醫(yī)院細(xì)胞遺傳室實(shí)體瘤細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備作業(yè)指導(dǎo)書(shū)

1、7.1.8 去上清，加入20 ml PBS ，打勻。7.1.8 去上清，加入20 ml PBS ，打勻。6.1 100ml DMEM 含 10%血清培養(yǎng)基醫(yī)院細(xì)胞遺傳室實(shí)體瘤細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備作業(yè)指導(dǎo)書(shū)目的規(guī)范實(shí)體瘤細(xì)胞培養(yǎng)與染色體制備過(guò)程，為臨床實(shí)體瘤細(xì)胞染色體核型分析可靠性提供質(zhì)量保證。測(cè)定方法CO2培養(yǎng)/手工收獲測(cè)定原理患者外周血培養(yǎng)細(xì)胞主要說(shuō)明全身染色體狀況，而不能說(shuō)明腫瘤標(biāo)本的染色體改變，因此通過(guò)對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞培養(yǎng)可獲得大量的腫瘤細(xì)胞，再用秋水仙素處理就可獲得大量中期分裂相的細(xì)胞，制片后可以清楚地對(duì)染色體進(jìn)行觀察。性能特征經(jīng) G 顯帶處理后可見(jiàn)300-550 條顯帶。儀器與耗材酒精燈

2、，燒杯，天平，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，冰盒，載玻片，玻片盒，光學(xué)顯微鏡，滅菌注射器（5ml） ，離心管，無(wú)菌吸管，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶，眼科鑷，眼科剪，牙科探針，一次性平皿等。試劑RPMI-1640 含 10%血清培養(yǎng)基秋水仙素濃度：20以g/ml低滲液：0.075mol/L 的 KCl 溶液卡諾固定液0.25% EDTA-trypsin生理鹽水膠原酶IV 1mg / ImlDMEM操作步驟短期培養(yǎng)法取腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞分布較多的部分。在無(wú)菌條件下，將腫瘤組織放入玻璃平皿中，用含400U/ml 雙抗的生理鹽水反復(fù)沖洗腫瘤組織2-3 次以去除血液，然后吸凈生理鹽水。在一次性平皿中用眼科手術(shù)剪將組織剪

3、成1-2mm3小塊，放入裝有25 ml 組織消化液的50ml 一次性離心管中。. 消化：空氣搖床,200rpm ， 37 20-40min 。將 50ml 一次性離心管中的組織溶液裝入離心管，離心，1000rpm, 10min。7.1.6 去上清，力口入 20ml PBS,打勻。離心，1000rpm， 10min。7.2.9 重復(fù)固定：同第8 步操作。細(xì)胞計(jì)數(shù)后以106/25 接種。7.1.1037 C 5%CO*放培養(yǎng)，每天觀察，一般3天可見(jiàn)腫瘤 細(xì)胞生長(zhǎng)。根據(jù)生長(zhǎng)情況每隔3 天換液一次。一般培養(yǎng)6 天，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)，按下列程序處理：1)加入秋水仙素(終濃度 0.04-0.08 聞/ml

4、 ),約4-6小時(shí)左 右。2)將培養(yǎng)液倒入離心管中，加入PBS或生理鹽水2-3毫升，洗凈含血清培養(yǎng)基，加0.25% EDTA-trypsin 約 2ml 消化3-5min ，含血清培養(yǎng)基終止消化。置離心管中離心，1500rpm ， 10min。低滲：加入0.075M KCl 4-6ml ，吸管吹打，37水浴10-30min 。預(yù)固定： 加入約 1.5ml 固定劑， 輕混勻 37水浴 5min， 離 心，1500rpm， 10min。固定：加入固定劑8ml 左右，輕混勻，37水浴15min。6)室溫1500rpm離心10min,去上清，約留 0.5ml。7) 重復(fù)固定：同第5 步。8)離心，15

