單抗的制備方法(實(shí)驗(yàn)室Protocol)

1、單抗的制備方法免疫BALB/C小鼠的免疫BALB/C小鼠的免疫按常規(guī)方法進(jìn)行，二免后一個(gè)星期分別用斷尾抽真空法采血200PL進(jìn)行抗體檢測，二免采血后讓小鼠休息兩周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三天后融合。表1BALB/c小鼠的免疫方案（供參考免疫次數(shù)時(shí)間免疫劑量（pg/mL）免疫方法佐劑首免0d100頸背部皮F弗氏完全佐劑二免21d100腹腔注射兆氏不完全佐加強(qiáng)42d（融合前三200腹腔注射劑天）不加佐劑BALB/c小鼠的抗體檢測2.1BALB/c小鼠血清的制備將采集的全血樣品于37C溫箱放置30min后，4C放置半天，待血清析出后，4500i7min,離心lOinin,用移液器吸岀血清，4C放置待檢。2.2

2、間接ELISA法的建立BALB/c小鼠免疫后，用間接ELISA法対其血清抗體水平進(jìn)行檢測，間接ELISA法步驟如下：包被：4C包被過夜。洗板：棄去包被液，拍干，向酶標(biāo)板內(nèi)加入洗滌液，每孔200j.iL,35min后倒掉洗滌液，再拍干。如此重復(fù)三次。加待檢血清：將血清用ELISA洗滌液從1：10000開始進(jìn)行倍比稀釋（即1：10000、20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000）,共8個(gè)濃度。將稀釋好的血清按濃度宙低至高的順序加入酶標(biāo)板內(nèi)，每孔lOOpL,每只小鼠的血清做兩列，在37C溫箱內(nèi)孵育30min。同時(shí)設(shè)陰性血清対照。洗板：同上。加HRP

3、標(biāo)二抗：工作濃度1：10000,每孔100j.iL,在37C溫箱內(nèi)孵育30min后，洗板三次。顯色：加底物（TMB-iS氧化MK）,每孔lOOpL,37C溫箱放置10min,加2mol/LH.SO,終止顯色反應(yīng)，每孔50pL,用酶標(biāo)儀測定OD值。24450結(jié)果判定：P.2,判為陽性（P、N分別為待檢和陰性血清的OD值）。4502.3SP2/0骨髓瘤的復(fù)蘇當(dāng)血清效價(jià)高于1：10000時(shí)，開始復(fù)蘇瘤細(xì)胞并注射一只BALB/C小鼠，過程如下：將裝右SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的紗布袋從液氮罐中取出，用止血鉗夾出一管，將紗布袋放回液氮罐，用止血鉗夾著裝有SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的凍存管在37C水浴中轉(zhuǎn)動(dòng)，肖到細(xì)胞

4、解凍，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液10mL,1200i7min,5min,洗細(xì)胞兩次，用8mL完全培養(yǎng)液將細(xì)胞巫懸后加入培養(yǎng)瓶中，在CO,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待SP2/0骨尚瘤2細(xì)胞長滿瓶底（培養(yǎng)3天左右），將細(xì)胞吹洗下來，離心去上清，用lmL上清將細(xì)胞重懸，取0.5mL注射到BALB/c小鼠頸背部皮下，一周后開始觀察注射部位是否有瘤子長出。待到瘤子長到金豆大小時(shí)（9天左右），對BALE/c小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，三天后做融合。2.4細(xì)胞融合與培養(yǎng)2.4.1細(xì)胞融合器材與試劑的準(zhǔn)備小剪刀、小毀子（各10套）：用酒精棉球擦過后，晾于，裝入小鋁盒滅菌；玻璃勻漿器（至少三套）：檢查是否破損、配套，裝盒滅菌

5、；玻璃吸管10mL、5mL（用定制的鋁盒盛裝，至少各一盒，約40支），lmL（l支）用報(bào)紙卷好滅菌；linL注射器（1支，用報(bào)紙包好）和7號(hào)針頭（用小鋁盒裝）滅菌，抽取HAT用；50mL離心管：4支，裝少量三蒸水，包上報(bào)紙，用橡皮筋扎好，再把蓋擰松,裝入500niL燒杯，用紗布蓋口，滅菌；吸水紙：剪成10cm見方的小塊（若干張），用報(bào)紙包好，滅菌，細(xì)胞融合時(shí)控干水滴用；無菌96孔板四塊；血球記數(shù)板1塊；lOOinL葡萄糖瓶（2個(gè)）滅菌，一個(gè)用來裝飼養(yǎng)細(xì)胞，另一個(gè)用來裝501HLRPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液并提前溫育到37C；泡沫板一塊：15cmx25cm,解剖小鼠用；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)

