抗原決定簇選擇

1、關于抗原決定簇選擇第一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月報告內(nèi)容 概念1 研究意義2 研究方法3第二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原表位-定義抗原表位，又稱抗原決定簇(antigenic determinant，AD)，是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，因而表位代表了抗原分子上的一個免疫活性區(qū)，負責與抗體分子或免疫細胞表面的抗原受體結合。嚴格說來，抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子的?？乖ㄟ^抗原表位與相應的淋巴細胞表面的抗原受體結合，從而激活淋巴細胞，引起免疫應答；抗原也借表位與相應抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結合而發(fā)揮免疫效應。抗原表位的性質、數(shù)

2、目和空間構型決定抗原的特異性。第三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 抗原分子以其B細胞表位與抗體分子的抗原結合部位發(fā)生互補性結合A.抗原-抗體復合物的立體構象；B.采用電腦技術將抗原和抗體分子分開，可見抗原和抗體分子的相互作用僅發(fā)生在抗原分子的B細胞表位和抗體分子的抗原結合部位之間，兩者呈現(xiàn)結構互補。C.抗體的互補決定區(qū)與抗原表位結合示意圖 C第四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一般情況下，一個多肽表位含56個氨基酸殘基；一個多糖表位含57個單糖；一個核酸半抗原的表位含68個核苷酸?？乖砦坏拇笮∨c相應抗體的抗原結合部位相適合。一個抗原表位的特異性由組成它的所有殘基共同決定

3、，但其中有些殘基在與抗體結合時比其它殘基起更大作用，這些殘基被稱為免疫顯性基團。 第五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原表位-分類覆蓋型和非覆蓋型表位 某些抗原分子表面，不同表位之間相對分離，各自結合特異性抗體，互不影響，這類表位被稱為非覆蓋型表位。 若某一表位與相應抗體結合會影響另一表位與抗體的結合，此類表位稱為覆蓋型表位。 功能性和隱蔽表位 位于抗原分子表面的表位易被相應淋巴細胞所識別，即具有易接近性，可直接啟動免疫應答，故稱為功能性表位。 存在于抗原分子內(nèi)部的表位無直接觸發(fā)免疫應答的功能，稱為隱蔽表位。若通過理化因素處理抗原，使其結構發(fā)生改變，內(nèi)部的隱蔽表位被暴露，可能成為新

4、的有功能的表位。 第六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月按表位結構不同，分為連續(xù)性抗原表位和不連續(xù)性抗原表位。連續(xù)性表位又稱線性表位，是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成通常這種結合比較弱，因為小肽并不含完整天然蛋白的構象，在多數(shù)情況下這種表位可能只代表了復雜表位的一部分。對其研究依賴于多肽固相化學合成技術。后者又稱構象型抗原表位，是由那些空間鄰近但順序上不連續(xù)的氨基酸組成。分類第七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 按照與抗原受體細胞結合不同，分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位。分類特性T細胞表位B細胞表位表位分子TCRBCRMHC分子必需無需表位性質主要是線性多肽天然的多肽、多糖

5、、脂多糖、有機化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15個氨基酸，5-7個單糖或5-7個核苷酸表位類型線性表位構象、線性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面第八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月研究意義表位是蛋白質抗原性的基礎 ，研究蛋白質抗原表位， 對于設計具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型診斷試劑具有較大意義。應用：多在診斷與疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特異性診斷試劑盒中更為重要。第九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原表位研究方法 通過化學或生物學方法處理抗原分子以獲得多肽碎片，再利用單克隆抗體篩選能與之起

6、陽性反應的片段。1.1 用化學法或酶“切割”抗原，分離抗原肽段該法對蛋白質的一級結構不作要求，但測定結果只能是抗原的線性表位。化學切割法中常用的試劑：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8 蛋白酶等。水解后采用各種分離方法如SDS-PAGE、凝膠過濾、離子交換將水解片段分開，然后用Western blot，ELISA等各種檢測手段來檢測。結果可通過理論肽段分子量的推斷或相應的氨基酸序列分析來判斷。利用該法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌細胞增強蛋白、乙酰膽堿酯酶、玻璃體結合蛋白、磷脂酶基質蛋白等。1.傳統(tǒng)化學“切割”法或酶法（classical epitope

7、 mapping）第十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月研究方法1.2 水解抗原-抗體復合物 這是一個直接的確定線性及構象性抗原表位的方法，又稱為Protein footprinting。其理論依據(jù)為抗原-抗體復合物的結合部位能抵抗蛋白酶的水解。根據(jù)蛋白質抗原性質的不同常采用3種方法。對于蛋白酶水解位點較少的抗原，一般先將抗原與等摩爾抗體在PBS中反應，然后酶解，SDS分離水解產(chǎn)物，分析結果。對于蛋白酶水解位點較多的抗原，采用HPLC法，將抗原-抗體復合物的酶解片段和同樣條件下的抗原酶解片段分別用HPLC分析。兩者圖譜對應峰峰高比大于平均數(shù)值的片段則推測為抗原表位。對于能確定為線性表位

