佛山市疾病預(yù)防控制中心廖華樂

1、佛 山 市 疾 病 預(yù) 防 控 制 中 心 廖 華 樂 人禽流感樣品采集、運輸、防護(hù)和檢測技術(shù)規(guī)范1禽流感病毒病原學(xué)2禽流感：禽流感（Avian Influenza, AI） ：是一種病死率很高的禽類呼吸系統(tǒng)乃至全身性癥狀的傳染病。禽流感于1878年首次報道于意大利，當(dāng)時被稱為雞瘟（Fowl plague）。 后來在“雞瘟”中另列出一種類似疾病 雞新城疫。1900年證實禽流感的病原為濾過性病毒真性雞瘟病毒（FPV），直至1955年才證實為甲型流感病毒的一員?？煞譃楦咧虏⌒?、低致病性、非致病性三類。3流感病毒-正粘病毒科，流感病毒屬。 由甲（A）、乙（B）、丙（C）三種型別組成。甲型流感病毒的危

2、害程度最大，宿主范圍廣泛，除可感染人而引發(fā)世界性流感大流行外，也在動物中廣泛存在而導(dǎo)致動物流感流行，并可造成大量動物死亡。乙型流感病毒的宿主范圍很窄，危害程度也較小，一般呈散發(fā)或小型流行。丙型流感僅呈散發(fā)流行。4Influenza Viruses (143,000)5流感病毒結(jié)構(gòu)NA，NM2 蛋白(only on type A)HA，H核糖核蛋白RNP（RNA核蛋白NP）雙層類脂質(zhì)囊膜基質(zhì)蛋白M16病毒形態(tài) 外形：球形、絲狀、或多形態(tài) 大?。呵蛐?0120nm 絲狀可長達(dá)4000nm病毒結(jié)構(gòu)囊膜（包膜） 雙層類脂質(zhì)鑲嵌HA（識別宿主）、NA（協(xié)助釋放）抗原性多變亞型特異性膜蛋白 基質(zhì)蛋白M1（

3、維持外形，保護(hù)核殼體） 抗原性穩(wěn)定型特異性核殼體 核糖核蛋白RNP（RNA核蛋白NP） 雙螺旋對稱（915nm） 3種多聚酶抗原性穩(wěn)定型特異性基 因 組 負(fù)性單鏈RNA（ssRNA），分段8段（丙型7段） 分子量：41065106 d7H 亞型N 亞型1980年前1980年后宿 主1980年前1980年后宿 主Hsw1，H0，H1H1N1N1H2H2N2N2H3，Heq2，Hav7H3Nav2，Nav3N3Hav4H4Nav4N4Hav5H5Nav5N5Hav6H6Nav1N6Heq1，Hav1H7Neq1N7Hav8H8Neq2N8Hav9H9Nav6N9Hav2H10Hav3H11Hav1

4、0H12Hav11H13H14H15甲型流感病毒亞型的命名和宿主范圍：8目前已知甲型流感病毒可感染數(shù)十種禽類（尤其水禽）以及馬、豬和其它動物。禽流感病毒是甲型流感病毒中感染禽類的多種亞型的總稱。禽流感病毒廣泛存在于禽類當(dāng)中，尤其是水禽，但通常只屬于非致病或低致病性毒株。9禽流感病毒對熱、紫外線、 pH、有機溶劑敏感。在56 30min即被滅活（但在-70可長期保存）；1高錳酸鉀或碘酒處理3min可滅活；75%酒精處理5min可滅活；用醋酸蒸熏在一定環(huán)境、和一定程度上也可滅活空氣中的病毒。 未發(fā)現(xiàn)通過煮食禽鳥、蛋而感染禽流感。理化特性：10由于流感病毒具有： RNA（校對和修復(fù)功能差），分段的基

