抗原決定簇選擇

1、關(guān)于抗原決定簇選擇第一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月報(bào)告內(nèi)容 概念1 研究意義2 研究方法3第二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原表位-定義抗原表位，又稱抗原決定簇(antigenic determinant，AD)，是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，因而表位代表了抗原分子上的一個(gè)免疫活性區(qū)，負(fù)責(zé)與抗體分子或免疫細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合。嚴(yán)格說來，抗體的特異性是針對(duì)表位而不是針對(duì)完整的抗原分子的?？乖ㄟ^抗原表位與相應(yīng)的淋巴細(xì)胞表面的抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答；抗原也借表位與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮免疫效應(yīng)?？乖砦坏男再|(zhì)、數(shù)

2、目和空間構(gòu)型決定抗原的特異性。第三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 抗原分子以其B細(xì)胞表位與抗體分子的抗原結(jié)合部位發(fā)生互補(bǔ)性結(jié)合A.抗原-抗體復(fù)合物的立體構(gòu)象；B.采用電腦技術(shù)將抗原和抗體分子分開，可見抗原和抗體分子的相互作用僅發(fā)生在抗原分子的B細(xì)胞表位和抗體分子的抗原結(jié)合部位之間，兩者呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)。C.抗體的互補(bǔ)決定區(qū)與抗原表位結(jié)合示意圖 C第四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一般情況下，一個(gè)多肽表位含56個(gè)氨基酸殘基；一個(gè)多糖表位含57個(gè)單糖；一個(gè)核酸半抗原的表位含68個(gè)核苷酸?？乖砦坏拇笮∨c相應(yīng)抗體的抗原結(jié)合部位相適合。一個(gè)抗原表位的特異性由組成它的所有殘基共同決定

3、，但其中有些殘基在與抗體結(jié)合時(shí)比其它殘基起更大作用，這些殘基被稱為免疫顯性基團(tuán)。 第五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原表位-分類覆蓋型和非覆蓋型表位 某些抗原分子表面，不同表位之間相對(duì)分離，各自結(jié)合特異性抗體，互不影響，這類表位被稱為非覆蓋型表位。 若某一表位與相應(yīng)抗體結(jié)合會(huì)影響另一表位與抗體的結(jié)合，此類表位稱為覆蓋型表位。 功能性和隱蔽表位 位于抗原分子表面的表位易被相應(yīng)淋巴細(xì)胞所識(shí)別，即具有易接近性，可直接啟動(dòng)免疫應(yīng)答，故稱為功能性表位。 存在于抗原分子內(nèi)部的表位無直接觸發(fā)免疫應(yīng)答的功能，稱為隱蔽表位。若通過理化因素處理抗原，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，內(nèi)部的隱蔽表位被暴露，可能成為新

4、的有功能的表位。 第六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月按表位結(jié)構(gòu)不同，分為連續(xù)性抗原表位和不連續(xù)性抗原表位。連續(xù)性表位又稱線性表位，是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成通常這種結(jié)合比較弱，因?yàn)樾‰牟⒉缓暾烊坏鞍椎臉?gòu)象，在多數(shù)情況下這種表位可能只代表了復(fù)雜表位的一部分。對(duì)其研究依賴于多肽固相化學(xué)合成技術(shù)。后者又稱構(gòu)象型抗原表位，是由那些空間鄰近但順序上不連續(xù)的氨基酸組成。分類第七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 按照與抗原受體細(xì)胞結(jié)合不同，分為B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位。分類特性T細(xì)胞表位B細(xì)胞表位表位分子TCRBCRMHC分子必需無需表位性質(zhì)主要是線性多肽天然的多肽、多糖

5、、脂多糖、有機(jī)化合物表位大小8-12氨基酸(CD8-TC)12-17氨基酸(CD4-TC)5-15個(gè)氨基酸，5-7個(gè)單糖或5-7個(gè)核苷酸表位類型線性表位構(gòu)象、線性表位表位位置抗原分子任意部位抗原分子表面第八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月研究意義表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ) ，研究蛋白質(zhì)抗原表位， 對(duì)于設(shè)計(jì)具有免疫原性和中和活性的多肽、新型疫苗分子及新型診斷試劑具有較大意義。應(yīng)用：多在診斷與疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特異性診斷試劑盒中更為重要。第九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月抗原表位研究方法 通過化學(xué)或生物學(xué)方法處理抗原分子以獲得多肽碎片，再利用單克隆抗體篩選能與之起

