DNA多態(tài)性及其分析技術(shù)

1、DNA多態(tài)性及其分析技術(shù)發(fā)生遺傳別離的基因座位locus具有兩個以上等位基因時，時，這個基因座位就被認(rèn)為具有多態(tài)性。在某些時候，一個基因位點上只由一個基因占據(jù)，但有時這個位置上缺乏這一基因，這時就會出現(xiàn)“有和“無兩種情況，被稱為二態(tài)性dimorphism。遺傳多態(tài)性主要可分為遺傳表型的多態(tài)性和DNA的多態(tài)性兩大類。由遺傳控制表現(xiàn)出來的性狀就是遺傳表型。檢測遺傳表型多態(tài)性有其局限性：遺傳表型的多態(tài)性只反映出編碼基因的局部變異。后者只占人基因組總DNA的10%10%?；蚣盎蛳嚓P(guān)序列占總DNA的25%。 DNA序列中的同義突變不會引起表型的改變。這時檢測表型就不能發(fā)現(xiàn)編碼基因中存在的變異?；虻?/p>

2、表達(dá)會有變異，基因型完全一樣的生物體在不同的生長條件下可能有不同的表型，靠檢測表型多態(tài)性來推斷基因有時會出現(xiàn)錯誤結(jié)論。分析DNA的多態(tài)性才能真正深刻地提醒生物的多態(tài)性。人類基因組序列概況人類基因組30億堿基對非基因序列70%80%基因及相關(guān)序列20%30%編碼序列10%中度或高度重復(fù)序列20% 30%單一數(shù)或低拷貝序列70% 80%簇狀重復(fù)60%第二節(jié) DNA多態(tài)性的分類DNA是遺傳信息的物質(zhì)根底，因而是反映個體間差異的最本質(zhì)東西。DNA序列組成的個體特異性主要表現(xiàn)為以下類型的DNA多態(tài)性。由于控制性狀的基因堿基組成上的不同造成的多態(tài)性。采用等位基因特異性探針ASO或SSO探針或限制酶切消化進

3、展分析。如人類白細(xì)胞抗原HLA系統(tǒng)，編碼HLA-DR抗原的位點有超過200個等位基因。串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性variable numbers of tandom repeats,VNTR：一樣的核心序列，不同的個體重復(fù)的次數(shù)不同。不同的重復(fù)序列，其核心序列的組成會不同。在核心序列之間，不同的個體間會存在有無插入小段DNA或插入的片段長短不同的差異。因此，兩個無關(guān)個體的VNTR的變異能到達(dá)完全個體特異的程度，這是DNA指紋形成的根底。中度重復(fù)的散在重復(fù)序列多態(tài)性。遍布哺乳動物基因組中X染色體的重復(fù)序列多態(tài)性Y染色體的特異性片段多態(tài)性。人線粒體DNA的D環(huán)兩個無關(guān)個體間，完全一樣的可能性只有0.27%

4、。第三節(jié) DNA多態(tài)性分析技術(shù)分析技術(shù)根本原理限制性酶切片段長度多態(tài)性技術(shù)restriction fragment length polymorphism，RFLP：用某種特定的限制性內(nèi)切酶消化不同的DNA片段，由于DNA的堿基組成不同，就會產(chǎn)生不同長度的酶切片段。這樣采用適宜的限制性內(nèi)切酶消化待分析的DNA片段，就能根據(jù)切出來的片段是否長度一致來推測其DNA序列是否一樣，然后用標(biāo)記好的相應(yīng)的DNA探針與這些片段進展雜交，顯出的圖譜就可以反映出基因組DNA堿基序列組成是否存在差異。這一技術(shù)的根底是通過核酸的限制性酶切片段長度多態(tài)性來提醒DNA堿基序列組成的不同。抽提DNA從血或組織培養(yǎng)細(xì)菌人工

5、合成探針限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠Southern轉(zhuǎn)移、固定質(zhì)粒純化純化探針標(biāo)記探針同位素或非同位素預(yù)雜交雜交洗膜反射自顯影或顯色后分析結(jié)果RFLP技術(shù)圖解RFLP技術(shù)的根本步驟先將人基因組DNA抽提出來，選用適宜的限制性內(nèi)切酶酶解基因組DNA，將酶解出來的具有各種長度的DNA片段在瓊脂糖凝膠上電泳別離，使其按片段的長短排列，將DNA片段變性后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上稱為印跡轉(zhuǎn)移，即Southern blot，并固定在這些載體上面。將準(zhǔn)備作為探針的DNA片段純化，用同位素如32P或非同位素標(biāo)記，經(jīng)純化后使用。將標(biāo)記好的探針與硝酸纖維膜或尼龍膜上的單鏈DNA雜交，洗膜以后進展放射自顯影或參加

6、酶的反響底物顯色，再對顯示出來的譜帶進展分析。影響RFLP的幾個因素影響RFLP圖譜的重要因素。市售常見的有100多種。星號*活性即非特異性酶解活性。反響液中甘油、乙醇濃度及被酶解DNA的質(zhì)量和濃度。不同的DNA探針會顯示出不同類型的RFLP圖譜。人基因組中某一基因的一個片段。常用于研究人類遺傳性疾病。影響RFLP的幾個因素從人基因組DNA中隨意挑選出一個DNA片段，其功能并不知道。采用統(tǒng)一的命名法：D后為來源之染色體的號碼，S為單拷貝NF代表有多個片段，最后是分配給定的序號。如D14S1等?？蛇M展疾病基因連鎖分析?；蚪M中的重復(fù)序列，可同時提醒整個基因組中許許多多位點的DNA序列的多態(tài)性。如

