各類(lèi)干細(xì)胞應(yīng)用特點(diǎn)研究比較

1、各類(lèi)干細(xì)胞應(yīng)用特點(diǎn)研究比較徐瑞權(quán)干細(xì)胞研究的重要性： 美國(guó)Science雜志1999年將“干細(xì)胞研究的新發(fā)現(xiàn)”列入十大科技進(jìn)展之首2000年再次入選年度十大科技進(jìn)展2002年列入值得關(guān)注的六大科技領(lǐng)域之一至今干細(xì)胞各領(lǐng)域的研究飛速發(fā)展美國(guó)加州每年提供干細(xì)胞研究經(jīng)費(fèi)達(dá)3億美元 我國(guó)有關(guān)干細(xì)胞的研究也十分活躍，已有多個(gè)有關(guān)干細(xì)胞的“973”項(xiàng)目，召開(kāi)過(guò)多次全國(guó)性或國(guó)際性學(xué)術(shù)會(huì)議，出版過(guò)多本專(zhuān)（譯）著?！?63”計(jì)劃近期將為干細(xì)胞研究提供2億元人民幣的經(jīng)費(fèi)。干細(xì)胞治療的特點(diǎn)1.一次性介入，永久性治療； 2.不需要完全了解疾病發(fā)生的確切機(jī)理； 3.可應(yīng)用于自身干細(xì)胞移植，避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。干細(xì)胞應(yīng)

2、用的基礎(chǔ)調(diào)控 干細(xì)胞的調(diào)控是指給出適當(dāng)?shù)囊蜃訔l件，對(duì)干細(xì)胞的增值和分化進(jìn)行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。包括：內(nèi)源性調(diào)控外源性調(diào)控內(nèi)源性調(diào)控 干細(xì)胞自身有許多調(diào)控因子可對(duì)外界信號(hào)起反應(yīng)從而調(diào)節(jié)其增殖和分化：（1）細(xì)胞內(nèi)蛋白對(duì)干細(xì)胞分裂的調(diào)控：在果蠅卵巢中，調(diào)控干細(xì)胞不對(duì)稱(chēng)分裂的是一種稱(chēng)為收縮體的細(xì)胞器，包含有許多調(diào)節(jié)蛋白，如膜收縮蛋白和細(xì)胞周期素A。收縮體與紡錘體的結(jié)合決定了干細(xì)胞分裂的部位，從而把維持干細(xì)胞性狀所必需的成分保留在子代干細(xì)胞中。 （2）轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控在胚胎干細(xì)胞的發(fā)生中，轉(zhuǎn)錄因子Oct4是必需的。Oct4是一種哺乳動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)表達(dá)的靶基因產(chǎn)物是FGF-4

3、等生長(zhǎng)因子，能夠通過(guò)生長(zhǎng)因子的旁分泌作用調(diào)節(jié)干細(xì)胞以及周?chē)甜B(yǎng)層的進(jìn)一步分化。Oct4缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)部細(xì)胞不能發(fā)育成內(nèi)層細(xì)胞團(tuán)白血病抑制因子（LIF） Tcf/Lef轉(zhuǎn)錄因子 外源性調(diào)控干細(xì)胞的分化還可受到其周?chē)M織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響 （1）分泌因子間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖，分化和存活.有兩類(lèi)因子在不同組織甚至不同種屬中都發(fā)揮重要作用，它們是TGF家族和Wnt信號(hào)通路。 干細(xì)胞的分化還可受到其周?chē)M織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響 （1）膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間的相互作用 有些信號(hào)是通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的。-Catenin就是一種介導(dǎo)細(xì)胞

4、粘附連接的結(jié)構(gòu)成分。穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對(duì)干細(xì)胞分化有重要影響. 干細(xì)胞的分化還可受到其周?chē)M織及細(xì)胞外基質(zhì)等外源性因素的影響 （3）整合素（Integrin）與細(xì)胞外基質(zhì) 整合素家族是介導(dǎo)干細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附的最主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細(xì)胞的非分化增殖提供了適當(dāng)?shù)奈h(huán)境。1整合素干細(xì)胞的分類(lèi)及特點(diǎn)：胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞誘導(dǎo)分化干細(xì)胞（iPS），可誘導(dǎo)分化為機(jī)體胚胎干細(xì)胞成體干細(xì)胞來(lái)自胚泡的內(nèi)細(xì)胞群來(lái)源于骨髓、外周血、角膜、視網(wǎng)膜、腦、骨骼肌、齒髓、肝、皮膚、胃腸道粘膜層和胰腺等發(fā)育全能性，可誘導(dǎo)分化為機(jī)體分化較局限，部分成體干細(xì)胞（造血干細(xì)胞

