植物組織培養(yǎng)中污染的分析及防控對策

1、.：.；植物組織培育中污染的分析及防控對策生物工程系 生物技術(shù)及運用 班 鄧雨瓊 學(xué)號：指點教師 趙軍摘要：預(yù)防和控制污染是植物組織培育苗工廠化消費中重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。本文從通常污染的防控、內(nèi)源性污染的防控、繼代培育中污染防控、改善培育基的成分等方面，分析了怎樣減少組織培育中出現(xiàn)的污染問題。從而到達(dá)降低消費本錢；減少對植株呵斥損傷；減少接種源及污染的機率等目的。關(guān)鍵詞：植物組織培育；污染；預(yù)防控制；對策The analysis and control of Contaminations in Tissue Culture of PlantAbstract: The technical to av

2、oid and control contaminations was important in tissue culture of plants. In that article, the factor was analysis to reduce rates and damages of the contaminations in plant tissue culture. Different measures (i.e. pretreatment of plant materials, surface sterilization and change the composition of

3、culture medium) were used to control contaminations of endogenesis and exogenous origination. As a result, the costs and damages to the plants were significantly reduced.Key words：Contamination; Elimination and Control; Measures; Plant tissue culture污染是在組織培育過程中培育基和培育資料繁殖雜菌，導(dǎo)致培育失敗的景象。它是影響植物組織培育的一個重要要

4、素，它通常會導(dǎo)致培育失敗呵斥很大的損失。植物組培苗的工廠化消費在我國開展速度很快，組織培育技術(shù)日趨完善，但在組織培育中通常會出現(xiàn)不同程度的污染，因此在市場競爭中，如何降低本錢是提高經(jīng)濟效益的首要問題，組織培育中污染率的添加引起組培苗本錢的提高，呵斥很大的經(jīng)濟損失，并對植株呵斥損傷，添加接種源及污染機率。因此,組織培育中降低污染率是工廠化消費中不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)。 污染的類型及緣由通常污染主要是外植體消毒不徹底，無菌操作和培育過程中，如：培育基、接種工具、接種室消毒不嚴(yán)厲或操作不規(guī)范而導(dǎo)致的污染。.病癥與來源在培育過程中，培育資料附近經(jīng)常出現(xiàn)黏液或混濁的水跡，并有發(fā)酵狀泡沫。這大多是細(xì)菌性污染，

5、主要是由于運用了未消毒好的工具及操作者呼吸時排出的細(xì)菌所引起的，或是操作人員的手接觸了資料或器皿邊緣所致；有時培育基上還會出現(xiàn)黃、白、黑等不同顏色的霉菌，這是真菌性污染，主要是由于接種室空氣污染呵斥的。 內(nèi)源性污染內(nèi)源菌包括真菌和細(xì)菌。在植物組織培育中，由于資料內(nèi)部的內(nèi)生菌不能被普通的外表消毒方法所去除，隨著資料進(jìn)入培育過程，引起的污染稱為內(nèi)生性污染或內(nèi)源性污染。許多植物外表或大氣中生存的微生物，可經(jīng)由植物自然的開口或傷口進(jìn)入植物內(nèi)部，而有一些兼性腐生菌或絕對寄生菌，可藉由載體或是擁有一些侵入的機制侵入植物內(nèi)部，使植物感染病原菌。.內(nèi)源性污染的種類從已有報道看，被鑒定的種類主要有：黃單胞菌屬、

6、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、土壤桿菌屬、棒狀桿菌屬、歐文氏菌屬等。真菌主要有霉菌。目前在各種農(nóng)作物及果樹等經(jīng)濟作物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌已超越種隸屬于個屬對于一種植物而言，從中分別到的內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌通常為數(shù)種至十種，有的還到百種之多，其主要出如今熱帶植物組織中。.內(nèi)源性污染的病癥和危害性在初代培育中，外表細(xì)菌引起的污染通常在d就能在外植體周圍或培育基外表構(gòu)成明顯的如水污狀、油污狀、氣泡或干縮的紅、黃、乳白等顏色的菌落。而在外植體培育后d內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染，以后那么相繼出現(xiàn)明顯的或不明顯的細(xì)菌菌落，就能夠是由內(nèi)生細(xì)菌引起的污染。在某些植物初代培育或前幾代的繼代培育中存在的污染，并不構(gòu)成明顯的菌落而只在