6、陽性反應(yīng)的片段。1.1 用化學(xué)法或酶“切割”抗原，分離抗原肽段該法對(duì)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)不作要求，但測定結(jié)果只能是抗原的線性表位?；瘜W(xué)切割法中常用的試劑：CNBr，NTCB，IBA，甲醇。酶法切割常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶和V8 蛋白酶等。水解后采用各種分離方法如SDS-PAGE、凝膠過濾、離子交換將水解片段分開，然后用Western blot，ELISA等各種檢測手段來檢測。結(jié)果可通過理論肽段分子量的推斷或相應(yīng)的氨基酸序列分析來判斷。利用該法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌細(xì)胞增強(qiáng)蛋白、乙酰膽堿酯酶、玻璃體結(jié)合蛋白、磷脂酶基質(zhì)蛋白等。1.傳統(tǒng)化學(xué)“切割”法或酶法（classical epitope

7、 mapping）第十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月研究方法1.2 水解抗原-抗體復(fù)合物 這是一個(gè)直接的確定線性及構(gòu)象性抗原表位的方法，又稱為Protein footprinting。其理論依據(jù)為抗原-抗體復(fù)合物的結(jié)合部位能抵抗蛋白酶的水解。根據(jù)蛋白質(zhì)抗原性質(zhì)的不同常采用3種方法。對(duì)于蛋白酶水解位點(diǎn)較少的抗原，一般先將抗原與等摩爾抗體在PBS中反應(yīng)，然后酶解，SDS分離水解產(chǎn)物，分析結(jié)果。對(duì)于蛋白酶水解位點(diǎn)較多的抗原，采用HPLC法，將抗原-抗體復(fù)合物的酶解片段和同樣條件下的抗原酶解片段分別用HPLC分析。兩者圖譜對(duì)應(yīng)峰峰高比大于平均數(shù)值的片段則推測為抗原表位。對(duì)于能確定為線性表位

8、的抗原可先將抗體連接于固相載體上，并將此固相載體裝柱，然后讓過量的抗原溶液通過此柱，使抗原-抗體形成復(fù)合物。一定條件下，酶溶液過柱，酶解此抗原-抗體復(fù)合物，PBS洗去酶解下的不結(jié)合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下與抗體結(jié)合的肽段。HPLC分析這些片段以確定結(jié)果。近來，質(zhì)譜技術(shù)在這類結(jié)果分析中得到了廣泛的應(yīng)用。采用該法已成功地確定了細(xì)胞色素C，胃泌素釋放肽(GRP)，脂堿性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位。第十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 合成肽庫方法有機(jī)合成法就是直接利用固相肽合成技術(shù)，合成含有各種可能序列的短肽。通過這種合成可以保證各種序列的多肽等機(jī)率出現(xiàn)，每個(gè)載體上只

9、含有一種序列的短肽。優(yōu)點(diǎn)是構(gòu)建方法簡單，迅速。缺點(diǎn)是不能擴(kuò)增，篩選比較麻煩，需進(jìn)行熒光標(biāo)記或ELISA，在顯微鏡下操作工作量比較大。在研究構(gòu)象性表位時(shí)的minotopes方法即采用類似的方法，通常從二肽開始合成并逐漸增加肽鏈長度及置換氨基酸種類，直至達(dá)到與抗體的最大結(jié)合為止。研究方法 2.1 有機(jī)合成法肽庫是大量某一長度(如六肽)的短肽的集合，它包括了該長度的短肽的各種可能序列或其中的絕大部分。第十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月該法先利用基因克隆技術(shù)將合成的一組寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至線性噬菌體基因組中，使之以融合蛋白的形式在噬菌體的外殼蛋白的氨基端表達(dá)。再利用生物

10、素或酶標(biāo)記的抗體篩出特異的噬菌體，并進(jìn)行擴(kuò)增，再篩選，從結(jié)合特異抗體的噬菌體DNA序列推斷出氨基酸序列，并合成相應(yīng)的短肽，驗(yàn)證篩選結(jié)果。用此法檢測的抗原表位有人H鐵蛋白、藍(lán)舌病病毒的外殼蛋白VP5等。研究方法 2.2 基因工程法（噬菌體隨機(jī)肽篩選法）第十三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月此技術(shù)于1992年由R. Frank發(fā)展出來，它主要是將涵蓋所有抗原氨基酸序列的縮氨酸合成于固定的表面，并與抗血清標(biāo)定，此法可鑒定線性抗原表位。應(yīng)用肽合成技術(shù)合成連續(xù)的重疊的57肽，將這些合成的肽與相應(yīng)的抗體反應(yīng)，分析檢測結(jié)果，以確定陽性反應(yīng)片段。這一技術(shù)要求有明確的抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并且檢測結(jié)果為抗原

