血管性癡呆小鼠海馬NOS活力和nNOS蛋白表達的改變

1、血管性癡呆小鼠海馬NOS活力和nNOS蛋白表達的改變【關鍵詞】血管hangesfNSativityandnNSexpressininhippapusfvasulardeentiaie【Keyrds】deentia,vasular;hippapus;neurnalnitrixidesynthase;nitrixidesynthase【摘要】目的：觀察血管性癡呆(VD)小鼠海馬內一氧化氮合酶NS的活性和神經元型一氧化氮合酶nNS陽性神經元的表達，討論VD的發(fā)活力制.方法：復制小鼠VD模型，利用Y迷宮檢測VD模型小鼠學習記憶才能，采用NADPHd組織化學和nNS免疫組織化學方法，研究VD小鼠與正常小

2、鼠海馬NS和nNS陽性神經元數(shù)量的變化.結果：VD小鼠比正常小鼠Y迷宮學習記憶訓練次數(shù)明顯增多，差異有顯著性P0.01；海馬A1區(qū)NS和nNS陽性神經元的數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義P0.05.結論：VD的發(fā)生可能與海馬NS和nNS陽性神經元的數(shù)量增多有關.【關鍵詞】癡呆，血管性；海馬；神經元型一氧化氮合酶；一氧化氮合酶0引言自20世紀80年代發(fā)現(xiàn)內源性一氧化氮nitrixide,N以來，其復雜的生理及病理作用已引起人們的廣泛重視.N是由一氧化氮合酶(nitrixidesynthase,NS)催化L精氨酸而生成，NS在腦缺氧缺血中的雙重作用已日益受到重視.我們采用組織化學和免疫組織化學的方法

3、，討論(vasulardeentia,VD)小鼠海馬構造內NS和nNS陽性神經元數(shù)目的變化以期提醒VD的發(fā)活力制.1材料和方法1.1材料成年安康昆明系雄性小鼠共36只購自天津市實驗動物中心，體質量(303)g，隨機等分為3組：正常對照組、假手術組、VD模型組n=12.1.2方法10L/kg,ip麻醉后，仰臥固定在手術臺上，頸正中切口，手術別離雙側頸總動脈nartidarteries,A穿線備用，模型組在夾閉雙側A之前，腹腔注射硝普鈉2.5g/kg，隨即用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側A10in，通10in,再夾閉10in,再通后縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)1.假手術組麻醉及手術方法與模型組一樣，但僅暴露雙側

4、A，不阻斷A,不注射硝普鈉，觀察時間與模型組一樣.有光、無電適應60s后切換光源無光源的兩臂及三臂連接處有電，待動物進入有光無電處后開場記時，30s時切換光源.如此進展切換20次，每次切換光源都使動物學習1次，每日每只動物最多如此學習20次，第20次切換后待動物進入有光無電處后適應30s將動物取出.每只動物連續(xù)9次從無光有電處直接進入有光無電處為學會，第1日學不會者第2日繼續(xù)學習，直至學會.將學會次數(shù)進展統(tǒng)計學分析.10L/kg,ip麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，并剪開右心耳形成灌注液排出通道，從左心室快速灌注溫生理鹽水，至流出液清亮，此時接著灌入4的40g/L多聚甲醛

5、，3040in灌畢，迅速取腦置于4的40g/L多聚甲醛固定液中后固定6h，100,200和300g/L蔗糖溶液梯度脫水.將大腦沿矢狀面切開，將左側大腦半球置于恒冷箱冰凍切片機內做連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚約50,0.01l/LPBSpH7.4接片后進展NADPHd組化染色和nNS免疫組化染色.反響液，37孵育1h，反響液成分：NADPHSiga公司5g，NTB(氯化硝基四氮唑藍，華美公司)2.5g,3L/L的TritnTBS5L.終止反響后裱片，脫水，透明，封片.反響切片移入373L/L的TritnH22中孵育30in,PBS緩沖液漂洗后以30L/L的正常羊血清封閉30in，然后加nNS抗體120

6、0,Santaruz公司，4溫盒內孵育72h.漂洗后加生物素標記的兔抗羊血清1200，37孵育1h，漂洗后AB液1100,Vetr公司37孵育1h，漂洗后加0.5L/L的DAB和0.1L/L的H22顯色，鏡下控制反響時間510in，常規(guī)裱片，脫水，透明，封片.DG三區(qū)所有NS和nNS陽性細胞數(shù).統(tǒng)計學處理：利用SPSS11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據進展統(tǒng)計學分析，結果以xs表示，經方差齊性檢驗，表1方差不齊，采用多個樣本的秩和檢驗，表2和表3方差齊，組間差異比擬采用單因素方差分析和兩兩比擬的q檢驗.2結果2.1VD小鼠行為學測試與正常對照組和假手術組相比，VD模型組小鼠Y迷宮學習記憶次數(shù)明顯增加，差異

