印跡法的基本原理及應(yīng)用

1、印跡法（blotting）即轉(zhuǎn)移電泳,是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新方法。Southern于1975年建立了檢測(cè)特異DNA片段的DNA-RNA雜交法，稱作Southern印跡法。1977年Alwine等把此方法應(yīng)用到RNA的研究方面，稱作Nouthern印跡法。1979年Towbin等則把該方法擴(kuò)展應(yīng)用到蛋白質(zhì)分析方面，稱作Western印跡法。1982年Reinhart報(bào)道的雙向蛋白質(zhì)印跡法/稱作Eastern印跡法。目前，有人把Southern，Nouthern，Western印跡法分別稱作DNA印跡法，RNA印跡法和蛋白質(zhì)印跡法。而每一種印跡法又可以分為斑點(diǎn)印跡法和電泳轉(zhuǎn)移印跡法。前

2、者是將樣品直接吸附于固相載體上，而后者則是將樣品先經(jīng)過電泳后在轉(zhuǎn)移到固相載體表面上，其余操作基本相同。由于核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)印跡到固相載體，容易和各種探針發(fā)生化學(xué)或免疫反應(yīng)，因而對(duì)檢測(cè)樣品（尤其是粗樣品）中某些組分的理化性質(zhì)是有益的。其操作過程所需的試劑量少，靈敏度高，所以應(yīng)用較為普遍。印跡法的基本原理（一）概念1探針用化學(xué)方法將有識(shí)別能力的物質(zhì)（如抗原、激素、核酸等）和酶（如辣根過氧化物酶）或核素（如3H、35S、32P），或熒光物質(zhì)（如異硫氰熒光素、地高辛等）結(jié)合成的復(fù)合物稱作探針。2固相載體即用于吸附生命大分子物質(zhì)的固體材料。這類材料有硝酸纖維素（nitrocellulose，NC

3、）膜，尼龍膜（nylon-membranes，NDM），重氮芐氧甲基（yloxymethyl，DBM）膜和重氮芐硫醚（diazophenylthiaether，DPT）紙等。最常用的是孔徑為0.45/lm的NC膜，因?yàn)樗杀镜土?，結(jié)合力強(qiáng)，背景較清晰。而對(duì)于檢測(cè)核酸和酸性蛋白質(zhì)來說，理想載體是帶正電的尼龍膜，它與負(fù)電荷物質(zhì)結(jié)合力很強(qiáng)，操作亦簡(jiǎn)單。但因?yàn)槠渑c負(fù)離子型染料也易結(jié)合，背景值高，故使用受到一些限制。3封阻用一種與待測(cè)物不反應(yīng)的物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸、吐溫20等）封阻載體印跡區(qū)域以外的剩余吸附位點(diǎn)，使探針與印跡物反應(yīng)，且不吸附到載體上，此過程稱為封阻，從而使印跡結(jié)果背景干凈，印跡的斑點(diǎn)或譜

4、帶更為清晰。4印跡把經(jīng)過凝膠電泳后的組分，通過吸附或電泳方法轉(zhuǎn)移或者以直接點(diǎn)樣方式吸附到固相載體上，此過程稱電泳印跡，或稱點(diǎn)印跡。5放射自顯影將含放射性核素的復(fù)合物置X線感光膠片上壓片，當(dāng)放射性核素電離輻射時(shí)，膠片上會(huì)發(fā)生化學(xué)“感光”作用，隨后經(jīng)顯影，定影，即可呈現(xiàn)出斑點(diǎn)或譜帶，此法較靈敏。（二）原理生命大分子物質(zhì)（如核酸或蛋白質(zhì)）印跡到固相載體上，經(jīng)淬滅試劑處理后，可與相應(yīng)的探針（酶標(biāo)記）反應(yīng)，接著用適當(dāng)?shù)娜芤浩?，置含底物的溶液中顯色，即可現(xiàn)出譜帶。如所用探針為放射性核素標(biāo)記物時(shí)，則應(yīng)將漂洗后的載體進(jìn)行放射自顯影，即可檢測(cè)出樣品中特異的成分。印跡法的應(yīng)用（一）分析和制備特異成分一般生命大分