5、、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞）有一定跨系、跨胚層的“可塑性”無(wú)限的自我更新能力病理?xiàng)l件下才顯出一定的自我更新潛能增殖能力強(qiáng)，便于應(yīng)用增殖能力較弱，故不能完全取代胚胎干細(xì)胞細(xì)胞可不斷增殖，“永生化”，移植后有形成腫瘤的可能性成瘤的可能性很小不能自體移植自體移植可避免免疫排斥有倫理問(wèn)題分離和使用不存在倫理問(wèn)題胚胎干細(xì)胞 衍生自囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始外胚層的細(xì)胞；永生化(immortal)；能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導(dǎo)增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過(guò)程； 胚胎干細(xì)胞的性質(zhì)胚胎干細(xì)胞系的建立過(guò)程ES細(xì)胞研究的趨勢(shì)改善ES細(xì)胞的體外培養(yǎng)條件，建立更有效更簡(jiǎn)便的獲得

6、ES細(xì)胞的方法。定向誘導(dǎo)分化成特定類(lèi)型細(xì)胞，用于臨床疾病的治療，并解決免疫排斥和潛在的致腫瘤的問(wèn)題。成體干細(xì)胞的橫向分化的能力以及與胚胎干細(xì)胞的比較，成體干細(xì)胞能否替代胚胎干細(xì)胞？胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)增殖速度：1824h分裂增殖一次 hES必須在含有白血病抑止因子（LIF）的培養(yǎng)基及成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(freeder cell)條件下才能保持繁殖而不分化。 hES體外培養(yǎng)要解決的關(guān)鍵問(wèn)題是維持細(xì)胞的分裂增殖而抑止其分化。 具有分化形成外、中、內(nèi)三個(gè)胚層的潛能。 能形成嵌合體動(dòng)物，從而成為聯(lián)系細(xì)胞和個(gè)體之間的橋梁。鑒定： 人胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達(dá)胚胎階段特異性抗原: SSEA-1 SSEA-3

7、SSEA-4 Thmoson分離的hES 陰性 弱陽(yáng)性 強(qiáng)陽(yáng)性Gearhart分離的hES 陽(yáng)性 弱陽(yáng)性 陽(yáng)性小鼠ES 陰性 陰性 陽(yáng)性鼠和人胚胎干細(xì)胞表達(dá)的表面抗原有種屬差異。 Gearhart等認(rèn)為SSEA-1陽(yáng)性可能是源于原始生殖細(xì)胞的多能干細(xì)胞分化的標(biāo)志.細(xì)胞膜表面有特殊的標(biāo)記：SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81a 胚胎干細(xì)胞具有正常穩(wěn)定的二倍體核型和帶型。 b 胚胎干細(xì)胞具有較高的端粒酶活性及堿性磷酸酶的表達(dá)。 人胚胎干細(xì)胞系端粒酶活性都很高，說(shuō)明其可在體外未分化狀態(tài)進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)。鑒定. 具有轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達(dá) Oct-4只限定在多潛能細(xì)胞中表

8、達(dá)。 人和小鼠的胚胎干細(xì)胞都表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，其表達(dá)能力大大降低。 Oct-4可能是哺乳動(dòng)物不同發(fā)育階段多潛能細(xì)胞所特有的少數(shù)特異的調(diào)控分子之一。胚胎干細(xì)胞鑒別鑒別不被Hoechst33342 和Rhodamine123染色能分化成三個(gè)胚層的細(xì)胞，將胚胎干細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠皮下可產(chǎn)生畸胎瘤可誘導(dǎo)分化為各種成體干細(xì)胞注：人胚胎干細(xì)胞具有自我更新和多潛能的特性，以及以下一些特征： 1）可以從囊泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來(lái)；2）在體外的增殖力非常強(qiáng)；3）在繼代的培養(yǎng)過(guò)程中保持正常的多倍體核型；4）可以分化為三個(gè)胚層的細(xì)胞；5）具有端粒酶活性 內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞可以發(fā)育成除了胎盤(pán)以外

