CTGF在低氧性肺血管重建中的作用

1、CTGF在低氧性肺血管重建中的作用【關(guān)鍵詞】肺血管重建Expressinfintegrin5inendetritiellsanditssteridalregulatinAbstrat:bjetiveTstudytheexpressinfintegrin5inulturedhuanendetritiellsanditsregulatinbysteridalhrnes.ethdsEighteensaplesfetpiendetriuereulturedinvitr.Theulturedendetritiellseredividedintfivegrups:ntrlgrup，E2grup，Pgrup

2、，TAgrupandRU486grup.Theexpressinfintegrin5RNAfeahgruperedeterinedbyreversetransriptplyerasehainreatinethd.ResultsTheexpressinfintegrin5RNAinE2andPgrupas1.4150.286and1.3040.170respetively，hiheresignifiantlyhigherthanthatfntrlgrup1.0820.069，P0.05.InTAandRU486grup，itas0.8820.013and0.8660.054re-spetivel

3、y，hihassignifiantlylerthanthatfntrlgrupP0.05.nlusinsEstradilandprgesterneayregulatetheexpressinfintegrin5.Estradilandprgesterneinreasetheintegrin5RNAinetpiendetriu，andprtetheadhesinleadingtendetrisis.Taxifenandifepristndeelerateurrenefendetrisisbyayfresistingestradilandprgesternerinhibitingetpiendet

4、rialellsfrseretingintegrin5.Keyrds:endetritiells;ellulture;integrin5;reversetransriptin-plyerasehainreatin;steridalhr-nes摘要目的:通過(guò)建立低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，討論結(jié)締組織生長(zhǎng)因子TGF在大鼠低氧性肺血管重建中的作用。方法:通過(guò)連續(xù)常壓低氧法建立大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓模型，用右心導(dǎo)管法測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓PAP;稱重計(jì)算右心室肥厚指數(shù)RV.LV+S;肺組織切片經(jīng)HE染色后圖像分析技術(shù)定量檢測(cè)大鼠肺小動(dòng)脈的形態(tài)改變;免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定肺小動(dòng)脈管壁TGF蛋白表達(dá)，并經(jīng)圖像分析

5、半定量檢測(cè)其表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果:3周后，低氧組大鼠的PAP、RV.LV+S、反映管壁增厚的管壁厚度占血管外徑的百分比和管壁面積占血管總面積的百分比兩指標(biāo)均高于正常對(duì)照組P0.01。正常對(duì)照組大鼠肺小動(dòng)脈壁TGF蛋白未表達(dá);低氧組大鼠肺小動(dòng)脈壁外膜TGF明顯表達(dá)，內(nèi)膜略有表達(dá)，中膜幾乎無(wú)表達(dá)。結(jié)論:常壓低氧3周可成功建立肺動(dòng)脈高壓大鼠模型，TGF與低氧性肺血管重建親密相關(guān)。關(guān)鍵詞低氧;肺血管重建;結(jié)締組織生長(zhǎng)因子長(zhǎng)期低氧會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓和肺源性心臟病，低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成及開(kāi)展主要與低氧性肺血管收縮及肺血管重建有關(guān)。已經(jīng)明確，長(zhǎng)期低氧可使肺循環(huán)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、外膜成纖維細(xì)胞增殖肥大，同時(shí)

6、這些細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的細(xì)胞外基質(zhì)增多、異常沉積，導(dǎo)致低氧性肺血管重建，使肺動(dòng)脈壓力持續(xù)增高，形成慢性肺心病1。多種生長(zhǎng)因子對(duì)低氧性肺血管重建的形成及維持起著非常重要的作用。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子nnetivetissuegrthfatr，TGF隸屬N家族，能刺激血管平滑肌細(xì)胞、人肺成纖維細(xì)胞等增生，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生，且與眾多和低氧性肺血管重建相關(guān)的生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子.等關(guān)系親密，但TGF在低氧性肺血管重建中的作用目前尚不清楚。本研究通過(guò)建立大鼠肺動(dòng)脈高壓模型，觀察慢性缺氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺小動(dòng)脈構(gòu)造的變化及肺血管TGF表達(dá)程度，旨在討論TGF在缺氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病中的可

