島津LC-20AT型高效液相色譜儀的圖文操作手冊(cè)

1、島津LC-20AT型高效液相色譜儀的圖文操作手冊(cè)、島津LC-20AT型高效液相色譜儀:貯液瓶SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器DGU-20A3真空脫氣機(jī)RF-10AXLCTO-20A熒光檢測(cè)器柱溫箱SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器島津LC-20AT型高效液相色譜儀Varian380-LC蒸發(fā)光檢測(cè)器LC-20AT溶液傳輸單元CBM-20A系統(tǒng)控制器功能：本儀器采用高壓梯度通過(guò)高壓輸液泵分別獨(dú)立精確控制流量、調(diào)整溶劑濃度比例，實(shí)現(xiàn)高效率、高精度混合；即配.息的二極管陣列檢測(cè)器，全新的光路設(shè)計(jì)與有效的梯形狹縫池設(shè)計(jì)保證了高分辨率和高靈敏度；也配備了靈敏度更、選擇性更好的熒光檢測(cè)器；還配備了具有高靈

2、敏度、檢測(cè)范圍更廣的蒸發(fā)光檢測(cè)器。用途：本儀器可以高效地分離分析高沸、熱不穩(wěn)定的有機(jī)及生化試樣；二極管陣列檢測(cè)器對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)；熒光檢測(cè)器可以檢測(cè)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，對(duì)如多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)碳?xì)浠衔?、表面活性劑、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油和揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品、不含發(fā)色團(tuán)的化合物有響應(yīng)。了可提供全波長(zhǎng)三維信三、操作步驟：1、色譜柱的安裝本儀器配備了SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、RF-10AXL熒光檢測(cè)器和Varian380-LC蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。樣品分析前首先要確定用什么檢測(cè)器，然后把色譜柱連接

3、到所需的檢測(cè)器上。2、開(kāi)機(jī)a、首先打開(kāi)UPS，然后依次打開(kāi)DGU-20A3真空脫氣機(jī)、LC-20AT溶液傳輸單元（泵）、CBM-20A系統(tǒng)控制器、所選用的檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20A，CTO-20A柱溫箱電源打開(kāi)。（HPLC組件的電源開(kāi)關(guān)大都在儀器的右下角）b、將兩個(gè)泵上部中間的黑色旋鈕逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)90180度，按purge鍵進(jìn)行自動(dòng)脫氣，一般設(shè)置為3分鐘；然后按自動(dòng)進(jìn)樣器軟鍵盤(pán)的purge鍵，對(duì)自動(dòng)進(jìn)樣器上的樣品進(jìn)行脫氣，一般為25分鐘。c、雙擊Lcsolution圖標(biāo)。輸入用戶(hù)名Admin，點(diǎn)擊OK。單擊系統(tǒng)配置的圖標(biāo)，出現(xiàn)系統(tǒng)配置的對(duì)話(huà)框。單擊自動(dòng)配置，儀器自動(dòng)將能找到的儀器配置，也可

4、以用圖示中的藍(lán)色和紅色箭頭分別添加和去掉配置的儀器。需要注意的是，儀器優(yōu)先選擇自動(dòng)進(jìn)樣器，如果需要手動(dòng)進(jìn)樣，需將自動(dòng)進(jìn)樣器去掉。單擊儀器（通訊設(shè)置），選擇正確的儀器類(lèi)型，然后單擊自動(dòng)獲取IP地址。單擊系統(tǒng)控制器，出現(xiàn)系統(tǒng)控制器的對(duì)話(huà)框，繼電器的四個(gè)選項(xiàng)需要設(shè)置為start。d、單擊儀器開(kāi)關(guān)按鈕，將軟件與儀器連接e、儀器參數(shù)視圖里面，簡(jiǎn)單設(shè)置里面，模式選擇二元高壓梯度，設(shè)置總流速，泵B濃度，時(shí)間，柱溫箱溫度，時(shí)間程序。然后選擇下載，跑基線(xiàn)。單擊繪圖，可以看查看基線(xiàn)。3、方法編輯a、下圖中看到儀器參數(shù)視圖，選擇高級(jí)，然后依次改變其中的參數(shù)。如果儀器為PDA檢測(cè)器時(shí)，則按以下進(jìn)行設(shè)置。數(shù)據(jù)采集：LC