5、因組 復(fù)制周期短，感染頻率高 宿主種類繁多因此在其感染和復(fù)制的過程中極容易發(fā)生變異，從而產(chǎn)生新毒株或新亞型（變種），這在甲型流感病毒中最為突出。這是流感病毒的一個重要進(jìn)化機制，反映出病毒的適應(yīng)性和生存能力很強。這種快速而持續(xù)的變異，使得機體免疫系統(tǒng)不能對流感病毒產(chǎn)生長期的免疫力，從而導(dǎo)致流感的反復(fù)流行。流感病毒的變異：11流感病毒變異的兩種主要形式：抗原漂移（Antigenic Drift） ： 主要抗原基因（H 或 N）的突變：錯換、缺失等， 從而產(chǎn)生新毒株， 可導(dǎo)致每年或每隔幾年的小流行。 抗原轉(zhuǎn)換（Antigenic Shift） ： 基因的重新整合或其它宿主病毒基因的進(jìn)入（重配）， 從

6、而產(chǎn)生新亞型（主要是甲型）， 可導(dǎo)致世界性的大流行。12RRNAHRNAHaemagglutininNeuraminidaseAntibodiesSialic acid抗原漂移（Antigenic Drift） ：13抗原轉(zhuǎn)換（Antigenic Shift） ：14開始結(jié)束名 稱流行株重配情況19181919西班牙流感A/倫敦/1/35（HswN1） 由人病毒與豬病毒基因組合而成，由豬傳給人。19571958亞洲流感A/新加坡1/57（H2N2） 5個人病毒片段 3個野鴨病毒片段 19681969香港流感A/香港/1/68（H3N2） 6個人病毒片段 2個野鴨病毒片段 19771978俄羅斯

7、流感 二十世紀(jì)由于病毒變異造成的世界流感大流行 ：15時間發(fā)生地流行情況病原體基因特性1997香港發(fā)病18（死6）H5N1所有片段均來自禽鳥同源性99.92003香港發(fā)病2（死1）H5N1兩株病毒相似，純禽鳥基因但與97年毒株不同2004越南等發(fā)病31（死22）H5N1人、禽毒株之間的同源性：HA 98.6, NA 98.4NP 99.5 人禽流感病原體的基因特性：16樣品采集、運輸和保存人禽流感17標(biāo)本采集對象： 人禽流感病人 人禽流感疑似病人 病人或病禽的密切接觸者（需要時采集） 標(biāo)本采集人員： 醫(yī)療機構(gòu)的醫(yī)生、護(hù)士 當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心專業(yè)人員18采集單位應(yīng)指定專人負(fù)責(zé)標(biāo)本的登記、收集和

8、管理。采樣時應(yīng)認(rèn)真填寫“標(biāo)本采集登記表”。標(biāo)本應(yīng)放在已滅菌的帶螺旋蓋（有密封墊圈）的塑料管中，以防止開/關(guān)標(biāo)本管時，產(chǎn)生氣溶膠。塑料管應(yīng)耐深低溫。應(yīng)直接在采樣管上用油性記號筆寫明樣品種類、姓名、編號、采樣日期。標(biāo)本采集要求：19采集時間咽、鼻拭子應(yīng)在發(fā)病的頭3天采集。保存器械15 ml螺口塑料管。采集方法咽拭子采集是用棉簽適度用力擦拭雙側(cè)咽后壁部位，應(yīng)避免觸及舌部。鼻咽拭子是將棉簽平行于上顎插入鼻孔，保持幾秒鐘，吸收分泌物；拭抹雙側(cè)鼻孔。處理方法采集完后，迅速將拭子放到有旋轉(zhuǎn)蓋的并裝有病毒保存液的帶墊圈的螺口塑料管凍存管中,在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋。患者的咽、鼻拭子標(biāo)本： （病原學(xué)標(biāo)本