8、的抗原可先將抗體連接于固相載體上，并將此固相載體裝柱，然后讓過量的抗原溶液通過此柱，使抗原-抗體形成復合物。一定條件下，酶溶液過柱，酶解此抗原-抗體復合物，PBS洗去酶解下的不結合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下與抗體結合的肽段。HPLC分析這些片段以確定結果。近來，質譜技術在這類結果分析中得到了廣泛的應用。采用該法已成功地確定了細胞色素C，胃泌素釋放肽(GRP)，脂堿性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位。第十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 合成肽庫方法有機合成法就是直接利用固相肽合成技術，合成含有各種可能序列的短肽。通過這種合成可以保證各種序列的多肽等機率出現(xiàn)，每個載體上只

9、含有一種序列的短肽。優(yōu)點是構建方法簡單，迅速。缺點是不能擴增，篩選比較麻煩，需進行熒光標記或ELISA，在顯微鏡下操作工作量比較大。在研究構象性表位時的minotopes方法即采用類似的方法，通常從二肽開始合成并逐漸增加肽鏈長度及置換氨基酸種類，直至達到與抗體的最大結合為止。研究方法 2.1 有機合成法肽庫是大量某一長度(如六肽)的短肽的集合，它包括了該長度的短肽的各種可能序列或其中的絕大部分。第十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月該法先利用基因克隆技術將合成的一組寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至線性噬菌體基因組中，使之以融合蛋白的形式在噬菌體的外殼蛋白的氨基端表達。再利用生物

10、素或酶標記的抗體篩出特異的噬菌體，并進行擴增，再篩選，從結合特異抗體的噬菌體DNA序列推斷出氨基酸序列，并合成相應的短肽，驗證篩選結果。用此法檢測的抗原表位有人H鐵蛋白、藍舌病病毒的外殼蛋白VP5等。研究方法 2.2 基因工程法（噬菌體隨機肽篩選法）第十三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月此技術于1992年由R. Frank發(fā)展出來，它主要是將涵蓋所有抗原氨基酸序列的縮氨酸合成于固定的表面，并與抗血清標定，此法可鑒定線性抗原表位。應用肽合成技術合成連續(xù)的重疊的57肽，將這些合成的肽與相應的抗體反應，分析檢測結果，以確定陽性反應片段。這一技術要求有明確的抗原的一級結構，并且檢測結果為抗原

11、線性表位。該法應用廣泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生蟲蛋白、煙草花葉病毒(TMV)、Fy6蛋白、鴨肝炎B病毒(DHBV)等。 3 縮氨酸掃描技術 (Peptide Scan technology)研究方法第十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4 表位作圖早期表位作圖或定位(epitopemapping)是基于蛋白質修飾和降解的原理，可經(jīng)側鏈化學修飾法選擇性地標記氨基酸，失去結合的部分將被測出。蛋白質抗原被降解為小片段，經(jīng)測序后確定抗體結合的位點。要確定某一抗原的全部表位需要大量的時間?，F(xiàn)已可以通過誘變、蛋白質合成或蛋白競爭結合方法鑒定其表位。此外，表位序列測定的應用對抗

12、體結合表位的分析具有顯著的優(yōu)越性。研究方法第十五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月研究方法-表位作圖方法構象表位線性表位條件精確度競爭分析方法是，但并非經(jīng)常是標記抗體、抗原僅確定空間位置競爭基因片段表達法是，但并非經(jīng)常是必須克隆，DNA(已知基因序列)構象50-200個氨基酸 線狀10-20個氨基酸合成肽庫法否是必須建立肽庫完全繪制3-15推薦使用表位作圖方法和基本條件第十六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月研究方法從80年代Hopp和Woods提出親水性參數(shù)對抗原表位預測的方法以來，已有許多參數(shù)、算法發(fā)表，對B細胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推動作用?，F(xiàn)已被大眾認可并具有較好預

13、測效果的方法，主要有以下6種：5 抗原表位的預測法第十七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)親水性方案(Hydrophilicity) Nozaki-Tanford scale，Eisenberg scale，Kyte-Doolittle scale，HPLC scale，Hopp-Woods scaleHopp-Woods 方案認為：蛋白質抗原的氨基酸殘基可分為疏水性和親水性兩類。在機體內(nèi)，疏水性殘基一般埋在蛋白內(nèi)部，而親水性殘基位于表面，因此蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有密切的聯(lián)系。Hopp-Woods方案是以殘基由有機相環(huán)境轉移到水相環(huán)境的自由能為依據(jù)計算各個氨基酸的親水性。