9、的完整個(gè)體，因而這些細(xì)胞被認(rèn)為具有全能性。胚胎干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn) 全能性1. ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面： 形成畸胎瘤。將ES細(xì)胞注人同源動(dòng)物皮下可形成畸胎瘤，包括三個(gè)胚層細(xì)胞； 形成類(lèi)胚體。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長(zhǎng)，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目。能夠使之生成類(lèi)胚體，它是一個(gè)與畸胎瘤相似的多種系混雜的集合體、具有三個(gè)胚層組織； 直系分化。通過(guò)控制ES細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表達(dá)，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞； 形成嵌合體。將ES細(xì)胞注射到同種動(dòng)物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），E

10、S細(xì)胞可以參與嵌合體各個(gè)器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗(yàn)一個(gè)細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。 ES細(xì)胞生物學(xué)特性細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型細(xì)胞的高度分化潛能堿性磷酸酶的表達(dá)胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá) 1. 各種動(dòng)物的ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁。 2. ES細(xì)胞與卵圓柱期（egg cylinder stage）胚胎外胚層和胎兒生殖峙的原始生殖細(xì)胞類(lèi)似，而與 ICM細(xì)胞有差異。 3. 細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了整倍體性質(zhì)。正常ES細(xì)胞染色體正常，如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形成動(dòng)物個(gè)體。 4. ES細(xì)胞在體外

11、分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥(niǎo)巢，細(xì)胞界限不清，克隆周?chē)袝r(shí)可見(jiàn)單個(gè)ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。 5. ES細(xì)胞增殖迅速，每1824 h分裂增殖 1次。 6. 此外，其還可以在體外進(jìn)行選擇、操作、凍存。凍存的細(xì)胞可在需要時(shí)隨時(shí)解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性，并且來(lái)自一個(gè)克隆的細(xì)胞具有同樣的特征。1、ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型 2、ES細(xì)胞的高度分化潛能 ES細(xì)胞的全能性是其區(qū)別于成纖維細(xì)胞等體細(xì)胞的顯著特點(diǎn)1. ES細(xì)胞在體外需在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能維持其未分化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進(jìn)行分化。2. 在單層培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞自發(fā)分化成多種細(xì)胞， 懸浮培養(yǎng)中： “簡(jiǎn)單類(lèi)胚體

12、” “囊狀胚體” 細(xì)胞分化物。3. ES細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)分化 *用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90以上的ES細(xì)胞分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 *聚集培養(yǎng)的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮的心肌細(xì)胞。 *將ES細(xì)胞注射到同源動(dòng)物皮下，可形成組織瘤，其細(xì)胞組成可代表3個(gè)胚層細(xì)胞。 *用ES細(xì)胞作核供體進(jìn)行細(xì)胞核移植，可以得到可發(fā)育重構(gòu)胚和動(dòng)物個(gè)體。 3.堿性磷酸酶的表達(dá) 許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細(xì)胞和囊胚細(xì)胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達(dá)，小鼠的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富的AKP。而在已分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中AKP呈弱陽(yáng)性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽(yáng)性。因此，AKP常用

13、來(lái)作為鑒定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化與否的標(biāo)志之一。4、胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá) 早期胚胎細(xì)胞表面均表達(dá)胚胎階段特異性表面抗原（SSEA1）。在胚胎的原始外胚層細(xì)胞、ES細(xì)胞、EC細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的表面均可檢測(cè)到SSEA1的表達(dá)。小鼠SSEA1的表達(dá)自8一細(xì)胞期開(kāi)始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細(xì)胞全部呈強(qiáng)陽(yáng)性，晚期囊胚中部分ICM呈強(qiáng)陽(yáng)性，部分呈弱陽(yáng)性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細(xì)胞鑒定的一個(gè)標(biāo)志。ES細(xì)胞的應(yīng)用前景（1）ES細(xì)胞在動(dòng)物克隆及人類(lèi)治療性克隆中的應(yīng)用（2）在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用 （3）制備嵌合體動(dòng)物ES研究面臨的難題 1、體外培養(yǎng)ES 細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是既能快