5、停止時(shí)間為。采集時(shí)間打勾，結(jié)束時(shí)間為分析樣品的時(shí)間。LC時(shí)間程序：如果等度洗脫，則設(shè)置如圖中controllerstop。進(jìn)行梯度洗脫時(shí)需要如圖所示進(jìn)行設(shè)置。單擊繪制曲線(xiàn)，可查看梯度曲線(xiàn)。泵：模式選擇二元高壓梯度，設(shè)置泵B的濃度。最大壓力根據(jù)色譜柱的最大壓力進(jìn)行設(shè)置。PDA：般同時(shí)選擇D2和W等，然后輸入開(kāi)始和結(jié)束時(shí)的波長(zhǎng)。柱溫箱：設(shè)置柱溫箱的溫度?？刂破鳎簩⑺膫€(gè)時(shí)間全部打勾。自動(dòng)進(jìn)樣器：不需要重新設(shè)置。自動(dòng)排氣：不需要重新設(shè)置。方法設(shè)置完后，選擇文件，另存為方法文件。當(dāng)儀器穩(wěn)定，基線(xiàn)穩(wěn)定后，可以下載方法，進(jìn)行樣品的分析。b、如果選擇熒光檢測(cè)器，首先需要色譜柱接熒光檢測(cè)器，打開(kāi)熒光檢測(cè)器的電源

6、，系統(tǒng)配置自動(dòng)配置熒光檢測(cè)器。儀器參數(shù)設(shè)置部分檢測(cè)器需要輸入激發(fā)光和發(fā)射光的波長(zhǎng)。其他同PDA檢測(cè)器。c、4、如果選擇蒸發(fā)光檢測(cè)器，將色譜柱連接蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。打開(kāi)Varian-380電源開(kāi)關(guān)，打開(kāi)VarianELSDControl軟件方法編輯器單擊Method，出來(lái)一對(duì)話(huà)框，Usemyowninstrumentsett，則可以改變參數(shù)，設(shè)置新的方法。也可以不打勾，直接選擇已經(jīng)設(shè)置好的方法。儀器開(kāi)啟時(shí)即處于STANDBY模式，加熱塊關(guān)閉，霧化氣流速設(shè)定為較低的。Standby模式下用戶(hù)可設(shè)定儀器參數(shù)（霧化氣流速，霧化溫度，蒸發(fā)溫度），然后將模式切換至RUN。Run模式是正常工作模式，儀器處于

7、完全設(shè)定控制狀態(tài)。在加熱或降冷卻程中，儀器會(huì)顯示“NOTREADY”，表明儀器未達(dá)設(shè)定條件。當(dāng)儀器平衡完畢，會(huì)顯示“READY”。方法使用打開(kāi)機(jī)器后，選擇合適的方法。將工作模式設(shè)定為RUN，使儀器加熱平衡。打開(kāi)LCsolution軟件，自動(dòng)配置選擇AD2，即選擇了蒸發(fā)光檢測(cè)器。其它設(shè)置同PDA檢測(cè)器。儀器平衡后檢察基線(xiàn)。在洗脫液未接入時(shí)噪音應(yīng)低于，這表明霧化氣潔凈干燥。基線(xiàn)毛刺一般是由霧化氣中的粒子或水分造成的。引入洗脫液并待其平衡15min。再次檢查基線(xiàn)，應(yīng)不超過(guò)lmv，如是為純水應(yīng)不超過(guò)，純有機(jī)溶劑也應(yīng)不超過(guò)lmv。緩沖體系和穩(wěn)定劑可顯著增加噪音。然后進(jìn)行樣品分析。4、運(yùn)行a、單次運(yùn)行單擊

8、單次運(yùn)行，出現(xiàn)對(duì)話(huà)框，選擇已經(jīng)編輯的方法，輸入文件名，輸入樣品瓶，樣品架和樣品的體積，單擊確定可以進(jìn)行樣品的分析。點(diǎn)擊輔助欄停止或者停止的快捷鍵，可以將分析停止。b、批處理運(yùn)行單擊批處理，打開(kāi)二級(jí)菜單，單擊向?qū)?，可以新建，也可以附加一個(gè)批處理文件。選擇方法文件，輸入開(kāi)始樣品瓶，樣品架，進(jìn)樣體積。下一步。輸入樣品組數(shù)，選擇標(biāo)準(zhǔn)品和未知。下一步。輸入標(biāo)準(zhǔn)品名字，ID,校準(zhǔn)級(jí)別，數(shù)據(jù)文件名。下一步。輸入未知品名字，ID，數(shù)據(jù)文件名。下一步。下一步，完成。出現(xiàn)批處理文件。另存批處理文件。單擊批處理開(kāi)始，開(kāi)始分析樣品。5、關(guān)機(jī)樣品分析完畢，按照色譜柱的沖洗要求進(jìn)行沖洗。沖洗完后，儀器參數(shù)視圖，將總流速設(shè)