7、能作用。1對(duì)象與方法1.1動(dòng)物20只安康SD雄性大鼠，由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，平均體重254.03.9g，日齡70d左右;普通大鼠飼料動(dòng)物中心提供喂養(yǎng)，飲用自來(lái)水，自由攝食和飲水，分為低氧組和正常對(duì)照組。1.2主要儀器常壓低氧艙自制，主體由厚15的有機(jī)玻璃建成，容積約280L966545，配有測(cè)氧儀、電磁閥、減壓閥、電動(dòng)風(fēng)扇;aLab.4sADInstru-ents生物信號(hào)采集系統(tǒng)AustraliaADInstruents公司消費(fèi);SP.2000病理圖文報(bào)告系統(tǒng)2.0版上海世珈醫(yī)療設(shè)備消費(fèi)。1.3主要試劑胃蛋白酶消化液北京中山生物技術(shù)消費(fèi);濃縮型DAB試劑盒福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)消費(fèi);

8、TGFL.20Santaruz公司消費(fèi);Vltra-SensitiveS.P超敏試劑盒Kit.9706，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)消費(fèi)。1.4試驗(yàn)方法1.4.1建立肺動(dòng)脈高壓大鼠模型采用薛全福法2，將試驗(yàn)組10只大鼠置于10.00.5%氧濃度的常壓低氧艙內(nèi)，連續(xù)低氧，每次艙內(nèi)氧濃度從21%降至10%的時(shí)間約為30in，每天8h，每周6d，第7天不低氧，共3周;正常對(duì)照組10只大鼠置于同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，呼吸室內(nèi)空氣。1.4.2肺動(dòng)脈壓的測(cè)定所有試驗(yàn)用大鼠以2%戊巴比妥40gkg-1行腹腔內(nèi)注射麻醉后，將充盈肝素生理鹽水的硅膠導(dǎo)管插入右頸外靜脈，緩慢推入右心室，導(dǎo)管另一端連接靜脈壓力換能器到aLab.4sA

9、DInstruents生物信號(hào)采集系統(tǒng)，觀察至屏幕顯示典型的肺動(dòng)脈壓波形，用hartv3.5.2生物信號(hào)分析系統(tǒng)記錄并計(jì)算平均肺動(dòng)脈壓PAP。1.4.3右心室肥厚指標(biāo)檢測(cè)肺動(dòng)脈壓檢測(cè)完畢后放血處死大鼠，完好取出心臟和肺組織，心臟置10%中性甲醛溶液中固定1周，剪去心房組織，別離右心室RV和左心室加室間隔LV+S，濾紙吸干后分別稱重，計(jì)算RV.LV+S值以反映右心室肥厚的程度。1.4.4肺組織標(biāo)本采集及標(biāo)本切片制作將左肺置10%中性甲醛溶液中固定，標(biāo)本嚴(yán)格于垂直位石蠟包埋，垂直于支氣管細(xì)支氣管斷面，沿矢狀面最大周徑處進(jìn)展橫斷取材約3厚，酒精梯度脫水，二甲苯透明標(biāo)本，浸蠟，包埋，連續(xù)切片厚度5，作

10、HE染色。1.4.5肺組織切片的半定量分析顯微鏡下觀察大鼠肺組織切片，用SP.2000病理圖文報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)展圖像采集，IAGE.PRplus4.5軟件進(jìn)展圖像分析，測(cè)量與呼吸性細(xì)支氣管及肺泡管伴行的肺小動(dòng)脈外徑、管壁厚度、血管總面積及管壁面積，計(jì)算管壁厚度占血管外徑的百分比T%和管壁面積占血管總面積的百分比A%。每只大鼠肺切片共測(cè)量10條血管的上述指標(biāo)，計(jì)算均數(shù)進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。1.4.6免疫組織化學(xué)分析將上述肺組織標(biāo)本切片貼于多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片上，常規(guī)脫蠟至水，3%H22孵育，胃蛋白酶消化液修復(fù)抗原，正常兔血清封閉，滴加一抗山羊抗大鼠，Santaruz公司和二抗兔抗山羊，福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)

11、，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染后顯微鏡觀察以細(xì)胞質(zhì)明晰棕色為陽(yáng)性，并進(jìn)展免疫組織化學(xué)圖像分析。1.4.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以xs表示，組間均數(shù)比擬采用兩樣本均數(shù)配對(duì)t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1肺動(dòng)脈高壓模型建立常壓低氧3周后，低氧組的大鼠肺小血管普遍增厚，管腔狹窄，PAP為26.731.52Hg1Hg=0.133kPa，高于正常對(duì)照組的15.500.82Hg，差異有顯著性P0.01，提示低氧性肺動(dòng)脈高壓模型制作成功。2.2右心室肥厚形成常壓低氧3周后，低氧組的大鼠RV.LV+S為33.361.46%，高于正常對(duì)照組的22.670.76%，差異有顯著性P0.01，提示低氧3周后產(chǎn)