7、培育基內(nèi)部構(gòu)成“絲狀物，“暈狀物，不易被肉眼發(fā)現(xiàn)的，如不仔細(xì)察看很容易忽視，隨著繼代培育次數(shù)的添加，菌量不斷的積累，就會在培育基上表現(xiàn)出來。對于這種情況，他們可以利用背光檢查法去察看發(fā)現(xiàn)它。內(nèi)生細(xì)菌引起的危害主要包括在早期導(dǎo)致培育失敗，增殖效率降低，培育物生長減慢，玻璃化苗增多等。在后期導(dǎo)致試管苗移栽困難或死亡，有時污染也會引起培育物的遺傳變異。 污染所呵斥對組織培育消費的影響 消費本錢的提高 如呵斥人力、物力的浪費。 對植株呵斥損傷 如降低了植株的生命活力；影響其繁衍系數(shù)減少增殖倍數(shù)；降低商品苗的質(zhì)量。添加接種源及污染的機率 如真菌污染的滅菌不當(dāng)會呵斥空氣污染，從而添加接種源污染的機率。 通

8、常污染的防控對策. 操作污染和環(huán)境污染操作污染和環(huán)境污染指真菌污染和細(xì)菌污染。真菌污染主要來源于環(huán)境，細(xì)菌污染主要來源于接種資料及工具。此類污染可經(jīng)過如下措施加以抑制：. 無菌操作室及培育室的滅菌 每次接種前應(yīng)對接種室的地面進(jìn)展清潔衛(wèi)生任務(wù)，并用%的酒精噴霧使空氣中的灰塵沉降，并用紫外燈照射min。接種前任務(wù)臺面要用新潔爾滅或%酒精擦洗,運用超凈任務(wù)臺對接種環(huán)境污染的控制更有效果。但它應(yīng)置放在干凈的房間，窗戶密封，并定期清洗過濾膜，以延伸運用壽命。培育室的相對濕度應(yīng)控制在%左右，相對濕度太高可以用抽濕機除濕。接種終了后，應(yīng)進(jìn)展地面清潔衛(wèi)生任務(wù)，即先清掃一遍，再用濕布擦過，并定期用甲醛熏蒸接種室

9、。. 無菌操作和無菌操作技術(shù). 器皿與金屬器械的滅菌玻璃器皿的滅菌：可采用濕熱滅菌法，即將玻璃器皿包扎后置入蒸汽滅菌器中進(jìn)展高溫高壓滅菌，滅菌時間可長到min。也可采用干熱滅菌法，即將玻璃器皿置入電熱烘箱中進(jìn)展滅菌；還可以把玻璃器皿放入水中煮沸滅菌。金屬器械的滅菌：普通用火焰滅菌法，即把金屬器械放在%的酒精中浸一下，然后放在火焰上灼燒滅菌。這一步在無菌操作中有要反復(fù)進(jìn)展。. 布質(zhì)制品的滅菌任務(wù)人員運用的任務(wù)服、帽子、口罩等，要經(jīng)常堅持干凈，并定期進(jìn)展消毒。采用濕熱滅菌法，即將洗凈晾干的布質(zhì)品放人高壓滅菌器中在壓力.Mpa，溫度下滅菌min。. 操作人員在接種時一定要嚴(yán)厲按照無菌操作的程序進(jìn)展在

10、接種前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好再在新潔爾滅溶液中浸泡min，后用%的酒精擦手，并用%的酒精擦拭母種瓶外表進(jìn)展消毒，以防把微生物帶進(jìn)超凈任務(wù)臺。同時要求任務(wù)人員在接種時，最好不要感冒咳嗽和說話。操作人員操作動作要熟練、動作快、規(guī)范，這樣可以縮短操作時間，減少污染。由于有很多組織培育的失敗，從資料、培育基條件等方面檢查均無問題，只是由于操作技術(shù)不熟練，如脫毒培育抽取莖尖很小，操作時間長了就會使莖尖失水變干，或不慎感染雜菌。. 外植體的消毒.用莖尖作外植體時，要盡量選取帶菌少的資料，假設(shè)室外栽培的資料污染太嚴(yán)重，可先將植物樣本挖出，改為室內(nèi)盆栽，噴布?xì)⑾x劑和殺菌劑，不便移栽的，可套