9、為0，下載。然后單擊儀器開(kāi)關(guān)，關(guān)閉軟件，最后將電源關(guān)掉，關(guān)閉UPS。6、積分單擊再解析，打開(kāi)已經(jīng)完成的數(shù)據(jù)，會(huì)看到數(shù)據(jù)、方法、報(bào)告格式、批處理、全部文件形式。點(diǎn)擊分析圖標(biāo)，選擇多色譜，提取所要波長(zhǎng)下的峰。在積分頁(yè)面，選擇通道，半峰寬，斜率，最小峰面積，一般選擇面積選項(xiàng)。識(shí)別頁(yè)面，利用時(shí)間窗或時(shí)間帶限制峰。也可以選擇積分頁(yè)面的程序，進(jìn)行手動(dòng)積分。如果不了解方法，可以單擊幫助。點(diǎn)擊確定，分析完成。結(jié)果在視圖，峰表內(nèi)查看。7、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)a、外標(biāo)法定量單擊向?qū)?，打開(kāi)化合物表向?qū)Т翱?，選擇通道，半峰寬，斜率，最小峰面積，一般選擇面積選項(xiàng)，下一步。選擇要標(biāo)定的峰，下一步。選擇外標(biāo)法。計(jì)算面積。輸入校準(zhǔn)級(jí)別，

10、曲線(xiàn)擬合類(lèi)型，一般選擇線(xiàn)性。零點(diǎn)，一個(gè)校準(zhǔn)級(jí)別，選擇強(qiáng)制通過(guò)，其它選擇未強(qiáng)制。加權(quán)方法無(wú)。輸入濃度，下一步。識(shí)別，選擇時(shí)間窗或者時(shí)間帶。一般來(lái)說(shuō)保留時(shí)間小的用時(shí)間窗。下一步。定義峰的名字和標(biāo)樣的濃度。完成。保存方法。單擊校準(zhǔn)，雙擊已經(jīng)建立的方法。然后將標(biāo)樣圖譜拖動(dòng)到左下角數(shù)據(jù)文件的級(jí)別中，有幾個(gè)級(jí)別，則相應(yīng)的拖到相應(yīng)的級(jí)別中。則自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。另存為方法。b、內(nèi)標(biāo)法定量定量方法為內(nèi)標(biāo)法，確定內(nèi)表物的峰。8、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的濃度打開(kāi)需要計(jì)算的譜圖，文件選擇需要加載的方法參數(shù)，查看峰表可以看結(jié)果。9、報(bào)告編輯單擊報(bào)告模板，拖動(dòng)到報(bào)告模板中即可，然后另存為報(bào)告格式文件顯示報(bào)告，將數(shù)據(jù)拖動(dòng)到報(bào)

11、告模板中即顯示報(bào)告。四、注意事項(xiàng)：1、高壓恒流泵的維護(hù)：泵的密封圈是最易磨損的部件，密封圈的損壞可引起系統(tǒng)的許多故障，要注意保養(yǎng)和定期更換。應(yīng)采取下列措施以延長(zhǎng)使用壽命：絕對(duì)不允許在沒(méi)有流動(dòng)相的或流動(dòng)相還沒(méi)有進(jìn)入泵頭的情況下啟動(dòng)泵而造成柱塞桿的干磨。每天使用后應(yīng)將整個(gè)系統(tǒng)管路中的緩沖液體沖洗干凈，防止鹽沉積，整個(gè)管路要浸在無(wú)緩沖的溶液或有機(jī)溶劑中。長(zhǎng)期不用也要定期開(kāi)泵沖洗整個(gè)管路。要用HPLC級(jí)試劑。輸液管前端要用燒結(jié)不銹鋼沉子過(guò)濾流動(dòng)相。要注意防止管路阻塞造成壓力過(guò)高而損壞儀器。壓力下限應(yīng)設(shè)置在lMPa，以防止儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被抽干或嚴(yán)重滲漏而引起柱塞的干磨。2、流動(dòng)相的使用：必須使用HPL

