谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定

1、實驗十七 谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測定Exp.17 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase 1一、實驗原理 氨基移換酶也稱轉(zhuǎn)氨酶,為廣泛存在于生物機(jī)體內(nèi)的酶，其作用為催化-氨基酸的- 氨基與- 酮酸的- 酮基互換。因此在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中間代謝過程中有重要作用。轉(zhuǎn)氨酶的種類甚多。 任何一種氨基酸進(jìn)行轉(zhuǎn)氨作用時，都由其專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，它們的最適pH接近7.4。2 在各種轉(zhuǎn)氨酶中，谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷草轉(zhuǎn)氨酶）及谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（簡稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶）活力最強(qiáng)。 上述兩種轉(zhuǎn)氨酶均廣泛存在于機(jī)體組織內(nèi)，在正

2、常人血清中也有少量，機(jī)體發(fā)生肝炎。心肌梗塞等病變時，血清中轉(zhuǎn)氨酶活力顯著增加，所以在臨床診斷上轉(zhuǎn)氨酶活力的測定有重要意義。它們的催化反應(yīng)如下：3COOH COOH COOH COOH CHNH2+ C=O C=O + CHNH2CH3 (CH2)2 CH3 (CH2)2COOH COOH轉(zhuǎn)氨酶 丙氨酸 -酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸4 測定轉(zhuǎn)氨酶活力的方法很多，如分光光度法，紙上層析法等。在本方法中，谷丙轉(zhuǎn)氨酶作用于丙氨酸和酮戊二酸后，生成的丙酮酸與2,4 二硝基苯肼作用生成丙酮酸2,4 二硝基苯腙。 本方法中用分光光度法，根據(jù)硝基苯腙的生成量可以計算酶的活力。5二、實驗用品 1、材料新鮮動物肝勻

3、漿。2、試劑（1）0.1M磷酸緩沖液（pH=7.4） 取0.1M KH2PO4液50ml，0.1N NaOH液39.3ml，再加蒸餾水10.7ml，混勻即得。（2）丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（2.0微克分子/ml）： 取AR丙酮酸鈉11mg溶解于50ml 0.1M磷酸緩沖液內(nèi)（宜當(dāng)日新配）。6（3）谷丙轉(zhuǎn)氨酶底物： 取分析純酮戊二酸29.2mg，DL丙氨酸1.79g置于小燒杯內(nèi)，加1N NaOH約10ml至完全溶解。用1N NaOH或1N HCl校正其pH=7.4，加0.1M磷酸緩沖液稀釋至100ml，然后加氯仿數(shù)滴防腐，在冰箱內(nèi)可保存一周。此溶液每1.0ml含 酮戊二酸2.0微克分子，丙氨酸200微克分

4、子。（4）2，4二硝基苯肼溶液： 將AR純2，4二硝基苯肼19.8mg加入200ml錐形瓶內(nèi)，加100ml 1N HCl液。2，4二硝基苯肼溶解較慢，把錐形瓶放在暗處不時搖動，全部溶解后，濾入褐色玻璃瓶。并置于冰箱中保存。（5）0.4N氫氧化鈉液。3、儀器設(shè)備 試管、吸量管、恒溫水浴鍋、分光光度計7三、方法和步驟1、肝勻漿制備： 取新鮮動物肝臟，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取肝臟0.5g，剪成小塊，置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入4.5ml預(yù)冷的pH 7.4 0.1 mol/L磷酸緩沖液，制成10%肝勻漿，冰凍保存。 82、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取6支試管分別用0、1、2、3、5標(biāo)號，按下表所列次序添加各試劑。 將試管于37水浴中保溫，平衡管內(nèi)外溫度, 向各管內(nèi)加0.5ml 2，4二硝基苯肼后再保溫20分鐘， 最后分別向各管內(nèi)加入0.4N NaOH 5毫升， 在室溫下靜置30分鐘后， 以0號管做“空白”用520nm進(jìn)行比色，讀出光吸收值，以丙酮酸的微摩數(shù)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。9表1.丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制10表2.谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活力的測定2、谷丙轉(zhuǎn)氨酶酶活力的測定11四、實驗結(jié)果用光吸收值讀數(shù)在操作曲線上查出轉(zhuǎn)氨酶活力單位數(shù)