基進行一般性的偶聯(lián)。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠來定向固定抗體酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗體酶Fab

8、片段保持了很好的催化活性?？贵w分子Fc區(qū)的糖鏈部分氧化可產(chǎn)生醛基，醛基與載體上的氨基通過縮合反應(yīng)可實現(xiàn)定向固定。醛基若與載體上的酰肼通過腙鍵結(jié)合實現(xiàn)抗體分子的定向固定，與隨機固定相比，固定后抗體穩(wěn)定性提高的同時免疫吸附活性也提高了3倍。3.2.4生物素-親和素親合法生物素是存在于所有活細胞內(nèi)但含量甚微(00001)的中性小分子輔酶。親和素是一個含有四個相同亞基的四聚體，每個亞基均含一個生物素結(jié)合位點(解離常數(shù)105molL) 。生物素與親和素或相應(yīng)細菌中的鏈霉親和素有高專一性的、極強的親和力。這種特性使其成為免疫分析、受體研究、免疫組織化學、基因工程和蛋白質(zhì)分離等領(lǐng)域中獨特有力的工具。Min等

9、將生物素羧化載體蛋白、片段分別融合在熒光素酶和氧化還原酶的N末端，然后將這兩個融合蛋白定向固定在親和素包被的瓊脂顆粒上。熒光活性提高了8倍，固定化酶的穩(wěn)定性和固定效率均大大提高。第十三張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4 應(yīng)用4.1 在食品中的應(yīng)用4.2 在環(huán)境工程中的應(yīng)用4.3 醫(yī)學和臨床分析的應(yīng)用第十四張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.1 在食品中的應(yīng)用4.1.1 固定化木瓜蛋白酶應(yīng)用于啤酒澄清長期放置的啤酒會由于多肽和多酚物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)而變得混濁。為防止出現(xiàn)混濁，目前主要是采取向啤酒中添加蛋白酶來水解啤酒中的蛋白質(zhì)和多肽，但水解過度會影響啤酒保持泡沫的性能。Witt

10、等1970年用戊二醛交聯(lián)將木瓜蛋白酶固定化制成反應(yīng)柱，生產(chǎn)所得啤酒在長期貯存中可保持穩(wěn)定。Finely 等人報道，用幾丁質(zhì)固定的木瓜蛋白酶可用于啤酒的大罐冷藏或過濾后裝瓶進行處理，通過調(diào)節(jié)流速(酶柱法)和反應(yīng)時間(分批法)，可以精確控制蛋白質(zhì)的分解程度。處理后的啤酒和固定化酶易分開，固定化酶可以多次反復(fù)使用，極為經(jīng)濟。經(jīng)處理后的啤酒在風味上與傳統(tǒng)的啤酒無明顯差異。第十五張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.1.2 固定化酶用于水解牛奶中的乳糖牛奶中含有4.34.5的乳糖，患乳糖缺乏癥的人飲用牛奶后將導致不良后果，用乳糖酶可以將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖。用固定化乳糖酶反應(yīng)器可以連續(xù)處理牛

11、奶，將乳糖分解。此外，固定化乳糖酶還可以用來分解乳糖，制造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖漿。乳糖在溫度較低時易結(jié)晶，用固定化乳糖酶處理后，可以防止其在冰激淋類產(chǎn)品中結(jié)晶，改善口感，增加甜度。第十六張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.1.3 固定化葡萄糖異構(gòu)酶在高果糖漿生產(chǎn)中的應(yīng)用固定化葡萄糖異構(gòu)酶是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種，它可以來催化玉米糖漿和淀粉生產(chǎn)高甜度的高果糖漿。自1972年這技術(shù)產(chǎn)生以來，科學家已經(jīng)固定了幾種芽孢桿菌和鏈霉菌中提的葡萄糖異構(gòu)化酶，并大量應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中，今后幾十年中它將是應(yīng)用最廣，市場份額最大的固定化酶。第十七張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.1.4