11、線性表位。該法應(yīng)用廣泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生蟲蛋白、煙草花葉病毒(TMV)、Fy6蛋白、鴨肝炎B病毒(DHBV)等。 3 縮氨酸掃描技術(shù) (Peptide Scan technology)研究方法第十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4 表位作圖早期表位作圖或定位(epitopemapping)是基于蛋白質(zhì)修飾和降解的原理，可經(jīng)側(cè)鏈化學(xué)修飾法選擇性地標(biāo)記氨基酸，失去結(jié)合的部分將被測出。蛋白質(zhì)抗原被降解為小片段，經(jīng)測序后確定抗體結(jié)合的位點(diǎn)。要確定某一抗原的全部表位需要大量的時(shí)間?，F(xiàn)已可以通過誘變、蛋白質(zhì)合成或蛋白競爭結(jié)合方法鑒定其表位。此外，表位序列測定的應(yīng)用對(duì)抗

12、體結(jié)合表位的分析具有顯著的優(yōu)越性。研究方法第十五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月研究方法-表位作圖方法構(gòu)象表位線性表位條件精確度競爭分析方法是，但并非經(jīng)常是標(biāo)記抗體、抗原僅確定空間位置競爭基因片段表達(dá)法是，但并非經(jīng)常是必須克隆，DNA(已知基因序列)構(gòu)象50-200個(gè)氨基酸 線狀10-20個(gè)氨基酸合成肽庫法否是必須建立肽庫完全繪制3-15推薦使用表位作圖方法和基本條件第十六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月研究方法從80年代Hopp和Woods提出親水性參數(shù)對(duì)抗原表位預(yù)測的方法以來，已有許多參數(shù)、算法發(fā)表，對(duì)B細(xì)胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推動(dòng)作用。現(xiàn)已被大眾認(rèn)可并具有較好預(yù)

13、測效果的方法，主要有以下6種：5 抗原表位的預(yù)測法第十七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)親水性方案(Hydrophilicity) Nozaki-Tanford scale，Eisenberg scale，Kyte-Doolittle scale，HPLC scale，Hopp-Woods scaleHopp-Woods 方案認(rèn)為：蛋白質(zhì)抗原的氨基酸殘基可分為疏水性和親水性兩類。在機(jī)體內(nèi)，疏水性殘基一般埋在蛋白內(nèi)部，而親水性殘基位于表面，因此蛋白的親水部位與蛋白抗原表位有密切的聯(lián)系。Hopp-Woods方案是以殘基由有機(jī)相環(huán)境轉(zhuǎn)移到水相環(huán)境的自由能為依據(jù)計(jì)算各個(gè)氨基酸的親水性。

14、現(xiàn)已明確，親水性部位與抗原表位并無很好的一致性，即高親水性部位不一定是表位，表位也不一定是親水性部位。抗原表位的預(yù)測法第十八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(2)可及性方案(Accessibility)如Janin可及性參數(shù)，指蛋白質(zhì)抗原中氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性。它反映了蛋白質(zhì)抗原內(nèi)、外各層殘基的分布情況。B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測法第十九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)抗原性方案(Antigenicity)對(duì)20個(gè)已研究得很透的蛋白質(zhì)的69個(gè)連續(xù)位點(diǎn)的606個(gè)氨基酸統(tǒng)計(jì)分析，Welling建立了抗原性刻度。每個(gè)氨基酸用出現(xiàn)在抗原區(qū)的頻率描述，此頻率除以各氨基酸在

