常用飼用酶制劑檢測方法介紹

1、關于常用飼用酶制劑檢測方法介紹第一張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月飼料酶制劑 現(xiàn)市場上常見的飼料酶制劑多為復合酶，其成分木聚糖酶、-淀粉酶、（酸性或中性）蛋白酶、甘露聚糖酶、纖維素酶、-葡聚糖酶中的幾種。 如何準確檢測其中的一種酶制劑的活性？第二張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月酶制劑檢測原理 酶與一般催化劑最主要的區(qū)別之一是它具有高度的專一性。第三張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月酶制劑檢測原理 樣品檢測： 酶制劑檢測應用酶對底物專一性的特點，采用高純度底物，專一檢測某種酶制劑對底物的降解，然后測定產物含量（分光光度計）。 標準曲線： 通過用其高純度的產物制作標準曲

2、線，通過分光光度計的讀數(shù)查出對應的產物含量，然后計算酶活。第四張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月酶制劑檢測原理第五張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月A. -淀粉酶 1.碘淀粉顯色法 利用淀粉遇碘變藍的反應，檢測出未被淀粉酶分解的淀粉，運用分光光度計測定碘反應藍值的變化，然后查表讀取酶活。 特點：測定-淀粉酶的碘淀粉顯色法是專一性較高、操作較簡便、準確性也較高的方法。第六張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月A. -淀粉酶 2. DNS顯色法 原理：淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，將3，5二硝基水楊酸試劑還原生成3氨基5硝基水楊酸的顯色基團，在一定范圍內其顏色的深淺與糖的濃度成正

3、比，故可求出麥芽糖的含量。 特點：專一性不高，易受其他淀粉酶（主要是-淀粉酶）的干擾，因此，碘淀粉顯色法應用較多。第七張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月B. 蛋白酶 1. Folin法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，產生酪氨酸等酚基氨基酸，在堿性條件下，酚基氨基酸與Folin試劑反應生產藍色物質，于680nm比色測定光吸收值，計算酶活力。 該法的準確性及靈敏度都較高，在國內已得到公認，是應用最廣的方法，我國的部頒標準及各大酶制劑生產企業(yè)都采用該法。第八張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月B. 蛋白酶 2. 紫外分光光度法 原理：蛋白酶水解酪蛋白，產生酪氨酸等酚基氨基酸，利用酪氨酸在28

4、0nm處有特征性吸收峰,測定計算酶活。 特點：紫外線操作比Folin法簡便，但靈敏度僅為Folin法的1/10。第九張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月C. 產還原糖酶制劑 現(xiàn)今采用的還原糖法通常是比色法，黃色的3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑與還原糖在堿性條件下共熱后，自身被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顯色反應與不同聚合度同源寡糖還原性末端的含量成正比。 特點：易于操作，價格低廉，方便快速，重復性好 第十張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月C. 產還原糖酶制劑 能產生還原糖的酶有：包括纖維素酶、半纖維素酶和淀粉酶等。 半纖維素酶是分解半纖維素(包括各種降戊糖與聚己糖

5、)的一類酶的總稱,主要包括-葡聚糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶。第十一張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月C. 產還原糖酶制劑 1. 還原糖法 2. 粘度法 3. 瓊脂平板擴散法 4. 可溶性的染色底物第十二張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 還原糖法 還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。第十三張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 粘度法 原理：酶作用于具粘性的非淀粉多糖底物，使粘度下降，通過粘度計測定流速改變來計算酶活力。該法靈敏度較高，可形象反映外切酶在動物體內的作

6、用方式，較適宜于飼用酶活性的測定。 特點：重復性差 ，費時、操作復雜、單位難以換算成國際單位 。第十四張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 瓊脂平板擴散法 原理：將NSPS 底物與瓊脂混融制成瓊脂平板，將酶樣點于瓊脂板上的小孔中，培養(yǎng)一定時間，選用能與底物發(fā)生顯色反應的顯色劑染色，顯示出染色背景區(qū)和無色透明的水解區(qū)，水解區(qū)直徑與酶量的對數(shù)呈正相關，由水解區(qū)直徑計算酶活力。 特點：靈敏度高，是還原糖法的100倍，測定所需樣品量微，無需特殊設備。第十五張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月4. 可溶性的染色底物 原理：人工合成的含色原基團的底物在酶的作用下釋放出有色物質，利用分光光度

7、計比色測定有色物質含量，計算酶活力。 特點：重復性好，操作簡便，靈敏度較高 ，但合成底物與天然底物有區(qū)別，對結果的準確性可能有影響 ，并且底物昂貴。第十六張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月D. 脂肪酶 原理：脂肪酶在一定條件下 ，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯和甘油，所釋放的脂肪酸，可用標準堿溶液進行中和滴定，用pH或酚酞指示反應終點，根據(jù)消耗的堿量，計算其酶活。 反應式為： RCOOH + NaOH RCOONa + H2O第十七張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月E. 植酸酶 1.國標法（釩鉬酸銨法） 原理：利用植酸酶水解植酸鈉產生無機磷，再加入酸性鉬釩試劑終止反應，同時