9、） 20采集時間含漱液應(yīng)在發(fā)病的頭3天采集。保存器械50 ml螺口塑料管。采集方法含漱5-10 mL無菌鹽水，收集液體到保存管中?；颊叩暮簶?biāo)本： （病原學(xué)標(biāo)本） 21采集時間病人死亡后應(yīng)盡早進(jìn)行解剖，同時采集組織標(biāo)本。 保存器械50 ml螺口塑料管。采集部位肺、氣管、腎、脾、肝、心臟、腦、血凝塊等組織和淋巴結(jié)等重要器官。應(yīng)盡量采集多種組織，每種組織應(yīng)多部位取材。采集方法分別采集上述標(biāo)本置于保存管中，每一采集部位分別使用不同消毒器械。處理方法立即置于-70以下保存或冷送至有關(guān)實驗室?；颊叩氖瑱z組織標(biāo)本： （病原學(xué)標(biāo)本） 22采集時間急性期血清在發(fā)病后7天內(nèi)采集；恢復(fù)期血清在發(fā)病后2-4周采集

10、。采集器械醫(yī)用（5ml和10ml）一次性注射器、5 ml(真空)針管、止血帶、無菌棉拭子、標(biāo)本標(biāo)簽、創(chuàng)可貼、可封口塑料袋、標(biāo)本采集表格、帶有冰袋的冰盒。保存器械全血收集管：10ml螺口塑料管。血清保存管：2 ml螺口塑料管?；颊叩难鍢?biāo)本（A）： （血清學(xué)標(biāo)本） 23采集方法采集3-5ml全血加入滅菌的收集管中，不加抗凝劑。處理方法將全血離心1000rpm 10分鐘。在無菌條件下，小心吸取血清到滅菌的保存管中，避免吸到紅血球。全血標(biāo)本應(yīng)保存在4-8。在運輸前，血清標(biāo)本保存在4-8最多不能超過24小時。-20以下長期保存。注意事項必須采集病人的急性期和恢復(fù)期雙份血清?；颊叩难鍢?biāo)本（B）： （血

11、清學(xué)標(biāo)本） 24標(biāo)本應(yīng)放在已滅菌的帶螺旋蓋（有密封墊圈）的塑料管（A）中（必要時還需一式兩份分裝）。直接在標(biāo)本管（A）上用油性記號筆寫明樣品種類、姓名、編號、采樣日期。將密閉后的標(biāo)本管放入大小適合的塑料袋（B）內(nèi)密封，每袋裝一份標(biāo)本。將標(biāo)本的有關(guān)信息填在“廣東省禽流感疑似病例樣品送檢登記表”，連同裝有標(biāo)本管的塑料袋（B）一起密封在另一塑料袋（C）內(nèi)。標(biāo)本包裝要求（一）：25將裝有標(biāo)本管和送檢表的塑料袋（C）放入另一個帶螺旋蓋（有密封墊圈）、耐受一定壓力的塑料管容器（D）中，內(nèi)填吸水和具緩沖能力的物質(zhì)，外面印有生物危險標(biāo)記。 該容器（D）可采用具有相當(dāng)功能的物品代替。同一患者2份以上的標(biāo)本，經(jīng)獨

12、立包裝后，可放在同一個容器（D）內(nèi)。將裝有標(biāo)本管和送檢表的塑料容器（D）放入專用運輸箱（E）內(nèi)，放入冰排，并用柔軟物質(zhì)填充，關(guān)緊箱蓋。標(biāo)本包裝要求（二）：2627282930標(biāo)本采集后應(yīng)盡快進(jìn)行密封包裝，并置于冰塊環(huán)境中（預(yù)先準(zhǔn)備冰壺），在2小時內(nèi)盡快送至當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制機構(gòu)。如不能立即送交，可置于-20以下（全血為48）冰箱短暫保存不超過24小時。標(biāo)本應(yīng)由專業(yè)人員專人運送，最好使用專車。標(biāo)本保存和運送要求：31標(biāo)本的接收（一）：廣東省設(shè)立8個人禽流感標(biāo)本指定接收單位： 廣州、深圳、佛山、韶關(guān)、汕頭、云浮、湛江、珠海CDC。32標(biāo)本的接收（二）：上述8各指定接收單位負(fù)責(zé)接收本轄區(qū)內(nèi)的標(biāo)本，并實