5、子如蛋白質(zhì)等的粗制品經(jīng)過凝膠電泳后，常常產(chǎn)生許多譜帶。但它再經(jīng)印跡轉(zhuǎn)移程序分析后，就可以從中找出所需的某一特殊成分，而這種特殊成分又可以從相應(yīng)的凝膠區(qū)段回收。用此方法得到的物質(zhì)純度較高，純化步驟也較簡(jiǎn)單。（二）檢測(cè)生命大分子之間的相互作用不同生命大分子之間的相互作用是經(jīng)常發(fā)生的，特別是在有機(jī)體內(nèi)。因此，建立一種檢測(cè)生命大分子物質(zhì)之間相互作用的有效方法一直是人們研究的重要課題。而用印跡法就可以檢測(cè)出如DNA-RNA、DNA-蛋白質(zhì)、RNA-蛋白質(zhì)、酶一底物、糖蛋白凝集素、激素受體等物質(zhì)之間的相互作用，同時(shí)也可用此方法尋找各種大分子物質(zhì)的相應(yīng)配體簡(jiǎn)述SouthernBlot雜交的原理、步驟及應(yīng)用原

6、理Southern印跡雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的具體方法之一其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。由于核酸分子的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，綜合凝膠電泳和核酸內(nèi)切限制酶分析的結(jié)果，便可繪制出DNA分子的限制圖譜。但為了進(jìn)一步構(gòu)建出DNA分子的遺傳圖，或進(jìn)行目的基因序列的測(cè)定以滿足基因克隆的特殊要求，還必須掌握DNA分子中基因編碼區(qū)的大小和位置。有關(guān)這類數(shù)據(jù)資料可應(yīng)用Southern印跡雜交技術(shù)獲得。步驟1瓊脂糖電泳（1）取一定量的待測(cè)DNA樣品，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切。DNA的量根據(jù)樣品的種類及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?/p>

7、異，對(duì)于克隆片段的限制性內(nèi)切酶圖譜分析，取0.1-0.5pg即可；而對(duì)于鑒定基因組DNA中的單拷貝基因序列，則需要1020pg;當(dāng)采用寡核苷酸探針或探針的比放射性活性較低時(shí)，則需要3050pg。(2)酶切完畢，在瓊脂糖凝膠中電泳。(3)電泳結(jié)束后，EB染色，長(zhǎng)波紫外線下觀察電泳結(jié)果及照相。2.印跡轉(zhuǎn)移切膠并作標(biāo)記(左下角切除)，以便于定位，然后將凝膠置于一容器中。將凝膠浸泡于適量的變性液中，室溫下放置1h使之變性，不間斷地輕輕搖動(dòng)。(3)將凝膠用去離子水漂洗1次，然后浸泡于適量的中和液中30min,不間斷地輕輕搖動(dòng)。更換中和液，繼續(xù)浸泡15min。(4)將濾紙，硝酸纖維素膜NC膜(以下簡(jiǎn)稱NC

8、膜)剪成與膠同樣大小，NC膜浸入轉(zhuǎn)移buffer中平衡30min。(5)按右圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。(6)虹吸轉(zhuǎn)移12-16h。.固定DNA(1)取出轉(zhuǎn)移后的NC膜，用濾紙吸干NC膜，NC膜光面朝上平鋪于變性液中變性5min。(2)用相同的方法將NC膜平鋪在中性液上，中和兩遍,每遍5min。(3)將膜夾在兩張干燥濾紙間，80C烘烤1-2h。預(yù)雜交(1)將膜浸入5xSSC中2min，將膜放入干凈的塑料袋中。(2)將預(yù)雜交液事先在65C預(yù)熱,然后將10ml預(yù)雜交液加入袋中,封口。(3)65C預(yù)雜交1h以上，不時(shí)搖動(dòng)。雜交(1)取出雜交袋,剪去一角去除雜交液后,加入5ml雜交液及

9、5pl變性探針，排除氣泡后封口。(2)將雜交袋放入65C水中雜交過夜。按下列條件洗膜2xSSC,0.1%SDS50ml室溫5min/2次0.1xSSC,0.1%SDS50ml65C15min/2次免疫酶聯(lián)檢測(cè)(1)偶聯(lián)反應(yīng)用中和液洗膜2min，室溫。用封閉液50ml洗膜30min，室溫，輕搖。用中和液將稀釋抗體-Dig-Ap至750mU/ml，將膜封入雜交袋，加入5ml稀釋抗體輕搖50min。用中和液50ml洗膜,10minx2次，室溫，輕搖,除去未結(jié)合的抗體。（2）顯色反應(yīng)用平衡液20ml平衡膜2min。將膜裝入雜交袋中，加入5ml顯色液，避光30min左右，當(dāng)出現(xiàn)顏色時(shí)不要晃動(dòng)。用TE洗膜