14、速無(wú)限增殖，又呈未分化狀態(tài)。如何平衡這一對(duì)矛盾, 必須篩選適宜的培養(yǎng)條件。目前在ES細(xì)胞研究中存在著建系成功率也不高等問(wèn)題, 只在小鼠中建立了穩(wěn)定的ES細(xì)胞系，家畜、人類(lèi)細(xì)胞系建立的最佳條件仍無(wú)定論。 2、ES 細(xì)胞高度未分化, 具有形成畸胎瘤的可能性, 因此在使用ES 細(xì)胞進(jìn)行治療前必須首先體外誘導(dǎo)ES 細(xì)胞分化產(chǎn)生某種特異的組織細(xì)胞或設(shè)計(jì)自殺基因, 當(dāng)移植的細(xì)胞向腫瘤發(fā)展時(shí), 自殺基因能啟動(dòng)自毀機(jī)制使其凋亡。但如何誘導(dǎo)ES細(xì)胞定向分化成單一類(lèi)型的分化細(xì)胞, 是至今仍未解決的難題。因此，必須尋找各種細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的條件和方法，以及不同干細(xì)胞的表面標(biāo)志和分選技術(shù)，從而得到所需要的細(xì)胞或組織。

15、 3、ES細(xì)胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破，因?yàn)槠鞴俚男纬墒且粋€(gè)非常復(fù)雜的三維過(guò)程, 很多器官是兩個(gè)不同胚層的組織相互作用而形成的。即便是發(fā)育完整的來(lái)自自然機(jī)體的器官, 要離體培養(yǎng)并維持其正常的生理功能目前還無(wú)法做到, 器官的體外保存和維持仍是器官移植中的難題。 4、最大的障礙來(lái)自于倫理學(xué)問(wèn)題，特別是ES細(xì)胞應(yīng)用受到倫理、法律、宗教以及社會(huì)因素的強(qiáng)烈反對(duì)，有些國(guó)家甚至明令禁止進(jìn)行人類(lèi)ES細(xì)胞研究。無(wú)論從基礎(chǔ)研究角度來(lái)講還是從臨床應(yīng)用方面來(lái)看，人類(lèi)ES細(xì)胞帶給人類(lèi)的益處遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在倫理方面可能造成的負(fù)面影響，但隨著觀念的改變，人們會(huì)逐漸認(rèn)識(shí)到ES細(xì)胞對(duì)臨床醫(yī)學(xué)及生物學(xué)理論研究的重要作用

16、。 WASHINGTON The US National Institutes of Health (NIH) could provide funding for research on human embryonic stem cells as early as the spring if new guidelines, published by the NIH last week after widespread public consultation, are formally approved. Nature 402, 566 (1999)TOKYO Japans cloning ba

17、n will still allow stem cell experiments Nature 404, 321 (2000)LONDON European panel rejects creation of human embryos for research Nature 408, 277 (2000)倫理學(xué)問(wèn)題：Stem cell research quidlineDEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICESPublic Health ServiceNational Institutes of HealthNational Institutes of H

18、ealth Guidelines for Research Using Human Pluripotent Stem Cells SUMMARY: The National Institutes of Health (NIH) is hereby publishing final National Institutes of Health Guidelines for Research Using Human Pluripotent Stem Cells. The Guidelines establish procedures to help ensure that NIH-funded re

19、search in this area is conducted in an ethical and legal manner. 另外，利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行克隆性治療在目前尚受到多方面的限制胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的條件及分化成熟的鑒定標(biāo)準(zhǔn)尚不成熟，人們對(duì)如何避免分化不完全的胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)導(dǎo)致畸胎瘤的危險(xiǎn)性仍不清楚人ESC用于臨床的疾病治療短期內(nèi)將難以實(shí)現(xiàn)解決胚胎來(lái)源有限的途徑： 未成熟卵的體外成熟（1）Knock-out 胚胎干細(xì)胞的組織相 容性抗原（2）Knock-in 受者的組織相容性抗原（3）與同一來(lái)源的造血干細(xì)胞一同移植（4）受者的體細(xì)胞核移植避免免疫排斥的方法分離、純化：隨著對(duì)胚胎干細(xì)胞