7、1985年，Jeffreys等發(fā)現(xiàn)的高度重復(fù)的小衛(wèi)星DNA探針，可提醒人類的DNA序列的多態(tài)性，并且在無關(guān)個體之間這類多態(tài)性一樣的時機極微只有31011，稱為DNA指紋?？捎糜趥€人識別和親子鑒定，人類學(xué)的研究。探測人基因組中的散在重復(fù)序列，也可用于個體特異性研究。用于研究昆蟲等動物，可用此作為探針進展相關(guān)研究，進展種、群分類。本卷須知1.首先檢測對象的DNA分子必須保持大分子。在抽提DNA過程中防止人為地將DNA分子機械性切割成小片段的DNA，否那么最終的結(jié)果可能是一種假象。2.在用限制性內(nèi)切酶消化大分子DNA時，要使DNA被完全消化，否那么也會出假結(jié)果。3.被消化的DNA濃度不能太高。4.電

8、泳時要低壓電泳。5.雜交前探針必須充分變性。6.要根據(jù)探針標(biāo)記的情況以及探針與靶DNA間序列互補的程度和GC含量來掌握洗膜的條件。7.作放射自顯影時，要根據(jù)探針標(biāo)記的放射比活性以及靶DNA的量等因素決定曝光的時間。Jeffreys等從人的染色體DNA中別離出一種重復(fù)序列作為探針，對人的染色體DNA進展RFLP分析稱為DNA指紋圖。他們將總DNA用限制性內(nèi)切酶完全酶解以后，用放射性的探針進展Southern印跡，每個人的DNA所產(chǎn)生的陽性雜交條帶都是特異性的，而且子女的陽性雜交帶中，有一半與父親的DNA陽性雜交帶一樣，另一半是與母親的陽性雜交帶一樣。用這種重復(fù)序列作為探針，對不同的人的DNA進展

9、指紋分析，產(chǎn)生完全一樣的圖譜的時機小于60億分之一。可用于法醫(yī)鑒定、血緣關(guān)系的識別等。這一實驗方法所提供的證據(jù)已于1988年得到英國法庭的認(rèn)可。人的DNA指紋分析示意圖子女DNA指紋圖中分別與其父、母的DNA指紋中相應(yīng)的分子雜交條帶相對應(yīng)父 子女 母分析DNA多態(tài)性根本原理PCR分析DNA多態(tài)性的應(yīng)用反向點印跡雜交技術(shù)：將等位基因特異性探針ASO探針加poly(dT)尾巴，打點固定在硝酸纖維素膜上。將擴增產(chǎn)物與之雜交，顯色反響后判讀。2.分析擴增DNA的RFLPAm-RFLPDNA擴增長 限制性酶切 瓊脂糖電泳分析DNA的PCR擴增產(chǎn)物 瓊脂糖電泳別離分析對DNA擴增后進展序列分析。 不對稱P

10、CR ssDNA 測序分析比較RAPD是隨機擴增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA)的英文縮寫。該法最初是由Williams等創(chuàng)造，其方法是用隨機序列的910個核苷酸的引物，對基因組的DNA進展PCR擴增，再進展電泳別離。采用任意順序的引物擴增基因組DNA，可以在完全不知道特定DNA順序的情況下分析其多態(tài)性，不僅可用于個人識別，還可用于其它各種遺傳學(xué)研究。有人建議把通過隨意引物擴增的DNA順序，稱為RAPD標(biāo)記，用于比較兩種不同的生物的基因有否區(qū)別。由于所有的RAPD都是顯性的，所以無法區(qū)別擴增的DNA片段是來自雜合子還是純合子。目前已有明顯的跡象顯

11、示，RAPD標(biāo)記具有廣闊的應(yīng)用范圍和前景。不但可用于基因制圖，動植物培育，DNA指紋分析，而且在染色體特異DNA片段的別離鑒定、雜交細(xì)胞系或遺傳原種中大段染色體的缺失或重復(fù)的篩查等諸方面也將發(fā)揮出重要作用。其優(yōu)點表現(xiàn)在以下幾個方面：可以用一系列的通用引物分析不同種類的生物。可用于制備探針和分析未知的DNA順序。由于每一個RAPD標(biāo)記對應(yīng)一種DNA順序，可大大簡化多種相關(guān)研究。RAPD技術(shù)有可能使基因型的鑒別自動化，高效基因制圖等工作比應(yīng)用RFLP和普遍PCR技術(shù)更有效，更簡便。而且人工合成的隨機引物可在實驗空間進展交換，這比克隆DNA片段作為探針要容易和迅速得多，還免去了DNA分子雜交的麻煩。

12、第四節(jié) DNA多態(tài)性分析技術(shù)的應(yīng)用1研究人類遺傳性疾病人類某些遺傳性疾病是因某一基因的堿基序列中發(fā)生突變，使之缺失了某一限制性內(nèi)切酶的識別位點，因而使用此限制性內(nèi)切酶無法切出與正常人一樣大小的限制性片段來；另一些疾病那么表現(xiàn)出相反的情況，出現(xiàn)了原來沒有的某個限制性內(nèi)切酶識別位點。有時是因插入了某一個片段引起疾病。用PCR技術(shù)分析DNA多態(tài)性還可以進展產(chǎn)前診斷，對那些在嬰兒期或少年期發(fā)病的嚴(yán)重影響病人勞動生活能力的遺傳性疾病在胚胎期作出確診，采取措施終止妊娠，對優(yōu)生優(yōu)育顯得尤為重要。2建立人類基因組的遺傳連鎖圖以及對某些有遺傳傾向的疾病作相關(guān)性分析3作為遺傳標(biāo)記用于單卵雙生或雙卵雙生的診斷，親子鑒定、法醫(yī)個人識別以及人類學(xué)的研究等。4直接作基因分型，