10、終止反應(yīng)。80C烤干。應(yīng)用遺傳病診斷，DNA圖譜分析，檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，PCR產(chǎn)物分析等。常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用一、學(xué)習(xí)重點(diǎn)印跡技術(shù)（包括Southernblotting、Northernblotting、Westernblotting）的原理和應(yīng)用、探針的概念、PCR技術(shù)的工作原理、反應(yīng)體系和反應(yīng)步驟、Sanger法測(cè)序的原理、基因文庫(kù)（包括基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)）的概念、生物芯片技術(shù)（包括基因芯片和蛋白質(zhì)芯片）的概念，酵母雙雜交技術(shù)的基本原理二、學(xué)習(xí)提綱（一）分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交技術(shù)的原理主要涉及分子雜交特性、印跡技術(shù)、探針技術(shù)。1印跡技術(shù)：將在凝膠中分離的生物

11、大分子轉(zhuǎn)移（印跡）或直接放在固定化介質(zhì)上并加以檢測(cè)分析的技術(shù)，包括DNA、RNA、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)。DNA印跡術(shù)又稱為Southernblotting,主要用于基因組DNA的定性和定量分析，亦可分析重組質(zhì)粒和噬菌體。（2）RNA印跡技術(shù)又稱Northernblotting，其基本原理與Southernblotting相同,主要用于檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平，也可以比較不同組織和細(xì)胞中的同一基因的表達(dá)情況。Westernblotting:又稱蛋白質(zhì)印跡術(shù)或免疫印跡技術(shù)，指蛋白質(zhì)在經(jīng)聚丙烯酰胺電泳分離之后轉(zhuǎn)移到膜上,再與溶液中的其它抗體探針相互結(jié)合的技術(shù)。用于檢測(cè)樣品中特異性蛋

12、白質(zhì)的存在、細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的半定量分析以及蛋白分子間的相互作用研究等。印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)包括：毛細(xì)作用轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)移和真空吸引轉(zhuǎn)移。2探針技術(shù)（二）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）1基本工作原理是以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5端和3f端相互補(bǔ)的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸完成新的DNA合成。2.反應(yīng)體系的基本成分包括：模板DNA、特異性引物、耐熱性DNA聚合酶、dNTP以及含有Mg2+的緩沖液。3基本反應(yīng)步驟包括：變性、退火和延伸。主要用于：目的基因的克隆、基因的體外突變、DNA和RNA的微量分析、DNA測(cè)序、基因突變分析。PCR經(jīng)過發(fā)展形成了

13、反轉(zhuǎn)錄PCR、原位PCR、實(shí)時(shí)PCR等多種衍生技術(shù)。（三）核酸序列分析主要有化學(xué)裂解法和DNA鏈末端合成終止法，以后者應(yīng)用最為廣泛。目前自動(dòng)化測(cè)序已基本取代手工測(cè)序。（四）基因文庫(kù)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體，分為基因組DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。1基因組DNA文庫(kù)是指包含某一個(gè)生物細(xì)胞全部基因組DNA序列的克隆群體，它以DNA片段的形式貯存著某一生物的全部基因組DNA信息。2cDNA文庫(kù)是包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細(xì)胞的基因表達(dá)信息。（四）疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定單基因致病情況下

14、的致病基因克隆主要有兩種策略：功能克隆、定位克隆。（五）遺傳修飾動(dòng)物模型的建立主要用到以下三種技術(shù)：轉(zhuǎn)基因技術(shù)、核轉(zhuǎn)移技術(shù)和基因剔除技術(shù)。轉(zhuǎn)基因技術(shù)和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中最重要的用途是建立疾病的可遺傳的動(dòng)物模型。（六）生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)末發(fā)展起來的一項(xiàng)規(guī)?；镄畔⒎治黾夹g(shù)，包括基因芯片和蛋白質(zhì)芯片等。（七）酵母雙雜交技術(shù)。NorthernBlot原理及實(shí)驗(yàn)方法原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,繼而將在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。實(shí)驗(yàn)方法：

