化妝品原料和生產(chǎn)環(huán)境中污染菌的檢驗(yàn)

1、第一節(jié)化妝品原料的微生物檢驗(yàn)化妝品原料種類很多，性能各異，根據(jù)其性能和用途，大體上可分為基質(zhì)原料和添加劑 （輔助原料）。基質(zhì)原料是組成化妝品的主體或在該化妝品內(nèi)起主要功能的物質(zhì)，主要包括 油脂、蠟類、粉類、膠質(zhì)類、表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑等。添加劑是賦予色、香及其 他特定作用的物質(zhì)，大多為天然的含有營養(yǎng)成分或生物活性的物質(zhì)，這些成分又是微生物生 長繁殖的良好營養(yǎng)源，在一定程度上成為微生物的培養(yǎng)基，因此，檢驗(yàn)原料中的微生物很重 要。一、指標(biāo)菌及特定菌的選擇一般原料的微生物指標(biāo)菌同化妝品成品即：菌落總數(shù)、糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色 葡萄球菌、霉菌和酵母菌。粉類原料大多數(shù)是由土壤礦物質(zhì)加工而成

2、，而土壤受微生物污染 嚴(yán)重。據(jù)資料報(bào)道，土壤中的致病菌有需氧的炭疽桿菌和厭氧的破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌 等，其檢出率很高，產(chǎn)氣莢膜桿菌幾乎達(dá)100%，惡性水腫桿菌64%，破傷風(fēng)桿菌29%，肉 毒桿菌6%。這些致病菌能在土壤中生存較長時(shí)間，例如炭疽桿菌的芽抱能生存15年之久； 腸道致病菌可生存100170d ；結(jié)核桿菌能生存1年左右；破傷風(fēng)桿菌芽抱和產(chǎn)氣莢膜桿菌 也能長期在土壤中生存。在滑石粉、高嶺土、碳酸鈣等粉類原料中，經(jīng)常檢出枯草桿菌、真 菌等，因此，在粉類原料中可增加需氧芽抱桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌和破傷風(fēng)桿菌指標(biāo)。在某些 生物性原料如動(dòng)物內(nèi)臟及其提取物等可增加沙門氏菌指標(biāo)。二、樣品的預(yù)處理根據(jù)

3、原料性質(zhì)的不同，選用相應(yīng)的預(yù)處理方法，如油質(zhì)類原料可按油性或疏水性（油包 水）化妝品處理，粉類原料按粉劑化妝品樣品處理等。三、檢驗(yàn)方法各種微生物的檢驗(yàn)方法均與化妝品成品檢驗(yàn)方法相同，可參見化妝品衛(wèi)生規(guī)范中微 生物檢驗(yàn)方法。原料與成品微生物檢驗(yàn)方法最根本的不同點(diǎn)是檢驗(yàn)原料所用的稀釋液和培養(yǎng) 基中都不含有中和劑（卵磷脂和吐溫80）。如檢驗(yàn)菌落總數(shù)用普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，綠膿桿 菌增菌培養(yǎng)液可用普通肉湯，金黃色葡萄球菌增菌培養(yǎng)液用含7.5%氯化鈉肉湯，稀釋液均 用生理鹽水。四、培養(yǎng)基（1）營養(yǎng)瓊脂成分： TOC o 1-5 h z 蛋白胨20g瓊脂1520g牛肉膏5g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法：

4、將上述成分混合后，加熱溶解，調(diào)PH值為7.47.6,121C、20min高壓滅菌， 儲(chǔ)存于冷暗處備用。（2）7.5%氯化鈉肉湯成分：肉湯100mL氯化鈉7.5g制法：將上述兩種成分混合均勻，分裝，115C、20min高壓滅菌。第二節(jié)化妝品生產(chǎn)用水的微生物檢驗(yàn)方法水在化妝品的生產(chǎn)中用量極大，是化妝品的主要成分之一，水的品質(zhì)對(duì)化妝品的質(zhì)量有 著重大影響?；瘖y品生產(chǎn)用水的處理一般采用過濾吸附法、電滲析法、離子交換法等，對(duì)生 產(chǎn)用水的微生物檢測(cè)指標(biāo)有菌落總數(shù)、糞大腸菌群、霉菌和酵母菌、金黃色葡萄球菌、綠膿 桿菌。一、菌落總數(shù)菌落總數(shù)是指水樣在一定條件下(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37C,24h)需氧培養(yǎng)后1mL