20、研究的進(jìn)展，分離、純化技術(shù)得到較好的解決。倫理學(xué)問(wèn)題的解決：誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞（IPS）的研究，充分解決了胚胎干細(xì)胞所面臨的倫理學(xué)問(wèn)題。誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞的研究細(xì)胞重編程的研究概況核移植：核移植試驗(yàn)最初是在兩棲動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)將體細(xì)胞核注入到去核卵母細(xì)胞中，但具有很大的局限性。將成熟的體細(xì)胞與多潛能的細(xì)胞（ES細(xì)胞、胚胎癌細(xì)胞等）融合，或者用胚胎干細(xì)胞提取物來(lái)處理體細(xì)胞，也可以在一定程度上使體細(xì)胞發(fā)生重編程。但面臨許多倫理學(xué)問(wèn)題。 有沒(méi)有相對(duì)簡(jiǎn)單，又可擺脫材料來(lái)源和倫理學(xué)諸多限制，重編程的效率和程度都十分可觀的新方法呢？2006年11月20日，日本京都大學(xué)的山中伸彌（Shinya Yam

21、anaka)和美國(guó)威斯康星大學(xué)的詹姆斯湯姆森（James Thomson）分別在細(xì)胞和科學(xué)雜志上發(fā)表重量級(jí)論文，宣布他們用基因改造的手段，將人類(lèi)體細(xì)胞改造成了類(lèi)胚胎干細(xì)胞，在功能上幾乎可以和胚胎干細(xì)胞相媲美。誘導(dǎo)產(chǎn)生多能性干細(xì)胞：幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入已分化的細(xì)胞，進(jìn)而獲得了類(lèi)似于胚胎干細(xì)胞的多能性干細(xì)胞，稱(chēng)之為“誘導(dǎo)產(chǎn)生的多功能性干細(xì)胞”（induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞）。方法：借助“逆轉(zhuǎn)錄酶病毒”為載體,即向皮膚細(xì)胞中植入一組4個(gè)基因 (Oct4,Sox2,c-myc和Klf4 )，通過(guò)基因重新編排，使皮膚細(xì)胞具備胚胎干細(xì)胞的功能。這種被改造過(guò)的細(xì)胞稱(chēng)作

22、“iPS細(xì)胞”。優(yōu)越性：1、利用iPS細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，只操縱幾個(gè)因子的表達(dá)，加速對(duì)多能性調(diào)控機(jī)理的深入研究。2、獲得的方法相對(duì)簡(jiǎn)單穩(wěn)定，不涉及胚胎的破壞，無(wú)倫理道德限制。3、對(duì)于疾病機(jī)理研究和新藥開(kāi)發(fā)等方面將有很大貢獻(xiàn)。4、可望制造特定病人來(lái)源的iPS細(xì)胞，用“個(gè)性化”移植來(lái)治療諸多疾病。iPS細(xì)胞檢測(cè)-hES 標(biāo)記表現(xiàn)Sell-specific surface antigens (Adewumi et al., 2007)iPS細(xì)胞檢測(cè)-hES 標(biāo)記表現(xiàn)stage-specific embryonic antigen-1(SSEA-1)Ips細(xì)胞研究中存在的問(wèn)題1、腫瘤相關(guān)基因，如c-my

23、c的使用，有誘發(fā)癌癥的可能。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染可能會(huì)導(dǎo)致一些癌基因的激活，也可能導(dǎo)致某些重要基因功能受阻。3、基因表達(dá)模式與ESC還存在一些不同。4、效率較低，重組率只有0.1%。存在的問(wèn)題IPS細(xì)胞與hES細(xì)胞的DNA分析結(jié)果顯示兩者之間仍有差異存在.效率不高：1/5103 cells挑選出的細(xì)胞群落參雜有HDF反轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)插入而抑制相關(guān)基因一些沒(méi)有被核型分析檢測(cè)到的基因改變反轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)插入可能會(huì)誘發(fā)癌癥iPS細(xì)胞形成畸胎瘤內(nèi)胚層中胚層中胚層外胚層外胚層中胚層iPS細(xì)胞形成畸胎瘤In vivo：將iPS細(xì)胞胞注射至嚴(yán)重免疫缺陷綜合癥(SCID)小鼠的背側(cè)皮下。九周后：產(chǎn)生腫瘤組織學(xué)檢測(cè)：