12、C級(jí)或相當(dāng)于該級(jí)別的流動(dòng)相，并先經(jīng)Um薄膜過(guò)濾。過(guò)濾后的流動(dòng)相必須經(jīng)過(guò)充分脫氣，以除去其中溶解的氣體02等，如不脫氣易產(chǎn)生氣泡、基線(xiàn)噪聲增加、靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。如果管路中使用peek樹(shù)脂部件，不可使用濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亞砜等試劑。特別注意HPLC使用過(guò)后的系統(tǒng)清洗：含有緩沖溶液流動(dòng)相的清洗方法：a、先用100%的純水沖洗，打開(kāi)排放閥，用35ml/min的流量，洗20min左右后停泵，主要是針對(duì)吸液系統(tǒng)、泵頭、進(jìn)出口單向閥等體積較大的空間的清洗。b、再用95/5的甲醇/水清洗整個(gè)系統(tǒng)，關(guān)閉排放閥，用1ml/min的流量，洗3060min后停泵，

13、主要是用水清洗整個(gè)系統(tǒng)中的鹽，用5%的甲醇主要是為了保護(hù)色譜柱。c、最后用100%的甲醇清洗整個(gè)系統(tǒng)，用1ml/min的流量，洗2min左右，然后關(guān)機(jī)。如果流動(dòng)相中不含鹽，則只使用上述第三步清洗即可。3、更換流動(dòng)相：在分析過(guò)程中，有時(shí)需要更換流動(dòng)相進(jìn)行分析。一定要注意前一種使用的流動(dòng)相和所更換的流動(dòng)相是不是能夠相溶。如果前一種使用的流動(dòng)相和所更換的流動(dòng)相不能夠相溶，要采用一種與這二種需更換的流動(dòng)相都能相溶的流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾、清洗。較為常用的過(guò)濾流動(dòng)相為異丙醇，但實(shí)際操作中要看具體情況而定，原則就是采用與這二種需更換的流動(dòng)相都能相溶的流動(dòng)相。一般清洗時(shí)間為3040分鐘，直至系統(tǒng)完全穩(wěn)定。更換流動(dòng)相

14、時(shí)，要用100ml的燒杯，放入需要更換的流動(dòng)相，將慮頭放入燒杯中，上下反復(fù)沖洗，然后將排液閥逆時(shí)針180度，purge。然后將排液閥順時(shí)針180度。儲(chǔ)液器的注意事項(xiàng)：保持流動(dòng)相儲(chǔ)液器的清潔是保證儀器正常使用的關(guān)鍵。要使用HPLC級(jí)的溶劑，對(duì)試劑含有緩沖鹽及非HPLC級(jí)的流動(dòng)相一定要用Mm過(guò)濾器除區(qū)去其中的微量物質(zhì)。4、色譜柱的使用：a、使用前色譜柱的儲(chǔ)存液無(wú)特殊說(shuō)明，均為評(píng)價(jià)報(bào)告所示的流動(dòng)相。在使用前，一定要注意色譜柱的儲(chǔ)存液與要分析樣品的流動(dòng)相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應(yīng)先用10左右的低濃度的有機(jī)相洗脫劑過(guò)渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機(jī)相中很容易析出，堵

15、塞色譜柱。b、樣品樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過(guò)濾器或樣品預(yù)處理柱（SPE）對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理；若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。在用正相色譜法分析樣品時(shí)，所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫水。c、色譜柱的保存如色譜柱要長(zhǎng)時(shí)間保存，必須存于合適的溶劑下。對(duì)于反相柱可以?xún)?chǔ)存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以?xún)?chǔ)存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以?xún)?chǔ)存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購(gòu)買(mǎi)新色譜柱時(shí)附送的堵頭堵上。儲(chǔ)存的溫度最好是室溫。d、色譜柱的再生因?yàn)樯V柱是消耗品，隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，會(huì)出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)可能是柱效下降。（1）、反相柱的再生：依次采用2030

16、倍的色譜柱體積的甲醇/水=10/90（V/V）、乙腈、異丙醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。5、色譜柱在使用過(guò)程中易出現(xiàn)的問(wèn)題和解決辦法色譜柱在使用中最常見(jiàn)的問(wèn)題就是柱壓升高，如果柱壓是在長(zhǎng)時(shí)間使用過(guò)程中緩慢增加，屬于正常現(xiàn)象。但柱壓在使用過(guò)程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點(diǎn)：a、色譜柱頭的過(guò)濾篩板堵塞或污染；b、色譜柱頭的填料被樣品污染；c、色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶析出；d、流動(dòng)相PH值過(guò)大或過(guò)小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。解決辦法如下：a、如確定是色譜柱頭的過(guò)濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或