5、水樣 中所含菌落數(shù)。檢驗(yàn)方法介紹如下。以無菌操作滅菌吸管吸取1mL充分混勻的水樣，加到滅菌的平皿內(nèi)，注入約15mL 已融化并冷卻到45C左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋轉(zhuǎn)平皿，使水樣與培養(yǎng)充分混勻。 每次檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)做一平行接種，同時(shí)另用一個(gè)平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。待冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使其底面朝上，置于(361)C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，進(jìn) 行菌落計(jì)數(shù)，即為1mL水樣中的菌落總數(shù)，以(CFU/mL)報(bào)告結(jié)果。二、糞大腸菌群糞大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出的，是指一群在44.5C培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖產(chǎn) 酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽抱桿菌。糞大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染 程

6、度，也反映了對(duì)人體健康潛在危害性的大小，是評(píng)價(jià)化妝品生產(chǎn)用水衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo) 之一。因生產(chǎn)用水的潔凈度較高，可采用濾膜法檢測(cè)，即將水樣通過孔徑為0.45Mm的濾膜 過濾，細(xì)菌被阻留在膜上，將濾膜貼在MFC培養(yǎng)基上，44.5C培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)典型菌落。MFC培養(yǎng)基成分：胰胨10g1.5g膽鹽3號(hào)(Bile salt No.3)或混合膽鹽 TOC o 1-5 h z 多胨5g酵母浸膏3g瓊脂15g氯化鈉5g苯胺藍(lán)0.2g乳糖12.5g蒸餾水1000mL配制方法：在1000mL蒸餾水中先加入玫紅酸(10g/L)的氫氧化鈉溶液c(NaOH)=0.2mol/L 10mL, 混勻后，取500mL加入瓊脂煮沸

7、溶解，于另外500mL蒸餾水中，加入除苯胺藍(lán)以外的其他試 劑，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，混勻調(diào)節(jié)PH值為7.4,加入苯胺藍(lán)煮沸，迅速離開熱源， 待冷卻至60左右，制成平板，不可高壓滅菌。制好的培養(yǎng)基應(yīng)存放于210C環(huán)境下，不 超過96h。EC培養(yǎng)基成分： TOC o 1-5 h z 胰蛋白胨20g磷酸氫二鉀4g乳糖5g磷酸二氫鉀1.5g膽鹽3號(hào)(Bile salt No.3)或混合膽鹽1.5g氯化鈉5g蒸餾水1000mL配制方法將上述成分溶解于蒸餾水中，115C高壓滅菌20min，冷卻至60C左右時(shí)，傾注平皿，備 用。檢驗(yàn)方法：濾膜和濾器的滅菌 將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸

8、滅菌3 次，每次15min，前兩次煮沸后需更換水洗滌23次，以除去殘留溶劑；濾器可用點(diǎn)燃的酒 精棉球火焰滅菌，也可用高壓滅菌。水樣過濾用無菌鑷子夾取滅菌濾膜的邊緣，貼放在濾床上，固定好濾器，100mL 水樣，在負(fù) 0.5atm(1atm=101.325kPa)下抽濾。將濾膜截留細(xì)菌面朝上，貼放在MFC培養(yǎng)基上(中間不得有氣泡)，將平皿倒置于 44.5C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。糞大腸菌群菌落為藍(lán)色，非糞大腸菌群菌落為灰色至奶油色。將可疑菌落接種于EC培養(yǎng)基上，44.5C培養(yǎng)24h,如產(chǎn)氣則證實(shí)為糞大腸菌群。結(jié)果計(jì)算糞大腸菌群數(shù)(CFU/100mL)=(經(jīng)證實(shí)糞大腸菌群菌落數(shù)X100)/過濾的水樣體積

