血管性癡呆小鼠海馬NOS活力和nNOS蛋白表達(dá)的改變

1、血管性癡呆小鼠海馬NOS活力和nNOS蛋白表達(dá)的改變【關(guān)鍵詞】血管hangesfNSativityandnNSexpressininhippapusfvasulardeentiaie【Keyrds】deentia,vasular;hippapus;neurnalnitrixidesynthase;nitrixidesynthase【摘要】目的：觀察血管性癡呆(VD)小鼠海馬內(nèi)一氧化氮合酶NS的活性和神經(jīng)元型一氧化氮合酶nNS陽性神經(jīng)元的表達(dá)，討論VD的發(fā)活力制.方法：復(fù)制小鼠VD模型，利用Y迷宮檢測VD模型小鼠學(xué)習(xí)記憶才能，采用NADPHd組織化學(xué)和nNS免疫組織化學(xué)方法，研究VD小鼠與正常小

2、鼠海馬NS和nNS陽性神經(jīng)元數(shù)量的變化.結(jié)果：VD小鼠比正常小鼠Y迷宮學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練次數(shù)明顯增多，差異有顯著性P0.01；海馬A1區(qū)NS和nNS陽性神經(jīng)元的數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P0.05.結(jié)論：VD的發(fā)生可能與海馬NS和nNS陽性神經(jīng)元的數(shù)量增多有關(guān).【關(guān)鍵詞】癡呆，血管性；海馬；神經(jīng)元型一氧化氮合酶；一氧化氮合酶0引言自20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性一氧化氮nitrixide,N以來，其復(fù)雜的生理及病理作用已引起人們的廣泛重視.N是由一氧化氮合酶(nitrixidesynthase,NS)催化L精氨酸而生成，NS在腦缺氧缺血中的雙重作用已日益受到重視.我們采用組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)的方法

3、，討論(vasulardeentia,VD)小鼠海馬構(gòu)造內(nèi)NS和nNS陽性神經(jīng)元數(shù)目的變化以期提醒VD的發(fā)活力制.1材料和方法1.1材料成年安康昆明系雄性小鼠共36只購自天津市實驗動物中心，體質(zhì)量(303)g，隨機(jī)等分為3組：正常對照組、假手術(shù)組、VD模型組n=12.1.2方法10L/kg,ip麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺上，頸正中切口，手術(shù)別離雙側(cè)頸總動脈nartidarteries,A穿線備用，模型組在夾閉雙側(cè)A之前，腹腔注射硝普鈉2.5g/kg，隨即用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)A10in，通10in,再夾閉10in,再通后縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)1.假手術(shù)組麻醉及手術(shù)方法與模型組一樣，但僅暴露雙側(cè)

4、A，不阻斷A,不注射硝普鈉，觀察時間與模型組一樣.有光、無電適應(yīng)60s后切換光源無光源的兩臂及三臂連接處有電，待動物進(jìn)入有光無電處后開場記時，30s時切換光源.如此進(jìn)展切換20次，每次切換光源都使動物學(xué)習(xí)1次，每日每只動物最多如此學(xué)習(xí)20次，第20次切換后待動物進(jìn)入有光無電處后適應(yīng)30s將動物取出.每只動物連續(xù)9次從無光有電處直接進(jìn)入有光無電處為學(xué)會，第1日學(xué)不會者第2日繼續(xù)學(xué)習(xí)，直至學(xué)會.將學(xué)會次數(shù)進(jìn)展統(tǒng)計學(xué)分析.10L/kg,ip麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，并剪開右心耳形成灌注液排出通道，從左心室快速灌注溫生理鹽水，至流出液清亮，此時接著灌入4的40g/L多聚甲醛

5、，3040in灌畢，迅速取腦置于4的40g/L多聚甲醛固定液中后固定6h，100,200和300g/L蔗糖溶液梯度脫水.將大腦沿矢狀面切開，將左側(cè)大腦半球置于恒冷箱冰凍切片機(jī)內(nèi)做連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚約50,0.01l/LPBSpH7.4接片后進(jìn)展NADPHd組化染色和nNS免疫組化染色.反響液，37孵育1h，反響液成分：NADPHSiga公司5g，NTB(氯化硝基四氮唑藍(lán)，華美公司)2.5g,3L/L的TritnTBS5L.終止反響后裱片，脫水，透明，封片.反響切片移入373L/L的TritnH22中孵育30in,PBS緩沖液漂洗后以30L/L的正常羊血清封閉30in，然后加nNS抗體120