13、行24小時標(biāo)本接收制度。佛山市的人禽流感標(biāo)本送往： 佛山市疾病預(yù)防控制中心 地址：佛山市普君南路103號 聯(lián)系 ：83268034，8337201533職業(yè)暴露人員防護(hù)措施34防護(hù)原則：所有禽流感職業(yè)暴露人員應(yīng)按照禽流感職業(yè)暴露人員防護(hù)指導(dǎo)原則（試行）做好個人防護(hù)。實行分級防護(hù)。防護(hù)對象： 禽流感職業(yè)暴露人員 醫(yī)務(wù)人員 疾病預(yù)防控制機構(gòu)人員 其他有關(guān)人員35防護(hù)用品技術(shù)要求防護(hù)服一次性使用，符合 GB19082-2003 標(biāo)準(zhǔn)。防護(hù)口罩符合 GB19083-2003 標(biāo)準(zhǔn)。防護(hù)眼鏡視野寬闊，透明度高，防濺性好，彈力帶佩帶。手套醫(yī)用一次性乳膠手套、或橡膠手套。鞋套為防水、防污染鞋套。長筒膠鞋醫(yī)用

14、工作服醫(yī)用工作帽36適用范圍A. 禽流感疑似或確診病例的密切接觸者及病死禽的密切接觸者進(jìn)行醫(yī)學(xué)觀察和流行病學(xué)調(diào)查的人員。B. 疫點周圍3公里范圍內(nèi)（疫點除外）的家禽進(jìn)行捕殺和無害化處理及對禽舍和其它場所進(jìn)行預(yù)防性消毒的人員。防護(hù)要求戴16層棉紗口罩（使用四小時后，消毒更換），穿工作服，戴戴工作帽和乳膠手套對B類人員，還應(yīng)戴防護(hù)眼睛、穿長筒膠鞋、帶橡膠手套每次實施防治處理后,應(yīng)立即進(jìn)行手清洗和消毒，一級防護(hù)：37適用范圍A. 進(jìn)入醫(yī)院污染區(qū)的人員；采集疑似病例、確診病例咽拭子的人員；處理其分泌物、排泄物的人員；處理病人使用過的物品和死亡病人尸體的人員以及轉(zhuǎn)運病人的醫(yī)務(wù)人員和司機。B. 對禽流感疑

15、似或確診病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查的人員。C. 在疫點內(nèi)對禽流感染疫動物進(jìn)行標(biāo)本采集、捕殺和無害化處理 以及進(jìn)行終末消毒的人員。防護(hù)要求穿普通工作服、戴工作帽、外罩一層防護(hù)服、戴防護(hù)眼鏡和防護(hù)口罩（離開污染區(qū)后更換），戴乳膠手套、穿鞋套。進(jìn)行家禽的宰殺和處理時，應(yīng)戴橡膠手套，穿長筒膠鞋。每次實施防治處理后應(yīng)立即進(jìn)行手清洗和消毒。二級防護(hù)：38適用范圍確定禽流感可由人傳染人時，對病人實施近距離治療操作例如氣管插管、氣管切開的醫(yī)務(wù)人員。 防護(hù)要求除按二級防護(hù)要求外，將口罩、防護(hù)眼鏡換為全面型呼吸防護(hù)器（符合N95或FFP2級標(biāo)準(zhǔn)的濾料）。三級防護(hù)：39穿戴防護(hù)用品順序注意事項步驟 1戴口罩一手托住口罩，

16、扣于面部適當(dāng)部位，另一手將口罩帶戴在合適的部位，壓緊鼻夾。注意雙手不要接觸面部任何部位。步驟 2戴帽子雙手不要接觸面部。步驟 3穿防護(hù)服步驟 4戴防護(hù)眼鏡雙手不要接觸面部。步驟 5穿鞋套或膠鞋步驟 6戴手套將手套套在防護(hù)服袖口外面。40脫掉防護(hù)用品順序注意事項步驟 1摘下防護(hù)眼鏡摘下后放入消毒液中。步驟 2脫掉防護(hù)服將里面朝外，放入黃色塑料袋中。步驟 3摘下手套一次性手套同步驟2，橡膠手套放入消毒液中。步驟 4脫掉帽子用手指反掏進(jìn)帽內(nèi)將帽摘下，處理同步驟2。步驟 5脫掉鞋套或膠鞋鞋套同步驟2，膠鞋放入消毒液中。步驟 6摘下口罩一手按住口罩，另一手將口罩帶摘下，放入黃色塑料袋中，注意雙手不要接觸