9、(mL)三、霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌廣泛分布于自然界中，也可存在于水中，可引起化妝品變質(zhì)發(fā)霉，有些霉 菌還可產(chǎn)生有毒毒素，所以控制生產(chǎn)用水中的霉菌和酵母菌極為重要。在固體培養(yǎng)基上，霉菌呈放射狀生長，抱子有各種顏色；酵母菌在培養(yǎng)基表面多呈圓形 凸起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，在培養(yǎng)基深部生長的酵母菌多呈鐵餅形、三角形或多角形， 在虎紅培養(yǎng)基上呈粉紅色。檢驗(yàn)方法：吸取1mL水樣、1/10稀釋水樣各1mL,分別注入滅菌平皿中，每個(gè)稀釋度各用2個(gè) 平皿，注入融化并冷卻至45C的虎紅培養(yǎng)基，充分搖勻，凝固后倒置于28C培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h, 計(jì)數(shù)平板內(nèi)生長的霉菌和酵母菌數(shù)，如有霉菌蔓延生長，可于48h時(shí)將此平

10、板取出計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法霉菌和酵母菌菌落數(shù)(CFU/mL)：每個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)X稀釋倍數(shù)四、綠膿桿菌檢驗(yàn)方法將過濾器和濾膜滅菌備用。過濾100mL水樣，將截留細(xì)菌的濾膜置90mL肉湯培養(yǎng)基中，置37C培養(yǎng)1824h, 如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液多呈黃綠色或藍(lán)綠色，表面有一層薄菌膜。分離培養(yǎng)、染色鏡檢、氧化酶試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、明膠液 化試驗(yàn)、42C生長試驗(yàn)操作過程可見化妝品綠膿桿菌檢驗(yàn)方法。結(jié)果報(bào)告被檢水樣經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌 素試驗(yàn)陽性，即可報(bào)告被檢水樣中每100mL中檢出綠膿桿菌；或綠膿菌素試驗(yàn)陰性而液化明 膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42 C

11、生長試驗(yàn)三者皆為陽性時(shí)，也可報(bào)告被檢水樣中檢出綠膿桿菌； 反之，可報(bào)告100mL水樣中未檢出綠膿桿菌。五、金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法將過濾器和濾膜滅菌備用。過濾100mL待檢水樣，將截留細(xì)菌的濾膜置于90mL 7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中， 置于37C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。用接種環(huán)挑取增菌培養(yǎng)液，劃線接種在Baird-Parker氏培養(yǎng)基或血瓊脂培養(yǎng)基上， 置37C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2448h。如有典型菌落生長，可進(jìn)行染色鏡檢、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)(詳見化 妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法)。結(jié)果報(bào)告凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長，經(jīng)染色鏡檢，證明為革蘭氏陽性葡 萄球菌，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶

12、試驗(yàn)陽性，可報(bào)告100mL水樣中檢出金黃色葡萄 球菌；否則報(bào)告100mL水樣中未檢出金黃色葡萄球菌。第三節(jié)生產(chǎn)車間空氣中的微生物檢測(cè)化妝品生產(chǎn)車間的空氣潔凈度直接關(guān)系到化妝品的質(zhì)量，所以建立常規(guī)的車間空氣質(zhì)量 監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，及時(shí)進(jìn)行空氣凈化，可有效保證化妝品達(dá)到衛(wèi)生要求?？諝庵屑?xì)菌總數(shù)是空氣微生物污染最主要的指標(biāo)菌之一，常用的檢測(cè)方法有撞擊法采樣 檢測(cè)和自然沉降法采樣檢測(cè)。一、撞擊法采用固體撞擊式空氣微生物采樣器采樣，通過抽氣動(dòng)力，使空氣高速通過狹縫或小孔， 懸浮在空氣中的帶菌粒子因慣性作用而撞擊到培養(yǎng)基平板上，經(jīng)37C、48h培養(yǎng)后，計(jì)算出 每立方米空氣中所含的細(xì)菌菌落數(shù)。所需儀器和設(shè)備有撞擊式

