三、植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察

1、 細(xì)胞生物學(xué)實驗課件 實驗三 植物細(xì)胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察一.實驗?zāi)康?1.掌握考馬斯亮藍(lán)R250對植物細(xì)胞骨架染色的方法。 2.通過對洋蔥內(nèi)皮細(xì)胞的處理，掌握植物細(xì)胞骨架的制備方法與顯微形態(tài)觀察。二.實驗原理 細(xì)胞骨架(cytoskeleton)，是細(xì)胞內(nèi)以蛋白質(zhì)纖維為主要成分的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，根據(jù)蛋白質(zhì)纖維的直徑、組成成分和組裝結(jié)構(gòu)的不同可分為微絲、微管和中等纖維。細(xì)胞骨架對于維持細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及細(xì)胞運動、物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞分裂等有重要的作用。 本試驗采用去垢劑TritonX-100的緩沖液處理植物材料時，可將細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和大部分蛋白質(zhì)抽提掉，但細(xì)胞骨架系統(tǒng)的蛋白卻被保存下來，后

2、者用考馬斯亮藍(lán)R250染色，在光學(xué)顯微鏡下可見一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 三.實驗用品 1.材料：洋蔥 2.器材：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、鑷子、滴管、擦鏡紙、50ml燒杯 藥品：pH6.8的磷酸緩沖液； M-緩沖液 ：50mmolL-1 (PH6.7)咪唑、 50 mmolL-1 KCl、0.5 mmolL-1 MgC12 、 1 mmolL-1 EGTA、 0.1 mmolL-1 EDTA、1 mmolL-1巰基乙醇、 4 mmolL-1甘油、 1 mmolL-1 HCl調(diào)pH至7.2；1%Triton-X100:用M-緩沖液配 制；3%戊二醛：用pH6.8的磷酸緩沖配制；0.2%考馬斯亮藍(lán) R250染

3、液：0.8g考馬斯亮藍(lán)R250、46.5ml甲醇、7ml冰醋酸、 46.5ml蒸餾水。四.實驗方法步驟 1.撕取洋蔥鱗莖內(nèi)表皮1cm2若干片，置于小燒杯中。 2.用磷酸緩沖液（pH6.8）提前浸泡2小時左右。 3.吸去磷酸緩沖液，用1% TritonX100處理20分鐘。抽提細(xì)胞骨架以外的蛋白質(zhì)，從而使骨架圖像更加清晰。 4.吸去TritonX-100，用M-緩沖液洗2次，每次5分鐘。M-緩沖液有穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用。 5.用3%戊二醛固定0.51h。 6.用磷酸緩沖液（pH6.8）洗2次，每次5分鐘。 7.考馬斯亮藍(lán)R250染色30分鐘。 8.蒸餾水洗2次。 9.置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。五. 實驗報告