多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-極好

1、 課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片斷1概念：PCR即_，是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。它能以極少量的_為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA 遺傳疾病的診斷、 刑偵破案、 古生物學(xué)、 基因克隆 DNA序列測(cè)定。2 、PCR技術(shù) 的應(yīng)用 一、基礎(chǔ)知識(shí)（一）回憶DNA的復(fù)制 回答相關(guān)問(wèn)題1、發(fā)生時(shí)間：發(fā)生在細(xì)胞有絲分裂的間期和減數(shù)第一次分裂間期。2、特點(diǎn)(方式)：邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制多起點(diǎn)復(fù)制3、合成條件模板：原料：游離的脫氧核苷酸DNA兩條鏈能量：ATP酶:解旋酶、DNA聚合酶反應(yīng)條件溫和4、場(chǎng)所：細(xì)胞核(主)、線粒體、葉綠體DNA母鏈：提供復(fù)制的模板解旋酶：

2、打開DNA雙鏈4種脫氧核苷酸：合成子鏈的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子鏈ATP：為復(fù)制過(guò)程提供能量引物：使DNA聚合酶從引物的3端開始連接脫氧核苷酸（二）DNA復(fù)制的條件12345脫氧核苷酸結(jié)構(gòu)1DNA的平面結(jié)構(gòu)：OOPOHO堿基OOHOOPOHOOH堿基堿基脫氧核糖磷酸基團(tuán)堿基脫氧核糖堿基脫氧核糖53磷酸二酯鍵DNA3端，5端指什么。DNA的羥基(-OH)末端稱為3端，而磷酸基團(tuán)的末端稱為5端。脫氧核苷酸 鏈 結(jié)構(gòu)目錄上頁(yè)下頁(yè)習(xí)題參考書返回ATGCATGC5，端含磷酸基團(tuán)3，端含羥基3，端5，端目錄上頁(yè)下頁(yè)習(xí)題參考書返回DNA聚合酶的特性 - 專一性 DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，

3、而只能從3端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)制需要引物。觀察圖 2復(fù)制的方向：2 方向：子鏈的5端向 3端延伸。（1）、 DNA 分子的熱變性原理DNA雙鏈單鏈 變性（加熱80-100） 復(fù)性（緩慢冷卻）變性的目的：解開雙鏈:解開氫鍵 在80100 的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過(guò)程稱為2、PCR原理變性 高溫解決了打開雙鏈的問(wèn)題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，耐高溫的Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問(wèn)題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。（2）、Taq DNA聚合酶的應(yīng)用（3）、PCR 反應(yīng)的條件DNA模板；分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物（引物和引物）

4、；四種脫氧核苷酸；耐高溫的聚合酶（Taq DNA聚合酶）；控制溫度，但不需解旋酶；需要在一定的緩沖液中進(jìn)行。PCR 反應(yīng)需要的這些條件的原因是什么？1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)13步30輪（1）、步驟：變性 復(fù)性延伸二、PCR的反應(yīng)過(guò)程 5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物變性95oC復(fù)性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)（220）倍以上。2、PCR的反應(yīng)結(jié)果從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作

5、為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸 DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長(zhǎng)度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。三、 PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器三、 PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（

6、5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94C,10min30次4，30s55，30s72，1min最后一次4，1min55，30s72，1minPCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污染而造成干擾實(shí)驗(yàn)，PCR操作時(shí)要注意做到：（6）、注意事項(xiàng)隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進(jìn)行高壓滅菌；分裝試劑，簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性槍頭四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA 含量的測(cè)定：稀釋對(duì)照調(diào)零測(cè)定計(jì)算（ DNA含量（g/mL）50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)）波長(zhǎng)260nm處讀數(shù)蒸餾水做對(duì)照50倍（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四

7、、課題成果評(píng)價(jià)1 、一條DNA，復(fù)制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復(fù)制n次， DNA為a x2 n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1 、原理 可以通過(guò)測(cè)量DNA含量來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)五、 課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴(kuò)增量達(dá)230個(gè)拷貝（109拷貝）PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異性強(qiáng)、敏感性高、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出特點(diǎn)。體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DN