高效液相色譜法測定甘草苷和甘草酸含量的研究

1、高效液相色譜法測定甘草苷和甘草酸含量的研究【摘要】目的建立甘草苷和甘草酸的HPL含量測定方法。方法使用KrasiL-184.6200，5柱，甘草苷采用乙腈-0.5%醋酸(20:80)為流動相，檢測波長276n，柱溫為室溫；甘草酸流動相為甲醇-0.2lL-1乙酸銨溶液-冰乙酸(67321)，檢測波長252n，柱溫為室溫。二者流速均為1.0lin-1，采用外標法定量測定。結(jié)果甘草苷在2.727gl-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系r=0.9997；甘草酸在636gl-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系r=0.9998；甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為101.4%和101.3%，其RSD值分別為1.18%和1.22%。結(jié)

2、論該方法操作簡便、準確，線性相關(guān)系數(shù)良好，且穩(wěn)定性和重復(fù)性好，適用于甘草黃酮粗提物及純化物中甘草苷和甘草酸的含量測定。【關(guān)鍵詞】高效液相色譜；甘草苷；甘草酸Abstrat：bjetiveTestablishethdfrdeterinatinfliquiritinandglyyrrhiziaidbyHPL.ethdsKrasil-18lun(4.6200,5)asused,HPLanalysisfrliquiritinasperfredithrteperatureandthebilephasensistedfaetnitrile-0.5%glaialaetiaid(2080),thedeteti

3、navelengthasat276n;HPLanalysisglyyrrhiziaidasperfredithrteperatureandthebilephasensistedfethanl-0.2lL-1aniuaetate-glaialaetiaid(67321),thedetetinavelengthasat252n.Theflrateas1.0lin-1.ResultsThelinearrangefliquiritinasbtainedbeteen2.727gl-1(r=0.9997);thelinearrangefglyyrrhiziaidasbtainedbeteen636gl-1

4、(r=0.9998);theaveragereveryfliquiritinandglyyrrhiziaidere101.4%and101.3%respetivelyithrrespndingRSDf1.18%and1.22%.nlusinThisethdissiple,nvenientstable,repeatableandaurateithgdlinearrelatinship.Itissuitablefrthedeterinatinfliquiritinandglyyrrhiziaidinextratinandpurifiatinflirieflavnid.Keyrds：HPL；Liqu

5、iritin；Glyyrrhiziaid甘草是新疆蘊藏量大、藥用價值高的一種荒漠草原藥用植物，其主要有效成分為甘草酸和黃酮類化合物。甘草黃酮具有明顯的抗腫瘤、抗?jié)?、抗菌、抗變態(tài)反響、降血脂和鎮(zhèn)痛的作用，并對愛滋病病毒有很強的抑制增殖作用1，2，是甘草有效成分開發(fā)的熱點。經(jīng)典的黃酮含量測定方法，是以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法測定35，但此方法用于甘草黃酮的測定尚有諸多缺乏之處。甘草黃酮的主要成分甘草苷，是反映甘草黃酮內(nèi)在質(zhì)量的一個重要指標6。本研究以甘草苷為對照品，采用HPL法測定甘草黃酮含量的方法，同時研究優(yōu)化以HPL測定甘草酸含量的方法，以期為甘草有效成分的綜合開發(fā)利用和質(zhì)量監(jiān)控提供

6、新的方法和思路。1儀器與材料1.1儀器L-10A高效液相色譜儀(日本島津)；SPD-10A可變紫外檢測器(日本島津)；萬分之一天平Sartrius；KQ-250B型超聲波清洗器(上海之信儀器)。1.2材料甘草(石河子天德中藥廠)。甘草苷對照品、甘草酸單銨鹽對照品(均購自中國藥品生物制品檢定所)；95%乙醇(A.R)、冰醋酸(A.R)、乙酸胺(A.R)、甲醇色譜純、乙腈色譜純。2方法與結(jié)果2.1色譜分析條件2.1.1甘草苷檢測條件色譜柱為KrasiL-184.6200，5；流動相為乙腈-0.5%醋酸(2080)；紫外檢測波長：276n；流速1.0lin-1；柱溫為室溫；進樣量20l。理論塔板數(shù)按

7、甘草酸銨峰計算應(yīng)不低于4000。對照品和甘草黃酮粗提物的色譜圖見圖12。2.1.2甘草酸檢測條件色譜柱為KrasiL-184.6200，5；流動相為甲醇-0.2lL-1乙酸銨溶液-冰醋酸(67321)；紫外檢測波長252n；流速1.0lin-1；柱溫為室溫；進樣量20l。理論塔板數(shù)按甘草酸銨峰計算應(yīng)不低于2000。對照品和甘草黃酮粗提物別離的色譜圖見圖34。2.2對照品及供試品溶液的配制2.2.1對照品溶液的配制取甘草苷和甘草酸單銨鹽對照品適量，精細稱定，用流動相配制成濃度為54gl-1的甘草苷對照品溶液和120gl-1的甘草酸單銨鹽對照品溶液。2.2.2供試品溶液的制備精細稱取甘草黃酮提取物