8、與無機磷反應生成黃色釩鉬磷絡和物，在415nm比色測定含磷量，再以標準植酸酶為參照物，間接計算被測樣品中植酸酶的含量。第十八張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月E. 植酸酶 2.硫酸亞鐵鉬藍法 原理：利用植酸酶可以水解植酸酶釋放無機磷的原理，通過加入鹽酸使水解反應停止，然后加入鉬酸銨及FeSO47H2O的混合液使溶液顯色，在720nm波長下測定其吸收值，以標準酶為參照物，間接計算被測樣品中植酸酶的含量。 第十九張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月E. 植酸酶 3.丙酮磷鉬酸銨法 原理：磷酸鹽與過量的鉬酸銨在酸性條件下混合后，可慢慢生成黃色磷鉬酸銨，加入丙酮后使黃色物質提出來，在35

9、5nm波長處測吸光度，靈敏度增加10倍。 特點：釩鉬酸銨法靈敏度最高，丙酮法穩(wěn)定性最好，抗干擾能力較強。第二十張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月E. 植酸酶 4. VC鉬藍法 原理：該方法是利用植酸酶可以水解植酸磷釋放無機磷的原理，通過加入三氯乙酸使反應停止，然后加人鉬酸銨與VC的混合液，使溶液顯色，在820nm波長下測定吸光度，再以標準磷溶液的吸光度及磷溶液濃度對應的酶活單位建立直線回歸方程，最后以待測樣品吸光度代人方程，計算出酶活性。 第二十一張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月影響酶活力的主要因素A.底物種類和濃度B.酶活力單位定義C.酶反應pH值D.酶反應溫度E.酶反應時

10、間第二十二張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月A.底物種類和濃度 同種方法采用不同底物測定，結果相差很大。 例如木聚糖酶的檢測，燕麥木聚糖與樺木木聚糖的測定結果就有明顯差距。 第二十三張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月底物濃度對酶反應速度的影響圖第二十四張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月B. 酶活力單位定義 國際酶學會標準單位：在特定條件下，1分鐘內能轉化1umol底物的酶量，稱一個國際單位（IU）。 酶活計算公式： 酶活性 (U/g) = A D 1000 0.210150.13 W其中:A 比色測定的木糖量，mg/ml；D 稀釋倍數(shù)；1000 當量換算因數(shù)，mmol-

11、 umol ；W 酶樣品重量，g；150.13 木糖的分子量，mg/mmol；10 反應時間，分鐘。第二十五張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月B. 酶活力單位定義 木聚糖酶的活性定義A：在測定條件下，1秒鐘從燕麥木聚糖中產生1nmol木糖所需的酶量。 酶活計算公式： 酶活（IU）= A D 1,000,000 0.2 600 150.13 W 其中: A 比色測定的木糖量，mg/ml； D 稀釋倍數(shù)； 1,000,000 當量換算因數(shù)，mmol- nmol； W 酶樣品重量，g； 150.13 - 木糖的分子量，mg/mmol。 600 反應時間，秒。第二十六張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作

12、于2022年6月C. 酶反應pH值 pH影響酶活力的因素: 影響酶蛋白構象，過酸或過堿會使酶變性。影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響ES形成。影響酶和底物分子中另一些基團解離，這些基團的離子化狀態(tài)影響酶的專一性及活性中心構象。影響酶與底物的結合，極度pH的條件引起酶蛋白的變性。第二十七張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月C. 酶反應pH值最適pH：使酶促反應速度達到最大時的介質pH。 最適pH一般接近在48 之間.第二十八張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月D. 酶反應溫度 溫度對酶促反應速度的影響有兩個方面： 提高溫度，加快反應速度。 提高溫度，酶變性

13、失活。 這兩種因素共同作用，在小于最適溫度時，前一種因素為主；在大于最適溫度時，后一種因素為主。 最適溫度就是這兩種因素綜合作用的結果。 第二十九張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月D. 酶反應溫度第三十張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月E. 酶反應時間 酶反應方程式： 隨著生成物濃度的增加，酶反應速度減慢，當生成物達到某一濃度，酶反應即停止。第三十一張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月E. 酶反應時間 從圖中可以看到，反應速度只在最初一段時間內保持恒定，隨著反應時間的延長，由于底物濃度降低，產物反饋抑制，逆反應速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反應速度逐漸下降，最后完全停

14、止。第三十二張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月E. 酶反應時間 在測定酶促反應速度時，要避免以上干擾因素，必須在酶促反應初期進行，在最初這段時間內的反應速度稱之為反應初速度，在過量的底物存在下，反應初速度與酶濃度成正比。第三十三張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月F.激活劑、抑制劑 凡是能提高酶活性的物質，都稱為激活劑。 激活劑作用包括兩種情況：一種是由于激活劑的存在，使一些本來有活性的酶活性進一步提高，這一類激活劑主要是離子或簡單有機化合物。另一種是激活酶原，無活性有活性，這一類激活劑可能是離子或蛋白質。第三十四張，PPT共三十七頁，創(chuàng)作于2022年6月G.舉例 2種木聚糖酶測定方法的比較測定條件 方法1 方法2 溫度 55 50 pH 5.3 5.5緩沖液 0.05M醋酸鈉緩沖液 0.1M 醋酸鈉緩沖液 反應時間 10min 30min 底物濃度 1木聚糖 1.2%木聚糖 加酶量 0.2ml 1ml