12、 固定化酶法脫去柑桔類果汁中的苦味柑桔類加工產(chǎn)品出現(xiàn)過度苦味是柑桔加工業(yè)中較重要的問題。造成苦味的物質(zhì)主要是二類：一類為檸檬苦素的二萜烯二內(nèi)酯化合物(A 環(huán)和B 環(huán))；另一類為果實中多種黃酮苷。脫去苦味的方法有：吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味物質(zhì)，而酶法脫苦主要是利用不同的酶分別作用于檸檬苦素和柚皮苷，生成不含苦味的物質(zhì)。工廠生產(chǎn)中常采用固定化柚皮苷酶減少柑桔類果汁中的柚皮苷含量。Tsen等在1989 年使用甲殼素固定柚皮苷酶，并且研究了固定化的動力學因子。Manjon等14使用空心玻璃床作為載體，分別在1977 年使用DEAE-Sephadex，1978 年使用單寧-2- 氨基乙基

13、纖維作為載體。1996 年P(guān)uri等使用海藻糖，1998年Soures等使用醋酸纖維和三醋酸纖維制成膜固定酶。第十八張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月酶法去除苦味物質(zhì)因為酶的生物活性特征而使其應(yīng)用受到很多限制。為了在不改變底物理化性質(zhì)條件下，使酶保持最大活性，通常要注意以下幾個問題：固定化材料的選擇；固定率；固定化后的酶活性；最適pH值；溫度對酶活性的影響；酶在不同濃度果汁中受到的抑制作用；酶的保存。第十九張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.1.5 固定化酶技術(shù)應(yīng)用于食品檢測固定化酶技術(shù)的發(fā)展使生物傳感器應(yīng)運而生。而它的問世不僅使食品成分的快速、低成本、高選擇性分析測定成為可

14、能，而且生物傳感器技術(shù)的持續(xù)發(fā)展將很快實現(xiàn)食品生產(chǎn)的在線質(zhì)量控制，降低食品生產(chǎn)成本，并給人們帶來安全可靠及高質(zhì)量的食品。生物傳感器的核心元件就是其分子識別元件，即由生物活性物質(zhì)經(jīng)固定化后形成的敏感膜。Kurube用酶傳感器測定了豬肉新鮮度；日本農(nóng)林水產(chǎn)省研制出的滋味傳感器，可品嘗肉湯風味，用于肉湯生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制；Fernando采用電導型生物傳感器來檢查食品中有機農(nóng)藥的污染。第二十張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.2 在環(huán)境工程中的應(yīng)用4.2.1 用于有機廢水處理污水處理中常用的酶有辣根過氧化物酶、漆酶、酪氨酸酶等。這些酶可降解有機廢水中毒性很強的酚類。利用固定化辣根過氧化物酶

15、去除污水中的4-氯酚，去除率高達80%。用殼聚糖微球固定化辣根過氧化物酶處理含酚廢水，并考察酚濃度對去除率的影響。研究表明，酚濃度低于100 mg/L 時，酚的去除率達90%以上，隨著酚濃度的增加，酚的去除率逐漸下降。第二十一張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月用固定化酶處理受污染水體中的農(nóng)藥也取得了很好的效果。用聚丙烯負載二氧化鈦膜固定農(nóng)藥降解酶，降解農(nóng)藥甲基對硫磷。研究發(fā)現(xiàn)，甲基對硫磷在30 min 內(nèi)降解了70%以上。尤其等以殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，固定化真菌漆酶對農(nóng)藥氯苯嘧啶醇進行降解。研究認為，在酸性條件下，固定化漆酶對氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。第二十二張，PPT共三

16、十五頁，創(chuàng)作于2022年6月“用于污染水源修復(fù)的固定化酶復(fù)合材料及其制備方法”發(fā)明專利也用到了固定化酶。這種復(fù)合材料造價低，廣泛應(yīng)用于廢水處理工程，是一種經(jīng)濟實用、前景廣闊的新型環(huán)保材料，具有綜合交叉學科集成創(chuàng)新的特點， 為環(huán)保領(lǐng)域水處理工程技術(shù)帶來嶄新的突破。聯(lián)合固定化技術(shù)使酶的特性得到了更好的發(fā)揮，擴展了固定化酶的應(yīng)用范圍。將脫色酶與苯胺降解菌混合固定用來處理染料廢水。結(jié)果表明， 脫色率及苯胺降解率分別達到80%和90%以上。用苯酚甲醛樹脂吸附結(jié)晶型枯草桿菌淀粉酶處理造紙廠廢水，廢水在反應(yīng)器中停留4.5 h，可去除廢水中78%的懸浮膠態(tài)淀粉。第二十三張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6