8、適量，用相應(yīng)的流動相溶解，定溶于10l量瓶中,作為甘草苷供試品溶液。精細稱取甘草黃酮提取物適量，用相應(yīng)的流動相溶解，定溶于10l量瓶中，作為甘草酸供試品溶液。2.3檢測波長的選擇以流動相為參比溶液，在200400n波長范圍內(nèi)分別對甘草苷和甘草酸對照品溶液進展掃描，結(jié)果說明，甘草苷在276n處有一最大吸收峰，甘草酸在252n處有一最大吸收峰，所以選定276n為甘草苷的檢測波長，252n為甘草酸的檢測波長。2.4線性關(guān)系的考察精細汲取甘草苷對照品儲藏液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00l于10l量瓶中，用20%乙腈定容至刻度，搖勻；再精細汲取甘草酸單銨鹽對照品儲藏液0.50

9、，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00l于10l量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻；分別按“2.1項色譜條件進展測定，以峰面積AVs對進樣濃度gl-1作回歸統(tǒng)計，結(jié)果：甘草苷在2.727gl-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程：A=24962+7161.1，r=0.9997。甘草酸在636gl-1范圍內(nèi)線性良好，回歸方程為：A=23653+23125，r=0.9998。2.5精細度實驗取同一供試品溶液，重復(fù)進樣6次，求得甘草苷的RSD為0.74%，甘草酸的RSD為0.92%，說明本方法精細度良好。2.6重復(fù)性實驗按“2.2.2項制備同一批號供試品溶液6份，按擬定的色譜條件分別測定甘草苷和甘草

10、酸的含量，測得甘草苷的RSD為1.32%，甘草酸的RSD為1.04%，說明重復(fù)性較好。2.7穩(wěn)定性實驗配制同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12，24，36，48h后進樣，求得甘草苷的RSD為1.44%，甘草酸的RSD為0.89%，說明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。2.8回收率實驗取含量的同一供試品溶液各5份，分別精細參加同一濃度同一體積的甘草苷對照品溶液，甘草酸單銨鹽對照品溶液，混勻，進樣，按上述方法測定甘草酸和甘草苷的含量，測得甘草苷和甘草酸的平均回收率分別為101.4%，101.3%；RSD值分別為1.18%，1.22%。說明本實驗所確定的HPL法進展甘草苷和甘草酸的含量分析，準

11、確度較高。結(jié)果見表1。表1甘草酸和甘草苷的回收率實驗結(jié)果2.9樣品測定分別精細稱定甘草黃酮粗提物和純化物各3份，適量，按“2.2.2項方法制備所需的供試品溶液，按“2.1項的色譜條件分別測定甘草苷和甘草酸的峰面積，計算甘草黃酮粗提物烘干樣中甘草苷和甘草酸的純度分別為3.68%和18.38%，甘草黃酮純化物烘干樣中甘草苷的純度為17.29%，未檢測到甘草酸。結(jié)果見表2。甘草黃酮純化物別離的色譜圖見圖5。表2樣品測定結(jié)果測定項甘草黃酮粗提物123平均值RSD甘草黃酮純化物123平均值RSD甘草酸純度18.2518.5118.3918.380.71-甘草苷純度3.623.733.693.681.51

12、17.1617.3117.4017.290.70“-為未檢測到3討論3.1甘草苷流動相的選擇考察了選用不同比例的乙腈-0.5%醋酸為流動相時對甘草苷的保存時間及別離度的影響。實驗結(jié)果說明，以乙腈-0.5%醋酸1090為流動相時，保存時間短，但峰形較差，乙腈比例增大后峰形變得較鋒利對稱，響應(yīng)值顯著增大，別離度逐漸改善，保存時間先增大后縮短，當乙腈比例大于20%后，未檢測到甘草苷，綜合考慮，選用乙腈-0.5%醋酸2080為流動相，甘草苷的保存時間適中，別離效果好。3.2甘草酸流動相的選擇本實驗分別選用不同比例的甲醇-2%乙酸，甲醇-0.2lL-1乙酸銨溶液-冰醋酸(67321)為流動相，實驗結(jié)果說

13、明，甲醇-2%乙酸7327和甲醇-0.2lL-1乙酸銨溶液-冰乙酸(67321)為流動相時，別離效果均較好，但在流動相的穩(wěn)定性和分析時間的合理性方面，后者更優(yōu)越，因此選用甲醇-0.2lL-1乙酸銨溶液-冰醋酸(67321)為流動相。按本法分別對甘草苷和甘草酸進展高效液相色譜分析，具有回收率和線性相關(guān)系數(shù)良好，操作簡便，快速，樣品用量少，精細度和重復(fù)性好，自動化程度高等優(yōu)點，適用于甘草黃酮粗提物及純化物中甘草苷和甘草酸的質(zhì)量控制，具有廣泛的應(yīng)用前景。【參考文獻】1邢國秀，李楠，王童，等.甘草中黃酮類化學(xué)成分的研究進展J.中國中藥雜志，2022，28(7)：593.2從景香，高麗娟，林炳昌，等.甘草黃酮類化合物研究進展J.精細化工