15、儀器、試劑、材料（一）儀器恒溫水浴箱，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，真空轉(zhuǎn)移儀，真空泵，UV交聯(lián)儀，雜交爐，恒溫?fù)u床，脫色搖床，漩渦振蕩器，分光光度計(jì)，微量移液器，電爐（或微波爐），離心管，燒杯，量筒，三角瓶等。（二）材料總RNA樣品或mRNA樣品，探針模板DNA（25ng），尼龍膜（三）試劑：NorthernMaxKit（Cat.#1940，Ambion,Inc.），瓊脂糖，DEPC,X光底片，底片暗盒,RandomPrimer，dNTPMixture,111TBq/mmola-32PdCTP,Exo-freeKlenowFragment和10XBuffer,SephadexG-50,SDS，雙氧水

16、，滅菌水等。方法與步驟1.用具的準(zhǔn)備：180度烤器皿：三角錐瓶、量筒、鑷子、刀片等4小時(shí)。電泳槽：清洗梳子和電泳槽，并用雙氧水浸泡過夜，用DEPC水沖洗，干燥備用。處理DEPC水（2L）備用。2用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，電泳槽，刀片等，然后用DEPC水沖洗二次，去除RNAZap。3制膠：.稱取0.36mg瓊脂糖加入三角錐瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波爐加熱至瓊脂糖完全熔解。60C空氣浴平衡溶液（需加DEPC水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分）.在通風(fēng)廚中加入3.6ml的10*DenaturingGelbuffer，輕輕振蕩混勻。注意盡量避免產(chǎn)生氣泡。將熔膠倒入

17、制膠板中，插上梳子如果膠溶液上存在氣泡，可以用熱的玻璃棒或其它方法去除，或?qū)馀萃频侥z的邊緣。注：膠的厚度不能超過0.5cm。4.膠在室溫下完全凝固后，將膠轉(zhuǎn)移到電泳槽中，加入1xMOPSGelRunningbuffer蓋過膠面約1cm，小心拔出梳子。（酉己制250ml1xMOPSGelRunningbuffer，在電泳過程中補(bǔ)充蒸發(fā)的buffer。）5.檢查點(diǎn)樣孔。RNA樣品的制備在RNA樣品中加入3倍體積的formaldehydeloaddye和適當(dāng)?shù)腅B（終濃度為10ug/ml）?；靹蚝螅?5C空氣浴15min。短暫低速離心后，立即放置于冰上5min。電泳：1將RNA樣品小心加到點(diǎn)樣孔中

18、。2在5V/cm下跑膠（5x14cm）。在電泳過程中，每隔30min短暫停止電泳，取出膠，混勻兩極的電泳液后繼續(xù)電泳。當(dāng)膠中的溴紛藍(lán)（500bp）接近膠的邊緣時(shí)終止電泳。3紫外燈下，檢驗(yàn)電泳情況，并用尺子測(cè)量18S、28S、溴紛藍(lán)到點(diǎn)樣孔的距離。注意不要讓膠在紫外燈下曝光太長(zhǎng)時(shí)間。轉(zhuǎn)膜用3%雙氧水浸泡真空轉(zhuǎn)移儀后，用DEPC水沖洗。.用RNAZap擦洗多孑澹水屏和塑膠屏，用DEPC水沖洗二次。3連接真空泵和真空轉(zhuǎn)移儀，剪取一塊適當(dāng)大小的膜（膜的四邊緣應(yīng)大于塑膠屏孔口的5mm）,膜在Transferbuffer浸濕5分鐘后，放置在多孔滲水屏的適當(dāng)位置。4蓋上塑膠屏，蓋上外框，扣上鎖。5將膠的多余部分切除，切后的膠四邊緣要能蓋過塑膠屏孑，并至少蓋過邊緣約2mm，以防止漏氣。6將膠小心放置在膜的上面，膜與膠之間不能有氣泡。打開真空泵，使壓強(qiáng)維持在5058mbar;立即將transferbuffer加到膠面和四周。每隔10min在膠面加上1mltransferbuffer，真空轉(zhuǎn)移2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜后，用鑷子夾住膜，于1xMOPSGelRunningbuffer中輕輕泡洗10秒，去除殘余的膠和鹽。9用吸水紙吸取膜上多余的液體后，