6、0,Santaruz公司，4溫盒內(nèi)孵育72h.漂洗后加生物素標(biāo)記的兔抗羊血清1200，37孵育1h，漂洗后AB液1100,Vetr公司37孵育1h，漂洗后加0.5L/L的DAB和0.1L/L的H22顯色，鏡下控制反響時間510in，常規(guī)裱片，脫水，透明，封片.DG三區(qū)所有NS和nNS陽性細(xì)胞數(shù).統(tǒng)計學(xué)處理：利用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)展統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以xs表示，經(jīng)方差齊性檢驗，表1方差不齊，采用多個樣本的秩和檢驗，表2和表3方差齊，組間差異比擬采用單因素方差分析和兩兩比擬的q檢驗.2結(jié)果2.1VD小鼠行為學(xué)測試與正常對照組和假手術(shù)組相比，VD模型組小鼠Y迷宮學(xué)習(xí)記憶次數(shù)明顯增加，差異

7、顯著(13441)vs(4314)和4710，P0.01；而正常對照組與假手術(shù)組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；VD模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶才能明顯降低.2.2VD模型組小鼠海馬各區(qū)NADPHd陽性神經(jīng)元數(shù)量的變化與正常對照組和假手術(shù)組相比，VD模型組小鼠海馬及其A1區(qū)NADPHd陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P0.01，A3區(qū)和DG無明顯差異；而正常對照組與假手術(shù)組相比，海馬各區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明VD模型組小鼠海馬及其A1區(qū)NS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多表1,圖1).表1VD小鼠海馬及其各分區(qū)的NS陽性神經(jīng)元數(shù)量略2.3VD模型組小鼠海馬各區(qū)nNS陽性神經(jīng)元數(shù)量的變化與正常對照組和假手術(shù)

8、組相比，VD模型組小鼠海馬及其A1區(qū)nNS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P0.01，A3區(qū)和DG無明顯差異；而正常對照組與假手術(shù)組相比，海馬各區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均無統(tǒng)計學(xué)差異；VD模型組小鼠海馬及其A1區(qū)nNS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯增多表2,圖2).表2VD小鼠海馬及其各分區(qū)nNS陽性神經(jīng)元數(shù)量略3討論目前常用于VD研究的動物模型主要有四血管阻斷4V法和兩血管阻斷2V法.有報道說明，較嚴(yán)重的不完全性腦缺血動物大腦損傷較一樣時間完全腦缺血的動物恢復(fù)差.因此本研究采用王蕊等1的VD模型方法制作動物模型.N性質(zhì)活潑，半衰期極短，在體內(nèi)生物半衰期僅數(shù)秒鐘，故N的作用與NS程度親密相關(guān)，對NS蛋白表達(dá)變

9、化的研究是對N進(jìn)展深化討論的重要環(huán)節(jié).NS有3種類型，分別為nNS,eNS和iNS，其中nNS產(chǎn)生的N可致腦缺氧缺血的早期腦損傷.N作為細(xì)胞內(nèi)信使參與長時程增強(qiáng)LTP的誘導(dǎo)和形成，NS與N可影響學(xué)習(xí)記憶等過程，nNS被認(rèn)為是影響學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵酶.海馬是腦組織對缺氧缺血最敏感的部位之一，腦缺氧缺血時，由于能量代謝衰竭，可致離子泵功能障礙，興奮性氨基酸釋放，大量a2內(nèi)流，激活a2依賴性NS，導(dǎo)致N的過量合成，N在缺氧缺血性腦損害中的作用已日益受到重視.任何來源的N在高濃度時均可抑制多種線粒體電荷傳遞系統(tǒng)的酶，從而抑制細(xì)胞呼吸和能量代謝；N還可以通過與氧自由基反響形成活性更高的毒性基團(tuán)，通過脂質(zhì)過氧

10、化作用、酶滅活及DNA硝化作用導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡.有實驗說明N作為一種血管、神經(jīng)活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)腦血流、促進(jìn)或抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放、參與突出可塑性、神經(jīng)元興奮毒性及炎癥損害等多種作用，且與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān).據(jù)報道給大鼠腹腔注射NS抑制劑，可損害大鼠學(xué)習(xí)記憶才能，而注射N的合成原料可減輕這種損傷，腦組織NS的持續(xù)性激活及一氧化氮含量的升高不僅參與缺血性腦損害，而且在癡呆形成中可能發(fā)揮重要作用2.本結(jié)果顯示VD小鼠海馬A1區(qū)NS及nNS陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高，并且與行為學(xué)上變化相一致，而A3區(qū)和DG無明顯變化，這可能與海馬A1區(qū)是缺氧易損區(qū)、海馬A3區(qū)和DG是缺氧抵抗區(qū)有關(guān)3，說明海馬中的NS陽性神經(jīng)元可能參與了VD的形成，為將來討論VD的防治提供了進(jìn)一步研究的根底.【參考文獻(xiàn)】1王蕊，楊秦飛，唐一鵬，等.大鼠擬“血管性癡呆模型的改良J.中國病理生理雜志，2000,1610:914-916.2eyerR,SpanglerEL,PatelN,etal.Ipairedlearninginratsina14unitTazeby7nitrindaz