巨細胞病毒感染的細胞微絲骨架重組異常

1、巨細胞病毒熏染的細胞微絲骨架重組非常【摘要】本研究探究巨細胞病毒V熏染對人胚成纖維細胞HF微絲骨架影響及與病毒復制狀態(tài)的大概干系。用顯微鏡不雅察細胞形態(tài)，接納RT-PR檢測-atin表達，estern-blt檢測胞內(nèi)肌動卵白質(zhì)含量，間接免疫熒光標識表記標幟病毒馬上早期抗原IE與微絲骨架探針不雅察HF細胞內(nèi)熏染狀態(tài)及微絲骨架變革。效果表白：V熏染率大于95，IE抗原重要位于胞核。受染細胞變粗、變圓，乃至脫壁，呈時間依靠性。熏染后72、96小時，受染細胞內(nèi)-atin表達呈漸進性下調(diào)，差異明顯P0.05；96小時后胞內(nèi)-atin含量那么為未熏染組的74.213.4，差異明顯P0.05。受染細胞內(nèi)微絲

2、擺列紊亂，極性消散；細胞交融，熒光強度顯著削弱。結(jié)論：V引起細胞內(nèi)肌動卵白質(zhì)、微絲骨架形態(tài)及重組非常大概有助于其侵襲宿主細胞并進一步活化及復制?！娟P(guān)鍵詞】巨細胞病毒；人胚成纖維細胞；肌動卵白；微絲IpairedirfilaentytskeletalRearrangeentinyte-galvirusInfetedellsKeyrdsytegalvirus;huanebryfibrblastell;-atin;irfilaent人巨細胞病毒huanytegalvirus，V屬于皰疹病毒家屬成員之一，是時機性致病原體。隨著異基因造血干細胞移植臨床應(yīng)用日漸普及，V激活熏染引發(fā)的嚴峻的、致命的并發(fā)癥已

3、成為造血干細胞移植失敗的重要緣故原由之一。人胚成纖維細胞HF是V的容受性細胞，病毒可在該細胞內(nèi)活化復制。本研究組已創(chuàng)造V可熏染多種范例的細胞，而且引起細胞內(nèi)-atinRNA表達的下調(diào)1-3。本研究旨在探究V對受染細胞型肌動卵白程度、微絲骨架成效的影響及效應(yīng)的時效性，從而進一步熟悉V活化機理。質(zhì)料和要領(lǐng)質(zhì)料與試劑VAD169病毒株及人胚成纖維細胞系HF細胞由安徽醫(yī)科大學王明媚傳授惠贈，實行前經(jīng)檢測，無別的微生物污染。微絲骨架探針Rhdaine-Phal-lidinleularPrbes產(chǎn)物，鼠抗人V馬上早期抗原IE單克隆抗體NvastraLabratries產(chǎn)物，山羊抗小鼠FIT標識表記標幟二抗

4、SuthernBiteh產(chǎn)物，山羊抗人-atin抗體Santaruz產(chǎn)物，TRIZL試劑盒Gib公司產(chǎn)物，-LV逆轉(zhuǎn)錄酶上海生工公司產(chǎn)物DE造就基及胎牛血清均為Gib公司產(chǎn)物。V病毒株造就HF細胞在含5胎牛血清的DE造就液、52、飽和濕度、37造就箱FraSientifi中造就。AD169病毒在細胞內(nèi)屢次增殖傳代以增長病毒毒力，病毒懸液-80保存?zhèn)溆?。按病毒致細胞病變作用PE盡頭稀釋法在96孔造就板滴定半數(shù)構(gòu)造造就熏染量TID50。將10TID50的滴度V加于造就的單層HF細胞，37孵育2小時，用PBS洗滌3次，以奇怪造就液繼承別離造就24、48、72和96小時后作相干檢測。胞內(nèi)型肌動卵白-a

5、tin、甘油醛3-磷酸脫氫酶基因GAPDHRNA表達的RT-PR檢測細胞內(nèi)型肌動卵白程度esternblt檢測病毒馬上早期抗原IE及微絲骨架熒光探針雙標識表記標幟實行激光共聚焦顯微鏡Zeiss510成像及數(shù)據(jù)闡發(fā)以488n引發(fā)光檢測FIT標識表記標幟綠色熒光，545n引發(fā)光檢測羅丹明標識表記標幟赤色熒光，同一指標接納完全同等成像體系參數(shù)設(shè)置，以包管正確的陽性信號熒光強度。統(tǒng)計學闡發(fā)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件舉行闡發(fā)處置懲罰。數(shù)值以均數(shù)尺度差XSD表現(xiàn)，兩樣本的均數(shù)比力接納t查驗。效果V高效熏染HF細胞10TID50滴度的V熏染HF細胞，經(jīng)間接免疫熒光試驗證明，95以上細胞表達病毒IE抗原，重