5、00rpm, 10min,去上清。視管底細(xì)胞量適當(dāng)加入幾滴新鮮固定劑。滴片：每片1-2 滴。75烤箱烤片3 小時(shí)，第二天行顯帶處理。直接制片法取腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞分布較多的部分。在無(wú)菌條件下，將腫瘤組織放入一次性平皿，用含400U/ml 雙抗的生理鹽水反復(fù)沖洗腫瘤組織2-3 次以去除血液，然后吸凈生理鹽水。在一次性平皿中用眼科手術(shù)剪將組織剪碎，吸至裝有10ml 37 C溫育的DMEM&養(yǎng)液和秋水仙素（終濃度為1聞/ml培養(yǎng)液）的離心管中，置37c水溶60min,在此時(shí)內(nèi)每 6-8min 用吸管反復(fù)吹打細(xì)胞，以使細(xì)胞間相互充分解離。離心，1500rpm， 10min， 去上清， 加入 0.075

6、M KCl 4-6ml ，吸管吹打，37水浴10min。重復(fù)步驟4預(yù)固定：在每個(gè)離心管中加入1.5ml 的固定液，繼續(xù)37oC 水浴，5 min。離心：1500rpm,離心10min,棄上清液。固定：在離心管中加入固定液6-8ml ，立即用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，在室溫中固定15min 后， 離心， 1500rpm，10min,棄上清液。離心，1500rpm, 10min,去上清.視管底細(xì)胞量適當(dāng)加入幾滴新鮮固定劑。滴片：每片1-2 滴，75烤箱烤片3 小時(shí)，第二天行顯帶處理。針刺取材法（用于各種淋巴瘤）在無(wú)菌的條件下，用 10ml 注射器穿入淋巴組織或淋巴后抽吸。將每1ml抽吸物注入一瓶 R

7、PMI-1640含血清培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)：直立于 5%CO2 370.5 0C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 14-48 小時(shí)。秋水仙素處理：培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)基中加入濃度為20以g/ml的秋水仙素 0.05-0.1ml ,使最終濃度為 0.04-0.08以g/ml ,置5%CO2,37t 0.5 oC培養(yǎng)箱中處理 2-4小時(shí)。低滲處理：秋水仙素處理完畢后，小心地從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，用吸管吸取培養(yǎng)物入離心管，離心（1500rpm，10min）o然后加入溫育的低滲液8ml,用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，置37oC水浴處理20-30min。預(yù)固定：在每個(gè)離心管中加入1.5ml 的固定液，繼續(xù)37oC 水浴，5 min。離

8、心： 1500rpm ， 10min ，棄上清液。固定：在離心管中加入固定液6-8ml ，立即用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，在室溫中固定15min 后， 離心，1500rpm，10min,棄上清液。再固定：同第8步。視管底細(xì)胞量適當(dāng)加入幾滴新鮮固定劑。滴片：每片1-2 滴， 75烤箱烤片3 小時(shí)，第二天行顯帶處理。胸腹水惡性細(xì)胞染色體的制作在無(wú)菌的條件下，取新鮮的胸腹水10ml,離心，1000rpm, 10min,棄上清液。在離心管中加入10m137 c溫育的1640完全培養(yǎng)液和 秋水仙素（終濃度為 0.05聞/ml培養(yǎng)液），置37 c水浴 60-90min 。離心，1500rpm， 10min， 去上清， 加入 0.075M KCl 4-6ml ，吸管吹打，37水浴3-5min 。預(yù)固定：在每個(gè)離心管中加入1.5ml 的固定液，繼續(xù)37oC水浴不5 min。離心1500rpm,離心10min,棄上清液。固定：在離心管中加入固定液6-8ml ，立即用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液，在室溫中固定15min 后， 離心，1500rpm，10min,棄上清液。注意事項(xiàng)取腫瘤組織時(shí)要盡可能取腫瘤細(xì)胞分布較多的部分，避開(kāi)壞死液化部分，但有些復(fù)發(fā)性、浸潤(rùn)性較強(qiáng)的腫瘤較難取到較為純凈的瘤體組