11、塑料袋，待長出新枝條后，再行采樣接種。. 對污染嚴(yán)重的外植體，可以在培育基中參與殺菌劑。也可在菌類長入組織內(nèi)部時，除去韌皮組織，只接種內(nèi)部的分生組織可防止資料帶菌。. 外植體消毒常用藥劑有： %的酒精，.%.%的次氯酸鈉溶液和. %的升汞溶液等。選用何種滅菌劑和滅菌時間根據(jù)不同情況及操作者的閱歷來掌握，既要求將外植體外表的微生物徹底殺死，又要求盡能夠少損傷外植體組織和表層細(xì)胞。先用%的酒精棉花擦拭外植體資料再運用消毒藥劑常能獲得較好的消毒效果。常用消毒劑的消毒效果比較見表表 常用消毒劑的消毒效果比較消毒劑運用濃度%去除難易消毒時間min效果次氯酸鈣易很好次氯酸鈉易很好漂白粉飽和溶液易很好過氧化

12、氫最易好升汞.較難最好酒精易幾秒至幾分鐘好抗菌素(mg/L)中較好.檢查培育容器能否存在問題 培育容器封口多用塑料蓋、膠塞、棉塞、薄膜等，塑料蓋用久了易老化，密封性差，也會呵斥污染。同時，培育瓶在運用之前要洗凈，滅好菌的培育瓶不要放在空氣中太久，普通出鍋后d內(nèi)接完種最好，以減少培育瓶外表的微生物引起的污染。. 經(jīng)常檢查高壓滅菌鍋的滅菌質(zhì)量 消毒鍋的壓力表降到零后不能馬上出鍋。因冷熱空氣作用的負(fù)壓效應(yīng)，使外界環(huán)境的冷空氣倒吸入已滅菌好的培育瓶內(nèi)引起真菌污染，為防止該景象的發(fā)生，消毒后培育瓶應(yīng)留在鍋里，等冷卻后才出鍋。假設(shè)出現(xiàn)培育基呵斥的污染，就要及時地檢查滅菌鍋的性能或其他的問題。 內(nèi)源性污染的

13、防控對策.外植體的消毒.預(yù)栽管理 普通來說，溫室內(nèi)盆栽的植株比室外栽培的植株含菌少，為了能更好的降低污染率，可把室外栽培變?yōu)槭覂?nèi)盆栽。要求：盆栽用土應(yīng)運用不含有機質(zhì)及經(jīng)消毒的清潔土壤，尤其是要采集地下資料時，須用經(jīng)過消毒蛭石等作栽培基質(zhì)；施用無機肥，并對植物噴灑殺蟲劑和殺菌劑。不便移栽的，可套塑料袋，待長出新枝條后，再采樣接種。. 外植體預(yù)處置.促發(fā)新枝 將田間采集的枝條用水沖洗干凈后插入無糖的培育液或自來水中，使其發(fā)枝，后以這種新抽的嫩枝作為外植體，可大大減少內(nèi)源菌的污染。.黃化處置 在無菌條件下，對采自田間的枝條進(jìn)展暗培育，待抽出徒長的黃化枝條時取材，也可減少污染。這方法曾用于成年栗樹的枝

14、條和仙客來實生苗，減少了內(nèi)生細(xì)菌的污染。.熱療法及冷療法這種方法對對病毒較有效，但時間破費長。如熱療法處置時需個星期溫度在。.用抗生素進(jìn)展處置抗生素處置是目前常用的方法，如相思樹的莖段滅菌時，用皂液刷洗和%酒精殺菌后，轉(zhuǎn)入不同的抗生素溶液中，在搖床上振蕩過夜，再用%酒精和.%升汞分別殺菌min和min，滅菌效果以抑制劑ANB和ANB的抑制效果較好，未污染的分別為.%和.%；成活率分別為.%和.%。見表不同抗生素預(yù)處置對相思樹莖段的影響表 不同抗生素預(yù)處置對相思樹莖段的影響處置接種莖段數(shù)莖段數(shù)未污染比例%莖段數(shù)成活比例%ANB.ANB.頭孢拉定.林肯霉素.慶大霉素.對照CK.改良滅菌方法.真空減