6、要位于胞核中，胞漿中亦有少量漫衍圖1。V致HF細胞形態(tài)學變革正常生長的HF細胞呈長梭形。V作用24小時后，該細胞由梭形變粗、變圓，乃至脫壁，而且隨著時間的延伸，V滴度的增長，細胞形態(tài)變革越顯著圖2。受染細胞內(nèi)-atin基因及卵白質(zhì)水均勻低落V對細胞微絲骨架影響正常生長狀態(tài)下，HF細胞內(nèi)F-atin經(jīng)熒光標識表記標幟探針表現(xiàn)呈束狀擺列，維持正常極性，部門細胞胞膜側(cè)相對深染圖4。受染48小時后，細胞皺縮，巨細不一，形態(tài)由細長梭形變化為圓形或橢圓形，部門細胞極不規(guī)矩。胞內(nèi)微絲擺列紊亂，極性消散，且胞內(nèi)熒光探針強度削弱，與病毒IE抗原表達品貌呈負相干，表現(xiàn)為較高強度綠熒光的細胞內(nèi)赤色熒光強度較弱。96

7、小時后，細胞交融，表現(xiàn)為多個胞核的重疊積累，難以區(qū)分細胞形態(tài)，F(xiàn)-atin含量顯著淘汰，完備的微絲樣布局少見圖2。雙通道掃描表現(xiàn)，位于胞漿內(nèi)及胞膜側(cè)的VIE抗原標識表記標幟綠色熒光與F-atin探針赤色熒光產(chǎn)生交融，顯現(xiàn)為橙黃色圖2。討論細胞骨架包羅微管、微絲和中心纖維，由它們配合構(gòu)成細胞的支架，成為細胞活動、細胞形態(tài)和跨膜信息通報的布局基矗微絲，亦稱為纖維形肌動卵白(F-atin)，是由球形肌動卵白(G-atin)單體分子形成的多聚體。兩者之間的動態(tài)平衡在必然程度上維持肌動卵白成效。-atin基因編碼型肌動卵白，系微絲的構(gòu)成基矗Jnes等4應(yīng)用電鏡不雅察創(chuàng)造，V熏染人HF細胞的同時，伴有細胞

8、骨架粉碎和肌動卵白解聚。Arangeletti等5也創(chuàng)造，V在HF細胞中復制時，細胞微管微絲剖析，細胞骨架受損。上述研究效果提示，肌動卵白或微絲骨架大概是V熏染的重要靶向細胞骨架身分。在本實行中創(chuàng)造，熏染V的HF細胞形態(tài)產(chǎn)生顯著的改變，如細胞變粗、變圓，乃至脫壁，微絲斷裂、淘汰，擺列紊亂等。同時在受染早期細胞內(nèi)-atin基因轉(zhuǎn)錄程度即RNA相對表達量淘汰，型肌動卵白含量在熏染晚期下調(diào)。因此推測，V粉碎細胞骨架途徑之一大概是通過滋擾-atin基因轉(zhuǎn)錄及翻譯歷程，從而淘汰肌動卵白合成或粉碎微絲形成。已有研究提出，G-atin是-atin基因轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控因素，可低落其不變性，而F-atin那么無此作

9、用6，7。本研究創(chuàng)造，V熏染的HF細胞中，-atin基因表達隨熏染時間延伸，出現(xiàn)漸進性下調(diào)，乃至低于檢測程度。病毒熏染HF細胞的早期影響-atinRNA程度表達，它大概通過介導肌動卵白微絲聚合非常導致胞漿內(nèi)G-atin卵白含量升高，反響性低落-atinRNA程度；而熏染后期，如96小時后，受染細胞內(nèi)不但F-atin熒光強度削弱，肌動卵白含量也有落落。此時細胞內(nèi)的-atinRNA程度明顯低落，這說明此時肌動卵白基因程度落落大概是由于病毒直接作用所致，與G-atin間接調(diào)控作用干系并不嚴密。很多病毒的侵襲、復制等歷程均與宿主肌動卵白骨架體系有關(guān)，人類副流感病毒3附著在胞質(zhì)肌動卵白纖維上舉行轉(zhuǎn)錄和復制8。文獻報道，VIE抗原調(diào)控受染細胞的生長與增殖9。病毒IE抗原表達量與細胞內(nèi)F-atin熒光強度呈負相干，這間接說明病毒復制對肌動卵白合成大概微絲成效有影響，只管本實行沒有直接證據(jù)明白IE抗原在此歷程中的作用，但是雙通道熒光掃描效果表現(xiàn)，位于胞漿中的IE抗原與F-atin產(chǎn)生部門交融，提示病毒有大概到場微絲聚合與解聚動態(tài)平衡歷程。固然，微絲骨架對付病毒的復制