24、腫瘤中含有各式各樣的組織Teratoma：畸胎瘤包含有器官或是組織的腫瘤，類(lèi)似三個(gè)胚層的衍生物。IPS細(xì)胞插入基因檢測(cè)PCR顯示每個(gè)中都有插入四個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒IPS細(xì)胞非污染的產(chǎn)物免疫印跡分析，以c-Myc cDNA為探針 由逆轉(zhuǎn)錄病毒的c-Myc內(nèi)生性的c-MycIPS細(xì)胞與hES細(xì)胞的DNA分析結(jié)果顯示兩者之間仍有差異存在效率不高：1/5103 cells 挑選出的細(xì)胞群落參雜有HDF 反轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)插入而抑制相關(guān)基因 一些沒(méi)有被核型分析檢測(cè)到的基因改變反轉(zhuǎn)錄病毒隨機(jī)插入可能會(huì)誘發(fā)癌癥成體干細(xì)胞是存在于成體動(dòng)物的許多組織和器官，具有修復(fù)和再生的能力的細(xì)胞。成體干細(xì)胞大多數(shù)時(shí)候處于靜息狀態(tài)。在

25、特定條件下，成體干細(xì)胞或者產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能細(xì)胞，從而使組織和器官保持生長(zhǎng)和衰退的動(dòng)態(tài)平衡。 成體干細(xì)胞 （adult stem cell，ASC）各類(lèi)成體干細(xì)胞： 干細(xì)胞名稱(chēng)Stem cell niche干細(xì)胞標(biāo)志分化細(xì)胞標(biāo)志分化促進(jìn)因子神經(jīng)祖細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞側(cè)腦室室管膜細(xì)胞巢素蛋白CD133微管結(jié)合蛋白-2神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白GFAP表皮生長(zhǎng)因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子表皮干細(xì)胞毛囊干細(xì)胞基底細(xì)胞角蛋白15K5、K14Wnt腸干細(xì)胞腸腺基部及近基部K8、 K18、 K19肝干細(xì)胞Hering管門(mén)管區(qū)膽管周?chē)褕A細(xì)胞：OV-6、c-kit、CD34、AFP小肝細(xì)胞：

26、間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓竇的內(nèi)腔面SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD99、CD106、CD124、CD120a、多種組織標(biāo)志（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體-BMPR）多種誘導(dǎo)因素造血干細(xì)胞骨髓、臍帶血、外周血成體干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn) 成體干細(xì)胞則可從患者自身獲得，不存在組織相容性的問(wèn)題。 成體干細(xì)胞不會(huì)誘發(fā)畸胎瘤的發(fā)生。 成體干細(xì)胞也不存在倫理學(xué)爭(zhēng)執(zhí)。成體干細(xì)胞的不足尚未從人體的全部組織中分離出成體干細(xì)胞 .成體干細(xì)胞含量極微，很難分離和純化，且數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)而降低 在一些遺傳缺陷疾病中，遺傳錯(cuò)誤很可能也會(huì)出現(xiàn)于病人的干細(xì)胞中，這樣的干細(xì)胞不適于移植 成人身上獲得的干細(xì)胞可能沒(méi)有年輕人的干細(xì)胞那樣的增

27、殖能力 由于日常生活中人是暴露在各種環(huán)境之下，日光和毒素等都有可能造成基因突變，成體干細(xì)胞可能包含更多的DNA異常。沒(méi)有證據(jù)表明成體干細(xì)胞是多能干細(xì)胞 成體干細(xì)胞稀少，難以識(shí)別與純化，也難以在培養(yǎng)條件下在未分化狀態(tài)保持長(zhǎng)時(shí)間增殖，或能夠保持長(zhǎng)時(shí)間增殖時(shí)，又不定向分化。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells, MSC） 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓中除造血細(xì)胞以外的中胚層來(lái)源的細(xì)胞，其細(xì)胞特性穩(wěn)定，在連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存后仍具有多向分化潛能。是干細(xì)胞的一種，具有干細(xì)胞的共性，即自我更新及多向分化的能力。最初是由Alexander Friedenstein發(fā)現(xiàn)，且證明其在體外分

28、化成為硬骨骼及脂肪細(xì)胞，后續(xù)有其他的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，此類(lèi)干細(xì)胞更可以分化成為肝臟、軟骨、肌肉等組織細(xì)胞， 2002 年一月由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué) (University of Minnestoa) 研究人員發(fā)表的成果，發(fā)現(xiàn) 更可以分化成為神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞。在特定的誘導(dǎo)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為間充質(zhì)組織中的各類(lèi)細(xì)胞，包括：骨、軟骨、脂肪、肌腱、韌帶等細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：特點(diǎn)可經(jīng)誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化，并能分泌特異性型膠原基質(zhì)，因此可望成為工程化軟骨的種子細(xì)胞；分化為肌細(xì)胞，可能成為肌萎縮、肌營(yíng)養(yǎng)不良時(shí)促進(jìn)肌組織再生的靶細(xì)胞； 與基因治療結(jié)合，可強(qiáng)化治療效果，對(duì)某些基因突變所致的遺傳性疾??；可分