15、壓滅菌 它是利用真空減壓抽走植物組織中的空氣，使消毒劑容易侵入，從而加強殺菌效果。減壓滅菌的效果明顯優(yōu)于常規(guī)滅菌，萬年青莖段經(jīng)過此法未污染率從常規(guī)的.%升到.%，成活率從常規(guī)的.%升到.%。見表常規(guī)滅菌與真空減壓來滅菌對萬年青莖段防止效果比較表 常規(guī)滅菌與真空減壓來滅菌對萬年青莖段防止效果比較處置接種莖段數(shù)莖段數(shù)(未污染)比例%莖段數(shù)成活比例%常規(guī)滅菌.減壓滅菌.磁力攪拌、超聲波振動法為減少在外植體外表構(gòu)成的氣泡，在浸泡時還可采用磁力攪拌和超聲波振動的方法。如對月季、蘋果的枝條，用.%升汞磁力攪拌min，再用無菌水磁攪拌清洗，污染率有所下降。.灼燒滅菌 利用火燒的方法殺死外植體外表的一切微生物

16、，以不損傷所要運用的組織或細(xì)胞為度。如將馬蹄蓮的根在%的酒精中浸泡min鐘后，短時間內(nèi)灼燒次，比常規(guī)消毒的污染率降低%。這種方法已用在綠色莢果、蒜的小鱗莖和雪白楊芽的消毒。.酸化培育基 除了歐文氏菌屬外，大多數(shù)細(xì)菌在介質(zhì)PH小于.時不能生長。在紫苑屬、鳶尾屬、薔薇屬植物組織中，將培育基的PH.降到.，可防止大量的細(xì)菌污染。.其他 多次消毒,如先用皂液對番木瓜側(cè)芽浸泡min，再用.%高錳酸鉀溶液處置min，然后進(jìn)展消毒處置，然后用%次氯酸鈉加.%升汞消毒，最后用無菌水洗，污染率降低為%左右；運用混合消毒液是用幾種消毒液(如多菌靈、抗壞血酸、檸檬酸、氯霉素等混合)對外植體時行處置，以降低污染率；在

17、培育基中參與其他抑菌劑如%多菌靈、%甲基托布津和%甲霜靈抑菌率也非常高。 繼代培育中污染的防控對策初代培育獲得的無菌資料在后期或繼代培育也能夠出現(xiàn)污染，這一方面是由于操作不慎的緣由，另即是由于初代培育中運用了營養(yǎng)相對簡單的培育基有能夠使污染不易表現(xiàn)出來，有時繼代資料在培育室那么能夠被螨傳播的真菌污染。這類污染可從以下兩個方面進(jìn)展防止：.擴展繁衍時應(yīng)有合理程序在獲得的無菌培育物之后，應(yīng)將其中一部分作為“原種保管起來，分批繁衍和復(fù)檢后再大規(guī)模消費。.可經(jīng)過在培育基中參與抗菌劑來防止對植物中的內(nèi)生細(xì)菌，由于它埋伏得較深，外表消毒方法無法將其消滅。有時在外植體的初級培育中，包括前幾代的繼代培育，往往在

18、培育基上不易被發(fā)現(xiàn)，隨著繼代次數(shù)的添加，菌量漸漸累積開展，才在培育基上顯現(xiàn)出來?？山?jīng)過在培育基中添加抗菌素，降低PH值等措施防止和減少細(xì)菌等內(nèi)生菌的污染 。如利用氨芐青霉素對迷他玫瑰的抑菌效果就很好，并且不會對不定芽的分化和植株呵斥明顯的影響。見表氨芐青霉素的抑菌效應(yīng)及對不定芽分化的影響 表氨芐青霉素的抑菌效應(yīng)及對不定芽分化的影響抗菌素 抗菌素濃 接種苗 分化 不定芽分 接種苗 當(dāng)代抑菌 次代抑 試管苗黃類別 度mg/L 總數(shù) 苗數(shù) 化率% 總數(shù) 率% 菌率% 化率%對照 氨芐青 . 霉素 . . 植物資料中的內(nèi)生菌，也可采用反復(fù)莖尖培育或分生組織培育的方法來脫除。因致病菌在植物體內(nèi)的分布不均