17、面部。41對洗手的要求：接觸確診禽流感病人和疑似病人前后；接觸血液、體液、排泄物、分泌物和被污染的物品后；進(jìn)入和離開隔離病房穿戴防護(hù)用品前、脫掉防護(hù)用品后；在同一病人身上，從污染操作轉(zhuǎn)為清潔操作之間；戴手套之前，摘手套之后。手的清洗：42標(biāo)準(zhǔn)洗手方法：1. 掌心對掌心搓擦2. 手指交錯掌心對手背搓擦43標(biāo)準(zhǔn)洗手方法：3. 手指交錯掌心對掌心搓擦4. 兩手互握互搓指背44標(biāo)準(zhǔn)洗手方法：5. 拇指在長中轉(zhuǎn)動搓擦6. 指尖在掌心中搓擦45對手消毒的要求：接觸每例確診禽流感病人和疑似病人之后；接觸感染的傷口和血液、體液、排泄物和分泌物之后；離開隔離病房、ICU等污染區(qū)域脫掉防護(hù)用品后；接觸被禽流感病毒

18、污染的物品之后。 手的消毒：46可用0.30.5碘伏消毒液或快速手消毒劑（異丙醇類、洗必泰-醇、新潔爾滅-醇、75酒精等消毒劑）揉搓作用13分鐘。手消毒的方法：47廢棄物的處理：現(xiàn)場使用過的一次性防護(hù)用品可在現(xiàn)場焚毀。非一次性使用的防護(hù)用品要進(jìn)行高壓或浸泡消毒。標(biāo)本采集過程中的廢棄物可在現(xiàn)場焚毀?；蚴占诶喂趟芰洗?，高壓消毒。48人禽流感檢測技術(shù)49標(biāo)送本至實驗室后，盡快進(jìn)行處理及檢測。如果在24小時內(nèi)檢測，標(biāo)本可放4保存。如果未能安排檢測，則放-20 保存。需要長期保存的標(biāo)本應(yīng)置于-70。50采集鼻咽標(biāo)本病毒分離采集雙份血清快速抗原檢測核酸檢測組織培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)免疫色譜免疫熒光RT-PCR補

19、結(jié)試驗血抑試驗微量中和試驗 實驗檢測方案：51材料咽、鼻拭子或含漱液。經(jīng)RT-PCR確診為H5的標(biāo)本，必須在生物安全級實驗室進(jìn)行。應(yīng)嚴(yán)格控制標(biāo)本與標(biāo)本之間、不同宿主的標(biāo)本之間、不同時期的標(biāo)本之間的交叉污染尸檢肺組織、氣管分泌物等。方法雞胚和MDCK細(xì)胞分離方法。血凝抑制試驗（HAI）。試劑SPF雞胚、MDCK細(xì)胞?？?H1、H3、H5、H9、B等標(biāo)抗。特點金標(biāo)準(zhǔn)，可分亞型，耗時(5-7天)。病毒分離及鑒定： GB 15994-1995 流行性感冒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則 廣東省流感監(jiān)測工作規(guī)范2004年52選擇有典型癥狀的流感樣病人準(zhǔn)確和有效地采集病人咽喉、鼻分泌物保持良好的保存和運輸條件良好的病毒分離技術(shù)人禽流感病毒分離實驗的關(guān)鍵：53Growth of flu virus in embryonated eggs54Growth of flu virus in MDCK55Growth of flu virus in MDCK56材料咽、鼻拭子或含漱液。病毒分離物。方法免疫色譜法、金標(biāo)法等。試劑商品化試劑盒。用途甲或乙型