6、液1瓶；RPMI-1640培養(yǎng)完全液1瓶;HAT（lOOx）；50%PEG-1450用凍存管分裝成每管0.83111L后，4C保存，融合當(dāng)天取一管置COJH溫2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育至37C,備用。2.4.2飼養(yǎng)細(xì)胞的制備在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，本實(shí)驗(yàn)室采用BALB/c小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞的混合細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，其制備步驟如下：脫頸椎處死空白BALB/c小鼠1只，用75%的酒精浸泡5mino于超凈工作臺(tái)內(nèi)，將小鼠腹部朝上，用針頭將4個(gè)腳學(xué)固定在墊有滅菌報(bào)紙的泡沫板上。用止血鉗（酒精燈火焰燒過）從鋁盒中夾出一套小剪刀和小銀子，用小錢子夾緊小鼠下腹部皮膚并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，將剪刀尖從小

7、口伸進(jìn)去，打開剪刀將小口向兩邊撐開并向下按住小鼠的兩后肢，將小銀子從撐開的小口伸進(jìn)去，夾緊并掛住剪開的皮膚向前撕扯，直到胸腹部完全暴露出來。換一套小剪刀和銀子，用小銀子在小鼠腹中部捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一3mm左右的小口，將小銀子擱在腹膜上，小剪刀擱在小鋁盒蓋沿備用。用5mL吸管吸取2.5inLRPMI-1640礎(chǔ)培養(yǎng)液，小鍛子提起腹膜，吸管尖從剪開的小口伸進(jìn)去，將培養(yǎng)液注入小鼠的腹腔，吹吸數(shù)次后，將培養(yǎng)液吸出轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，如此重復(fù)一次。將小鼠兩后肢交叉固定（左后肢在上以便于脾臟的暴露），用小鐵子在遠(yuǎn)離脾臟的部位捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，將

8、剪刀尖從小口伸進(jìn)去,三天后做融合。2.4.3SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的制備本實(shí)驗(yàn)室將BALB/C小鼠體內(nèi)生長的SP2/0骨髓瘤勻漿后制備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，然后再用于融合，其制備步驟如下：將背部皮下長出骨髓瘤的BALB/c小鼠脫頸椎處死，用75%的酒精辱盜mA、在一支滅菌50mL離心管中事先加入15mL淋巴細(xì)胞分離液。背部朝上固電小鼠，參照飼養(yǎng)細(xì)胞的制備方法，分離骨髓瘤（只要蠶豆大小的一塊瘤子即夠做一姻合少勻漿制備骨髓瘤細(xì)胞。取15mL骨髓瘤細(xì)胞懸液輕輕加到淋巴細(xì)胞分離液湖玄注意：要保證兩種液體呈分層狀態(tài)，千力不能將液體混勻。1700r/inin,水平離心10min后，取出離心管可見，在骨髓瘤細(xì)

9、胞懸液和淋巴細(xì)胞分離液的交界處仃一層白色的細(xì)胞，這就是骨髓瘤細(xì)胞，用10mL吸管吸走上層細(xì)胞懸液后，將中層的骨髓瘤細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到另一支滅菌50mL離心管中，用15mLRPMI-1640ffi礎(chǔ)培養(yǎng)液，1200r/miii,5min洗細(xì)胞兩次。用10mLRPMI1640煎礎(chǔ)培養(yǎng)液巫懸骨髓瘤細(xì)胞，用4血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。骨髓瘤細(xì)胞濃度=（四角+中央中方格的細(xì)胞數(shù)）x5xl0個(gè)/毫升2.4.4免疫睥細(xì)胞的制備將免疫小鼠的脾細(xì)胞分離出來并勻漿制備免疫睥細(xì)胞，其方法同2.2.2.6.2飼養(yǎng)細(xì)胞制備時(shí)脾細(xì)胞的制備，只是免疫過的脾臟被大量結(jié)締組織包裹分離起來比正常脾臟困難一些，如果不能完整的分離，可以分小塊分離

10、。2.4.5免疫脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合本實(shí)驗(yàn)室用分子量為1450的50%PEG作融合劑進(jìn)行細(xì)胞融合，細(xì)胞融合按常規(guī)方法進(jìn)行，其操作步驟如下：7取1x10個(gè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫睥細(xì)胞混合，用15mLRPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液巫懸，1500r/min,5min洗細(xì)胞兩次。于超凈工作臺(tái)內(nèi)取出滅菌的吸水紙，將裝有骨髓瘤細(xì)胞與免疫睥細(xì)胞混合細(xì)胞的50mL離心管上清倒盡后，倒扣在吸水紙上控干水滴。用小鋁鍋裝2/3容積的水，于電爐上加熱到37C后放進(jìn)超凈工作臺(tái)；從CO,培養(yǎng)箱取出溫育至37C的50%PEG,用1mL的吸管吸取0.8inL,手持裝有混合細(xì)胞的50mL離心管，將其放置于37C

11、水浴小鋁鍋中，將PEG緩緩加到混合細(xì)胞上，邊加邊輕輕攪拌，持續(xù)90Sec后，將離心管插到離心管架上，移走小鋁鍋,從CO,培養(yǎng)箱取出溫育至37C的50niLRPMI-1640棊礎(chǔ)培養(yǎng)液，用吸管吸取10inL緩緩加到融合細(xì)胞上邊加邊輕輕攪拌（千丿j不能吹打），使細(xì)胞團(tuán)塊分散，先加1111L,再加2mL,再加3mL,放后加完剩下的4mL,加完第一個(gè)10mL后，接著沿管壁加完剩下的40mL,加完后，擰緊蓋，反復(fù)顛倒兒次，使細(xì)胞混勻。1500Wmim離心5min,棄上清，用巫懸有飼養(yǎng)細(xì)胞的72inL含1%HAT的RPMI-1640完全培養(yǎng)液將融合細(xì)胞亜懸。注：動(dòng)作要輕，將用吸管將細(xì)胞輕輕攪拌起來，不要吹