19、，且是經(jīng)過維管束傳播的，故莖尖分生組織是不帶菌的。因此，經(jīng)過反復(fù)的莖尖培育和分生組織培育，既可脫內(nèi)生菌又可脫毒。 改善培育基 在培育基中有一些高鹽或高糖的濃度可抑制微生物的生長，或有單寧酸的存在也可到達(dá)抑制效果。培育基中有機成分的存在是污染產(chǎn)生的重要緣由,去除有機物是減少污染的一條途徑。據(jù)相關(guān)資料報導(dǎo)，除去培育基中的VB、VB、煙酸等保管肌醇有機成分，經(jīng)代培育后，能抑制細(xì)菌生長，對叢生芽生長增殖沒有影響。緣由是這些都是某些細(xì)菌生長的必需物質(zhì)，去除這些有機成分后，細(xì)菌無法生長發(fā)育而漸漸死亡或減少。經(jīng)實驗，在羅漢果生根培育中，除去糖成分，在羅漢果苗生根時，可適當(dāng)加強光照，同時在接種時，要適當(dāng)?shù)亓粢?/p>

20、些小葉片，但不能讓葉片接觸到培育基，生根苗的生長都良好。由日本的古在豐樹教授首創(chuàng)的無糖組織快繁技術(shù)那么全部除去培育基中的有機成分，輸入可控制量的CO氣體作為碳源，并經(jīng)過控制環(huán)境因子，促進(jìn)植株光協(xié)作用速率，使之由異養(yǎng)型轉(zhuǎn)變成自養(yǎng)型，因此植物長勢良好，污染率明顯降低。 對植物組織培育中污染的預(yù)防與控制進(jìn)一步的思索.目前組培苗污染所遇到的問題為不易建立植株的干凈度，因此無法確定真正的污染源何處，無法對癥下藥。因此，在培育過程中要留意以下方面：()污染表現(xiàn)明顯的要將其選出并進(jìn)展滅菌()丟除病株，要知道病原菌才干從根本上加以消毒滅菌并進(jìn)展反復(fù)分生培育()只需無菌的植株可繁衍.熱療處置時間破費長，需花星期

21、，今后可加強這方面探求。.運用抗生素還存在一些缺陷即：()能夠?qū)θ诵笥泻?)假設(shè)是運用生長期較長的植物，微生物會產(chǎn)生抗藥性()容易出現(xiàn)沒有針對微生物而運用不同的抗生素錯誤()有些藥物會對試管苗有不同程度的毒害如呵斥葉片、葉柄及莖段的黃化，對不定芽分化和生根也有抑制。因此，在利用抗生素進(jìn)展處置時需留意以下幾個方面：()要知道抑制的微生物為何，再運用抗生素及對癥下藥()要決議最小抑制濃度，以降低本錢()要確定抗生素不會對植物呵斥并害或突變()確定抗生素在培育基上能否有作用()運用時，常因需求而多種混合或交替運用()有些抗生素在某些國家是制止運用，運用前必需做訊問此藥劑能否合法運用置信隨著技術(shù)的日趨

22、完善這些問題也會得到處理，就目前而言在污染的預(yù)防和控制上，無論是通常污染還是內(nèi)源性污染都需求從外植體的選擇及消毒滅菌入手，盡能夠的使資料不帶菌；再在各環(huán)節(jié)中采取相應(yīng)的有效措施如改良消毒方法，改善培育基的成分等。才干從根本上預(yù)防和控制污染，從而到達(dá)消費所需的目的。 參考文獻(xiàn)王青連.植物組織培育M. 北京:中國農(nóng)業(yè)，：.biotec.植物組織培育苗之污染與檢測EB/OL.biotec.bokee/.html . 星期二 : .周俊輝，周厚高，劉花全. 植物組織培育中內(nèi)生細(xì)菌污染問題J.廣西植物，()：.王青連.植物組織培育M. 北京:中國農(nóng)業(yè)，：.王青連.植物組織培育M 北京:中國農(nóng)業(yè)，：.柴向華，李軍，張秀珊等. 植物組織培育污染控制的研討進(jìn)展EB/OL.中國組培網(wǎng)， .朱廣廉