13、空氣微生物采樣器及其他檢驗(yàn)微生物常用設(shè)備。所用培養(yǎng)基為普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。檢測(cè)步驟選用對(duì)空氣中細(xì)菌捕獲率大于95%且性能穩(wěn)定、便于消毒的撞擊式空氣采樣器。選擇有代表性的位置設(shè)置采樣點(diǎn)，將采樣器按操作說明安裝、消毒，根據(jù)空氣污染 情況確定采樣量，進(jìn)行采樣。采樣完畢后，將帶菌平板倒置于37C培養(yǎng)箱內(nèi)48h,計(jì)數(shù)菌落數(shù)，根據(jù)采樣流量和 采樣時(shí)間，換算成每立方米空氣中的菌落數(shù)，以(CFU/m3)報(bào)告結(jié)果。二、自然沉降法自然沉降法是利用空氣微生物粒子的重力作用，在一定時(shí)間內(nèi)將微生物粒子收集到帶有 培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，在適宜的溫度下培養(yǎng)生長成為菌落并進(jìn)行生物學(xué)觀察、計(jì)數(shù)和評(píng)價(jià)。本方法較撞擊法經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，不需特殊

14、采樣器，但此方法的檢測(cè)結(jié)果受空氣氣流和帶菌顆 粒大小的影響較大，所收集的只是一部分較大的微生物粒子，采樣條件難以控制。檢測(cè)步驟（1）根據(jù)待測(cè)空間大小及通風(fēng)口的位置選擇有代表性的點(diǎn)采樣，通常設(shè)5個(gè)或3個(gè)采樣 點(diǎn)，采樣高度為1.21.5m，采樣點(diǎn)應(yīng)離墻1m以上，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處。（2）將直徑9cm的營養(yǎng)瓊脂平板置于采樣點(diǎn)處，打開皿蓋，暴露1030min（根據(jù)空氣 的潔凈度）后，蓋上皿蓋，翻轉(zhuǎn)平板，置于37培養(yǎng)箱內(nèi)48h,計(jì)數(shù)每皿的菌落數(shù)，計(jì)算出 平均菌落數(shù)，以（CFU/m3）報(bào)告結(jié)果。此結(jié)果不能同撞擊法結(jié)果換算。第四節(jié)化妝品生產(chǎn)設(shè)備及環(huán)境物體表面微生物檢驗(yàn)一、生產(chǎn)設(shè)備的米樣儲(chǔ)存罐、灌裝

15、機(jī)、輸送管道等，用滅菌生理鹽水棉拭子，在上述設(shè)備內(nèi)側(cè)相對(duì)面各 25cm2（5cmX5cm ）面積范圍，來回均勻涂抹，并轉(zhuǎn)動(dòng)拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子放 入10mL生理鹽水試管內(nèi)振打80次，根據(jù)細(xì)菌的污染程度，可作適當(dāng)稀釋，取2mL分別注 入兩塊平皿，每皿1mL,傾注普通營養(yǎng)瓊脂，置37培養(yǎng)48h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算被檢設(shè) 備表面污染細(xì)菌的數(shù)量，如檢驗(yàn)機(jī)器的溝縫等處時(shí)，將機(jī)器拆卸，直接用棉拭子涂抹，涂抹 面積可因被檢物的形狀及大小而定。生產(chǎn)設(shè)備表面污染細(xì)菌菌落總數(shù)（CFU/cm2）=平均菌落數(shù)X稀釋度X采樣面積（cm2） X10凡接觸化妝品原料和半成品的設(shè)備、工具、管道必須用無毒、無害、抗腐蝕材料制作， 內(nèi)壁應(yīng)當(dāng)光滑，便于清潔和消毒。所有生產(chǎn)設(shè)備、工具在使用前后應(yīng)當(dāng)徹底清潔、消毒。二、操作臺(tái)采樣在臺(tái)面對(duì)角線高兩點(diǎn)（工人操作處），各25 cm2面積，用滅菌生理鹽水棉拭子，來回均 勻涂抹，并轉(zhuǎn)動(dòng)拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子放入10mL生理鹽水試管內(nèi)振打80次， 根據(jù)細(xì)菌的污染程度，可作適當(dāng)稀釋，取2mL分別注入兩塊平皿，每皿1mL，傾注普通營 養(yǎng)瓊脂，置37培養(yǎng)48h，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算操作臺(tái)表面污染細(xì)菌的數(shù)量。操作臺(tái)表面污染細(xì)菌菌落總數(shù)（C