29、離其自體的間充質(zhì)干細(xì)胞，體外進(jìn)行改造，敲除突變基因，導(dǎo)入正?；?，然后重新輸入體內(nèi)，既糾正了遺傳缺陷，又避免發(fā)生移植反應(yīng)。 原代培養(yǎng)15天的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （4倍）人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后經(jīng)過(guò)14天誘導(dǎo)分化形成的成骨細(xì)胞堿性磷酸酶陽(yáng)性呈紫紅色 40X人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后經(jīng)過(guò)14天誘導(dǎo)分化形成的脂肪細(xì)胞紅油染色陽(yáng)性 40XBMSCs優(yōu)點(diǎn)：BMSCs易于提取、分體、純化及擴(kuò)增，適合作基因治療的載體細(xì)胞?；颊呖梢杂米约旱母杉?xì)胞治療疾病，從而克服了移植排斥反應(yīng)。另外，MSCs具有可植入性，在特定的條件下還可分化為骨、軟骨、肌肉等組織細(xì)胞，是多種疾病基因治療的理想種子細(xì)胞。另外，BMSCs具有極

30、強(qiáng)的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，來(lái)源廣泛，易于獲取，且具有低免疫原性，應(yīng)用方便。BMSCs缺點(diǎn)：BMSCs具有體外易衰老等缺點(diǎn)，BMSCs傳代至67代后細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸緩慢，呈現(xiàn)衰老現(xiàn)象，故細(xì)胞存在數(shù)量不足、體外擴(kuò)增困難、體外傳代、保存及復(fù)蘇后增殖及分化能力下降等問(wèn)題，嚴(yán)重影響其進(jìn)一步廣泛研究及臨床應(yīng)用。永生化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞現(xiàn)BMSCs具有體外易衰老等缺點(diǎn)，通過(guò)基因工程方法，使BMSCs傳代次數(shù)的增加、仍可保持較好的活性，該類(lèi)BMSCs稱(chēng)為永生化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。細(xì)胞永生化機(jī)制： M1-M2 理論:細(xì)胞經(jīng)多次分裂后,在腫瘤抑制因子p53 和Rb 作用下,細(xì)胞進(jìn)入M1期,開(kāi)始衰老。細(xì)胞經(jīng)過(guò)2030

31、PDs后,進(jìn)入M2 期凋亡,只有罕見(jiàn)的細(xì)胞在一些因素影響下,端粒酶被激活,以它自身RNA為模板不斷合成端粒DNA 來(lái)補(bǔ)充和延長(zhǎng)端粒有限長(zhǎng)度,以維持端粒長(zhǎng)度,恢復(fù)染色體的穩(wěn)定性使細(xì)胞得以逾越M2期,獲得無(wú)限分裂和增殖的能力, 發(fā)生永生化。Shay JW , Wright WE , Werbin H. Defining the molecular mechanisms of human cell immortalization J . Biochim Biophys Acta ,1991 ,1072(1) :127.永生化BMSCs研究方法：通過(guò)質(zhì)粒pCMVSV40TPUR導(dǎo)入大鼠BMSCs，建立永生化BMSCs在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；采用檢測(cè)堿性磷酸酶的活性。采用裸鼠皮下接種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的致瘤性；永生化BMSCs特點(diǎn)：未導(dǎo)入質(zhì)粒的BMSCs培養(yǎng)至l5代后細(xì)胞不能繼續(xù)傳代，呈明顯衰老跡象。而永生化BMSCs培養(yǎng)至15代后仍可保持較好的活性，永生化BMSCs隨著傳代次數(shù)的增加其形態(tài)未見(jiàn)明顯改變，細(xì)胞傳代至15代時(shí)，細(xì)胞增長(zhǎng)速度無(wú)減慢趨勢(shì)永生化BMSCs具有明顯接觸抑制鏡下觀察發(fā)現(xiàn)永生化BMSCs細(xì)胞間仍存在接觸抑制，且通過(guò)裸鼠皮下注射永生化BMSCs后，觀察4wk后，未見(jiàn)瘤體的出現(xiàn)，表明細(xì)胞為良性細(xì)胞可能性大，且無(wú)明顯