7、顯著(13441)vs(4314)和4710，P0.01；而正常對照組與假手術組相比，差異無統(tǒng)計學意義；VD模型組小鼠學習記憶才能明顯降低.2.2VD模型組小鼠海馬各區(qū)NADPHd陽性神經元數(shù)量的變化與正常對照組和假手術組相比，VD模型組小鼠海馬及其A1區(qū)NADPHd陽性神經元數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義P0.01，A3區(qū)和DG無明顯差異；而正常對照組與假手術組相比，海馬各區(qū)神經元數(shù)量均無統(tǒng)計學差異，說明VD模型組小鼠海馬及其A1區(qū)NS陽性神經元數(shù)量明顯增多表1,圖1).表1VD小鼠海馬及其各分區(qū)的NS陽性神經元數(shù)量略2.3VD模型組小鼠海馬各區(qū)nNS陽性神經元數(shù)量的變化與正常對照組和假手術

8、組相比，VD模型組小鼠海馬及其A1區(qū)nNS陽性神經元數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義P0.01，A3區(qū)和DG無明顯差異；而正常對照組與假手術組相比，海馬各區(qū)神經元數(shù)量均無統(tǒng)計學差異；VD模型組小鼠海馬及其A1區(qū)nNS陽性神經元數(shù)量明顯增多表2,圖2).表2VD小鼠海馬及其各分區(qū)nNS陽性神經元數(shù)量略3討論目前常用于VD研究的動物模型主要有四血管阻斷4V法和兩血管阻斷2V法.有報道說明，較嚴重的不完全性腦缺血動物大腦損傷較一樣時間完全腦缺血的動物恢復差.因此本研究采用王蕊等1的VD模型方法制作動物模型.N性質活潑，半衰期極短，在體內生物半衰期僅數(shù)秒鐘，故N的作用與NS程度親密相關，對NS蛋白表達變

9、化的研究是對N進展深化討論的重要環(huán)節(jié).NS有3種類型，分別為nNS,eNS和iNS，其中nNS產生的N可致腦缺氧缺血的早期腦損傷.N作為細胞內信使參與長時程增強LTP的誘導和形成，NS與N可影響學習記憶等過程，nNS被認為是影響學習記憶的關鍵酶.海馬是腦組織對缺氧缺血最敏感的部位之一，腦缺氧缺血時，由于能量代謝衰竭，可致離子泵功能障礙，興奮性氨基酸釋放，大量a2內流，激活a2依賴性NS，導致N的過量合成，N在缺氧缺血性腦損害中的作用已日益受到重視.任何來源的N在高濃度時均可抑制多種線粒體電荷傳遞系統(tǒng)的酶，從而抑制細胞呼吸和能量代謝；N還可以通過與氧自由基反響形成活性更高的毒性基團，通過脂質過氧

10、化作用、酶滅活及DNA硝化作用導致神經元的死亡.有實驗說明N作為一種血管、神經活性物質，具有調節(jié)腦血流、促進或抑制神經遞質釋放、參與突出可塑性、神經元興奮毒性及炎癥損害等多種作用，且與學習和記憶有關.據報道給大鼠腹腔注射NS抑制劑，可損害大鼠學習記憶才能，而注射N的合成原料可減輕這種損傷，腦組織NS的持續(xù)性激活及一氧化氮含量的升高不僅參與缺血性腦損害，而且在癡呆形成中可能發(fā)揮重要作用2.本結果顯示VD小鼠海馬A1區(qū)NS及nNS陽性神經元數(shù)量明顯升高，并且與行為學上變化相一致，而A3區(qū)和DG無明顯變化，這可能與海馬A1區(qū)是缺氧易損區(qū)、海馬A3區(qū)和DG是缺氧抵抗區(qū)有關3，說明海馬中的NS陽性神經元可能參與了VD的形成，為將來討論VD的防治提供了進一步研究的根底.【參考文獻】1王蕊，楊秦飛，唐一鵬，等.大鼠擬“血管性癡呆模型的改良J.中國病理生理雜志，2000,1610:914-916.2eyerR,SpanglerEL,PatelN,etal.Ipairedlearninginratsina14unitTazeby7nitrindaz