15、所有蛋白質(zhì)中的頻率就可推出此刻度值。該法研究表明，疏水性氨基酸殘基對(duì)抗原表位形成亦有貢獻(xiàn)。缺點(diǎn)是其所用的數(shù)據(jù)庫有限，并且連續(xù)位點(diǎn)內(nèi)的殘基被認(rèn)為是同等重要的。顯然那些不重要的殘基歸入計(jì)算會(huì)明顯降低相關(guān)性?？乖砦坏念A(yù)測法第二十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(4)可塑性方案(Flexibility)指蛋白抗原構(gòu)象不是剛性不變的，其多肽鏈骨架有一定程度的活動(dòng)性，活動(dòng)性強(qiáng)的氨基酸殘基即可塑性大的位點(diǎn)，易形成抗原表位。Karplas 和Schulz基于已知結(jié)構(gòu)的31個(gè)蛋白質(zhì)，發(fā)展了一種預(yù)測蛋白質(zhì)片段活動(dòng)性的方法。(5)電荷分布方案(Charge distribution)認(rèn)為對(duì)堿性抗原特異的

16、抗體多趨于酸性，對(duì)酸性抗原特異的抗體多趨于堿性?？乖砦坏念A(yù)測法第二十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(6)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方案(Secondary structure)認(rèn)為轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，利于與抗體嵌合，較可能成為抗原表位。而螺旋、片層結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變，較難嵌和抗體，一般不作為抗原表位?？深A(yù)測蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等方法。其中各種方法預(yù)測的成功率均不超過65%。一般認(rèn)為Cohen方法對(duì)轉(zhuǎn)角的預(yù)測正確率很高，對(duì)于已知折疊類型的蛋白質(zhì)(類，類，/類)正確率高達(dá)95%，對(duì)于未知結(jié)構(gòu)類型的蛋白質(zhì)，可用3種類型分別預(yù)測，3類

17、預(yù)測一致的轉(zhuǎn)角對(duì)預(yù)測表位有幫助。抗原表位的預(yù)測法第二十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月對(duì)上述各種參數(shù)的預(yù)測比較表明，各種方案預(yù)測的正確率均不高。一般將上述多種方案綜合考慮，尤以可及性方案、可塑性方案、抗原性方案及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測為重要。已經(jīng)有一些文獻(xiàn)提出了各自不同的綜合分析方法。1988年Jameson和Worf提出一種綜合預(yù)測方案。權(quán)重選擇為：40%來自二級(jí)結(jié)構(gòu)成分，可及性、柔韌性各15%，30%來自親水性。在吳加金等編的Goldkey軟件中，以六種參數(shù)Hopp-Woods，HPLC，Accessibility，F(xiàn)lexibility，Charge，Antigenivity綜合考慮，

18、得出綜合判斷圖，閾值以上的峰即認(rèn)為是預(yù)測的抗原表位。從軟件預(yù)測出的抗原表位須用實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證?？乖砦坏念A(yù)測法第二十三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月以往合成的序列肽僅模擬蛋白質(zhì)的線性表位，這無疑會(huì)遺漏眾多的構(gòu)象性表位信息。近些年來,隨著生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，采用計(jì)算機(jī)預(yù)測和試驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行構(gòu)象性表位分析和定位得到了迅速發(fā)展，一些可用的基于Web的預(yù)測軟件已經(jīng)公布，如 CEP軟件、DiscTope 軟件和 MEPS軟件。應(yīng)用噬菌體展示肽庫技術(shù)結(jié)合計(jì)算機(jī)建模進(jìn)行構(gòu)象性表位預(yù)測是另一類預(yù)測 B 細(xì)胞構(gòu)象性表位的方法。即利用抗體篩選噬菌體肽庫，獲取抗體親和性模擬肽，對(duì)

19、模擬肽集合進(jìn)行比對(duì)處理，獲得探針基序，然后利用探針基序在抗原蛋白表面搜索最佳匹配的氨基酸序列，獲得的序列即作為預(yù)測結(jié)果。1990 年 Scott首次將噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)應(yīng)用于抗原定位。目前提供的基于 Web 的預(yù)測服務(wù)算法有 Pepitope 算法、3DEX 算法和 MIMOX 算法。B 細(xì)胞構(gòu)象表位的預(yù)測第二十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月T細(xì)胞表位預(yù)測主要基于候選肽能否和MHC 分子結(jié)合。T細(xì)胞表位預(yù)測分CTL表位預(yù)測和Th 表位預(yù)測兩類 ,其中 CTL 表位預(yù)測主要涉及 MHC類分子肽預(yù)測 , Th 表位預(yù)測涉及 MHC類分子的親和肽預(yù)測。與 MHC類分子結(jié)合的多肽長度通常為