12、生了右心室肥厚。2.3低氧性肺血管重建模型形成經(jīng)過(guò)肺小血管圖像分析，常壓低氧3周后，低氧組大鼠的T%、A%分別為63.742.54和78.472.73，均高于正常對(duì)照組分別為33.455.23和40.563.45，差異有顯著性P0.01，提示低氧3周后低氧性肺血管重建形成。2.4TGF在血管壁的表達(dá)正常對(duì)照組肺小動(dòng)脈壁未檢測(cè)到TGF表達(dá)圖1;而低氧組肺小動(dòng)脈壁TGF表達(dá)呈陽(yáng)性，且以管壁外膜居多，內(nèi)皮層略有表達(dá)，中膜平滑肌層幾乎無(wú)表達(dá)圖2。免疫組織化學(xué)圖像分析結(jié)果提示，肺組織切片TGF陽(yáng)性面積占肺小動(dòng)脈面積比正常對(duì)照組為0，而低氧組為2.230.30。3討論肺血管重建是肺動(dòng)脈高壓持續(xù)開(kāi)展的關(guān)鍵因

13、素，其病理改變主要為內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和肥大、中層平滑肌增生肥厚、膠原纖維和彈力纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分增多。本研究發(fā)現(xiàn)，在常壓低氧3周后，大鼠PAP明顯升高，右心室肥厚;圖像分析提示代表肺血管重建的兩個(gè)指標(biāo)T%和A%均較正常對(duì)照組明顯增高，說(shuō)明已成功建立了低氧性肺血管重建模型。TGF是一種富含半胱氨酸的多肽，屬即刻早期基因家族N的成員之一。TGF對(duì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、作為支撐構(gòu)造的細(xì)胞外基質(zhì)等組織均有重要的生物學(xué)作用，且對(duì)低氧等原因引起的血管生成過(guò)程有積極的促進(jìn)作用3;機(jī)械應(yīng)力如血管壓力增高4、低氧5及與肺血管重建親密相關(guān)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子6等生長(zhǎng)因子均可誘導(dǎo)TGF表達(dá)增加。實(shí)驗(yàn)中作者觀察到:

14、正常對(duì)照組肺小血管壁未見(jiàn)TGF蛋白表達(dá);而試驗(yàn)組的肺小血管壁除明顯增厚、內(nèi)皮細(xì)胞腫脹肥大、中層平滑肌增生肥厚、細(xì)胞外基質(zhì)成分增多外，血管組織內(nèi)可見(jiàn)不同程度的TGF蛋白沉積，尤其以血管外膜纖維組織居多，血管內(nèi)皮細(xì)胞略有表達(dá)，中膜平滑肌細(xì)胞那么未見(jiàn)表達(dá)。TGF是一種重要的致纖維化因子，刺激成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)合成是其重要作用;TGF在正常血管平滑肌細(xì)胞vasularsthusleell，VS中幾乎不存在，但在粥樣硬化斑塊內(nèi)未增殖的平滑肌細(xì)胞中呈過(guò)度表達(dá)7，人平滑肌細(xì)胞系中TGF瞬間的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致其凋亡加速8，因此推測(cè)TGF僅存在于未增殖或近凋亡的VS中。而本實(shí)驗(yàn)中低氧性肺血管重建的VS呈高度

15、增殖狀態(tài)，可能是血管中膜未見(jiàn)TGF表達(dá)的原因。TGF促進(jìn)中層平滑肌增生可能通過(guò)旁分泌途徑起作用。所以作者認(rèn)為，TGF在大鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓和肺血管重建過(guò)程中起到一定作用，但其在人體是否有一樣表現(xiàn)，其作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、作用發(fā)生的階段、早期干預(yù)能否預(yù)防肺動(dòng)脈高壓和肺血管重建的發(fā)生以及如何延緩其進(jìn)展尚待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1DURIZAG，STENARKKR.ehanissfstruturalredelinginhrnipulnaryhypertensinJ.PediatrRev，1999，2011:91.102.2薛全福，謝劍鳴，胡長(zhǎng)貴，等.常壓低氧性大鼠肺動(dòng)脈高壓模型的建立J.中華結(jié)核和呼吸雜

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