17、月4.2.2 用于環(huán)境污染物的監(jiān)測由固定化酶制成的酶反應(yīng)器可以直接或與其他檢測器組成酶電極、酶傳感器等分析檢測系統(tǒng)來實現(xiàn)對環(huán)境污染物的監(jiān)測。由于農(nóng)藥的面源污染、未經(jīng)處理的污水直接灌溉等問題， 食品中的有毒有害物質(zhì)成為環(huán)境監(jiān)測對象。固定化酶技術(shù)可以實現(xiàn)對食品中有害物質(zhì)的有效檢測。用固定化草酸氧化酶完成了對河豚魚中河豚毒素的快速檢測。用聚乙烯醇苯乙烯吡啶固定乙酰膽堿酯酶， 與搗碎提取設(shè)備、酶標儀組合了一套檢測設(shè)備，對200 多個蔬菜樣品進行了成功的檢測。第二十四張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.2.3 其他應(yīng)用CO2是一種重要的溫室氣體。目前全球每年排放的數(shù)十億噸CO2需要得到妥善的處

18、置。固定化酶技術(shù)在固定CO2方面也取得了成果。據(jù)報道，以工業(yè)固體廢棄物為原料， 利用固定化碳酸酐酶和超重力強化反應(yīng)可得到CO2的有效固定固定化酶技術(shù)在清潔生產(chǎn)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于紙漿漂白， 可以避免產(chǎn)生傳統(tǒng)造紙工藝過程中用氯漂白產(chǎn)生的難以生物降解的各類氯代有機物。第二十五張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶技術(shù)還在污水生物處理工藝中得到了應(yīng)用。用大孔樹脂固定水解酶類到兩相厭氧反應(yīng)器中處理黃漿廢水。對厭氧濾池中的以納米改性陶粒為載體固定化木瓜蛋白酶開展研究，都取得了一系列相應(yīng)的成果。第二十六張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月4.3 固定化酶在醫(yī)

19、藥治療上的應(yīng)用溶液酶的應(yīng)用缺陷：酶作為異體物質(zhì)，在體內(nèi)應(yīng)用會導致免疫反應(yīng)酶是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和被蛋白質(zhì)酶水解破壞由于稀釋效應(yīng)，藥物酶無法集中于靶器官組織以達到治療所需的最適高濃度 第二十七張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 （1）轉(zhuǎn)入體內(nèi)發(fā)揮作用（口服和注入） 口服：最初主要限于消化酶類，近年來也有人嘗試將酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治療?？诜膬?yōu)點是藥物通過粘膜吸收后能迅速進行擴散，進入體內(nèi)，通常不會引起免疫反應(yīng)。注入：是最有實用價值的一種方式，溶液酶的弱點集中于此方式。 固定化酶可很好的地解決這一問題，辦法是將藥物酶包埋于半透膜中，可防止藥物酶和蛋白水解酶以及其

20、它免疫因子等直接接觸，因而可延長酶在體內(nèi)的半衰期和避免免疫過敏反應(yīng)。第二十八張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 （2）通過“體外循環(huán)”做成人工臟器 固定化酶也可做成“人工臟器”參與體外循環(huán)， 應(yīng)用有兩方面：用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝產(chǎn)物除去氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織“餓死”；治療時只需將患者的血液引出體外，通過由固定化酶等構(gòu)成的“人工臟器”加以處理，然后再回流體內(nèi)。第二十九張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月實例： A. 消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內(nèi)失活。 用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進出。第三十張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月B.人工腎 將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用微膠囊固定化脲酶和活性炭組成人工腎。第三十一張，PPT共三十五頁，創(chuàng)作于2022年6月5 發(fā)展趨勢及建議隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，固定化酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用日益廣泛，但并不是說可以使用酶的地方，都可以用固定化酶來代替。在使用固定化酶技術(shù)時，也需要綜合考慮其制備工藝、酶回收率、可操作性、穩(wěn)定性及生產(chǎn)成本等方面的因素。我國目前食品加工企業(yè)使用該技術(shù)的現(xiàn)狀是，固定化酶的操作方法復(fù)雜、穩(wěn)定性較差，成本過高或使用了有毒的化學試劑而不符合食