通用型細(xì)菌16S rDNA 熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒說明書

1、Word文檔 通用型細(xì)菌16S rDNA 熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒說明書 通用型細(xì)菌16S rDNA 熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書 主要用途 通用型細(xì)菌16S rDNA 熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑是一種旨在運(yùn)用SYBR綠色熒光染料作為標(biāo)記信號(hào)，針對(duì)微生物樣本DNA進(jìn)行保守性序列PCR擴(kuò)增，實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量分析擴(kuò)增產(chǎn)物的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過細(xì)心研制、勝利試驗(yàn)證明的?？梢员挥糜诟鞣N樣品，包括血液、體液、組織、土壤等的細(xì)菌拷貝數(shù)的定量檢測(cè)。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，操作便捷，敏感高效，定量精確，重復(fù)性強(qiáng)。 技術(shù)背景 16SrRNA作為非培育依靠性標(biāo)記的分子指模（fing

2、erprinting）技術(shù)，有別于傳統(tǒng)的選擇性培育技術(shù)，用于討論微生物的分類學(xué)（phylogenetics）。核糖體RNA（ribosome RNA）存在于全部微生物體內(nèi)，且結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)化保留；簡(jiǎn)單分別和識(shí)別；其一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)具有高度進(jìn)化保守區(qū)域（conserved region）和物種特異性可變區(qū)域（variable region）；其基因序列變異特別緩慢，且不會(huì)發(fā)生平行基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer）。其包括5S、16S、23S。5S信息量不夠充分；23S不穩(wěn)定；而微生物16SrRNA基因較為穩(wěn)定，初級(jí)結(jié)構(gòu)含有1500個(gè)堿基。通過引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增產(chǎn)物。SYBR綠色

3、熒光染料，作為DNA結(jié)合染料，可以和擴(kuò)增子（amplican）上雙鏈DNA的任一小溝（minor groove）結(jié)合，而發(fā)出熒光信號(hào)。依據(jù)每一循環(huán)的熒光強(qiáng)度來確定擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量，并用循環(huán)閾值（threshold cycle；Ct）表示，計(jì)算獲得拷貝數(shù)。 產(chǎn)品內(nèi)容 反應(yīng)液（Reagent A） 300微升 染色液（Reagent B） 20微升 引物液（Reagent C） 40微升 補(bǔ)充液（Reagent D） 500微升 封隔液（Reagent E） 1.5毫升 產(chǎn)品說明書 1份 保存方式 保存在20冰箱里；染色液（Reagent B）避開光照；有效保證6月 用戶自備 15毫升錐形離心管：用

4、于樣品預(yù)處理的容器 1.5毫升離心管：用于預(yù)處理的容器 （微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理 PCR管：用于樣品擴(kuò)增操作的容器 熒光定量PCR儀：用于熒光定量PCR反應(yīng) 試驗(yàn)步驟 試驗(yàn)開頭前，從20冰箱中取出試劑，放進(jìn)冰槽里溶化。然后進(jìn)行下列操作： 1一次反應(yīng)總量為25微升 2移取15微升反應(yīng)液（Reagent A）到0.5毫升PCR管 3加入5微升待測(cè)的DNA模板（或 100納克） 4加入1微升染色液（Reagent B） 5加入2微升引物液（Reagent C） 6加入3微升補(bǔ)充液（Reagent D）至總?cè)萘繛?5微升 7放進(jìn)4微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒 8使用1000微升槍頭加入1滴封隔液

5、（Reagent E）（留意：參見留意事項(xiàng)10） 9即刻放進(jìn)熒光定量PCR儀 10熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?溫度（） 時(shí)間 循環(huán) 95 2分鐘 1 95 55 72 30秒 90秒 60秒 40 72 5分鐘 1 11進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 （1）采納比較閾值分析法（Ct），即相對(duì)定量，計(jì)算樣品拷貝數(shù)：建議使用用戶自備的對(duì)比樣品或大腸桿菌細(xì)菌株 （2）或采納標(biāo)準(zhǔn)曲線法，即肯定定量，計(jì)算樣品拷貝數(shù) （3）細(xì)菌量單位計(jì)算：拷貝數(shù)/毫升樣品（copies/ml）或拷貝數(shù)/微克樣品DNA（copies/g） A）依據(jù)上述方法獲得待測(cè)樣品拷貝數(shù)（Q） B）依據(jù)下列公式計(jì)算單位拷貝數(shù)，即拷貝數(shù)/毫升樣品（copies/ml）或拷貝數(shù)/微克樣品DNA（copies/g） C：?jiǎn)挝豢截悢?shù) Q：待測(cè)樣品拷貝數(shù) VDNA：DNA萃取后的總?cè)萘?VPCR：反應(yīng)體系中DNA模板容量（5微升） VEXT：原始樣品總?cè)萘?留意事項(xiàng) 1本產(chǎn)品為20次PCR