14、現(xiàn)已明確，親水性部位與抗原表位并無很好的一致性，即高親水性部位不一定是表位，表位也不一定是親水性部位?？乖砦坏念A測法第十八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(2)可及性方案(Accessibility)如Janin可及性參數(shù)，指蛋白質抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性。它反映了蛋白質抗原內(nèi)、外各層殘基的分布情況。B細胞抗原表位的預測法第十九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)抗原性方案(Antigenicity)對20個已研究得很透的蛋白質的69個連續(xù)位點的606個氨基酸統(tǒng)計分析，Welling建立了抗原性刻度。每個氨基酸用出現(xiàn)在抗原區(qū)的頻率描述，此頻率除以各氨基酸在

15、所有蛋白質中的頻率就可推出此刻度值。該法研究表明，疏水性氨基酸殘基對抗原表位形成亦有貢獻。缺點是其所用的數(shù)據(jù)庫有限，并且連續(xù)位點內(nèi)的殘基被認為是同等重要的。顯然那些不重要的殘基歸入計算會明顯降低相關性。抗原表位的預測法第二十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(4)可塑性方案(Flexibility)指蛋白抗原構象不是剛性不變的，其多肽鏈骨架有一定程度的活動性，活動性強的氨基酸殘基即可塑性大的位點，易形成抗原表位。Karplas 和Schulz基于已知結構的31個蛋白質，發(fā)展了一種預測蛋白質片段活動性的方法。(5)電荷分布方案(Charge distribution)認為對堿性抗原特異的

16、抗體多趨于酸性，對酸性抗原特異的抗體多趨于堿性?？乖砦坏念A測法第二十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(6)二級結構預測方案(Secondary structure)認為轉角結構為凸出結構，多出現(xiàn)在蛋白質抗原表面，利于與抗體嵌合，較可能成為抗原表位。而螺旋、片層結構規(guī)則不易形變，較難嵌和抗體，一般不作為抗原表位?？深A測蛋白質轉角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等方法。其中各種方法預測的成功率均不超過65%。一般認為Cohen方法對轉角的預測正確率很高，對于已知折疊類型的蛋白質(類，類，/類)正確率高達95%，對于未知結構類型的蛋白質，可用3種類型分別預測，3類

17、預測一致的轉角對預測表位有幫助?？乖砦坏念A測法第二十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月對上述各種參數(shù)的預測比較表明，各種方案預測的正確率均不高。一般將上述多種方案綜合考慮，尤以可及性方案、可塑性方案、抗原性方案及二級結構預測為重要。已經(jīng)有一些文獻提出了各自不同的綜合分析方法。1988年Jameson和Worf提出一種綜合預測方案。權重選擇為：40%來自二級結構成分，可及性、柔韌性各15%，30%來自親水性。在吳加金等編的Goldkey軟件中，以六種參數(shù)Hopp-Woods，HPLC，Accessibility，F(xiàn)lexibility，Charge，Antigenivity綜合考慮，

18、得出綜合判斷圖，閾值以上的峰即認為是預測的抗原表位。從軟件預測出的抗原表位須用實驗來進一步驗證?？乖砦坏念A測法第二十三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月以往合成的序列肽僅模擬蛋白質的線性表位，這無疑會遺漏眾多的構象性表位信息。近些年來,隨著生物信息學和分子生物學技術的飛速發(fā)展，采用計算機預測和試驗相結合的方法進行構象性表位分析和定位得到了迅速發(fā)展，一些可用的基于Web的預測軟件已經(jīng)公布，如 CEP軟件、DiscTope 軟件和 MEPS軟件。應用噬菌體展示肽庫技術結合計算機建模進行構象性表位預測是另一類預測 B 細胞構象性表位的方法。即利用抗體篩選噬菌體肽庫，獲取抗體親和性模擬肽，對

19、模擬肽集合進行比對處理，獲得探針基序，然后利用探針基序在抗原蛋白表面搜索最佳匹配的氨基酸序列，獲得的序列即作為預測結果。1990 年 Scott首次將噬菌體隨機肽庫技術應用于抗原定位。目前提供的基于 Web 的預測服務算法有 Pepitope 算法、3DEX 算法和 MIMOX 算法。B 細胞構象表位的預測第二十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月T細胞表位預測主要基于候選肽能否和MHC 分子結合。T細胞表位預測分CTL表位預測和Th 表位預測兩類 ,其中 CTL 表位預測主要涉及 MHC類分子肽預測 , Th 表位預測涉及 MHC類分子的親和肽預測。與 MHC類分子結合的多肽長度通常為