12、打。將重懸起來的細(xì)胞滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，2滴/孔，置CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)。融合后第4天即口J觀察到小集落；第7天補(bǔ)加含1%HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)液1滴/孔;第10天左右，集落長到占孔底1/4大小，培養(yǎng)液變黃，即可進(jìn)行抗體檢測。2.5陽性孔的篩選2.5.1集落孔的標(biāo)記融合后第7天，在倒置顯微鏡下對培養(yǎng)板進(jìn)行觀察，在有集落出現(xiàn)孔的培養(yǎng)板蓋上方用記號(hào)筆打上小點(diǎn)，標(biāo)明集落的位置，以便檢測時(shí)取樣以及原始孔的對號(hào)入座。2.5.2篩選采用間接ELISA方法對有雜交瘤細(xì)胞生長的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選。2.5.3雜交瘤細(xì)胞的克?。ㄓ邢尴♂尫ǎ┛寺〔捎糜邢尴♂尫ㄟM(jìn)行，具體過程如下：飼養(yǎng)細(xì)胞的制備：1只BALB/

13、C小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞和脾細(xì)胞口J鋪46塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放好只鋪4塊。鋪24孔板時(shí)，4滴/孔，所用飼養(yǎng)細(xì)胞量和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板相當(dāng)。于超凈工作臺(tái)內(nèi)取岀若干滅菌小青霉索瓶，兩個(gè)一組擺成兩列（每個(gè)待克隆孔需兩個(gè)小青霉索瓶），其中一列每瓶加3.8inL含0.5%HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，另一列每瓶加6.21I1L；取出若干滅菌1.5inL離心管，四個(gè)一列擺成若干列（每個(gè)待克隆孔用一列）。以后的克隆均使用不含HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。稀釋：用剪斷尖端的100pL槍頭在待克隆孔內(nèi)吹打數(shù)次使細(xì)胞重懸起來，用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞計(jì)數(shù)，用移液器取100pL加到第1個(gè)1.5inL離心管中。細(xì)胞

14、濃度=25個(gè)中方格的細(xì)胞總數(shù)xio個(gè)/毫升。細(xì)胞濃度一般在10數(shù)量級(jí)。在第1個(gè)1.5m（n3離心管內(nèi)將細(xì)胞稀釋成1x10個(gè)/毫升,再將細(xì)胞進(jìn)行10 x稀釋，直到細(xì)胞濃度為1x103個(gè)/毫升。將1x10個(gè)/毫升濃度的細(xì)胞取200pL加到裝有3.8inL培養(yǎng)液的小青霉索瓶中（細(xì)胞濃度為50個(gè)/毫升），混勻后，取0.7111L加到裝右6.2111L培養(yǎng)液的小青霉索瓶中（細(xì)胞濃度約為5個(gè)/毫升）。先將濃度約為5個(gè)/毫升的細(xì)胞加到鋪好飼養(yǎng)細(xì)胞96孔培養(yǎng)板的前8列，在將濃度約為50個(gè)/毫升的細(xì)胞加到同一塊96孔培養(yǎng)板的后4列，每孔1OOgLo加完置CO,培養(yǎng)箱培養(yǎng)。一般克隆后第4天即町見到小集落，第7天補(bǔ)

15、液，第9左右進(jìn)行抗體檢測，準(zhǔn)備進(jìn)行第2次克隆。克隆一般要進(jìn)行3次克隆，直到岀現(xiàn)集落孔的陽性率為100%。2.5.4小鼠腹水法生產(chǎn)單克隆抗體本實(shí)驗(yàn)室采用滅菌液體右蠟預(yù)處理BALB/C小鼠后，再注射雜交瘤細(xì)胞的方法生產(chǎn)腹水，其具體過程如下：BALB/c小鼠的預(yù)處理：用滅菌的液體和蠟處理小鼠，腹腔注射0.5mL/只，訃天后即可注射雜交瘤細(xì)胞。陽性孔的擴(kuò)大培養(yǎng)：在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入飼養(yǎng)細(xì)胞，4滴/孔，將96孔板內(nèi)的陽性細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。注射：待到細(xì)胞長滿孔底將24孔板的細(xì)胞1200r/min,離心5min,細(xì)胞6計(jì)數(shù)，用RPMI-1640礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋成15x10個(gè)/毫升，腹腔注射

16、小鼠0.5mL/只,8天左右觀察到小鼠腹部隆起，即町采集腹水。2.5.5細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇在雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后，應(yīng)該凍存一部分細(xì)胞。采集腹水后還應(yīng)該用淋巴細(xì)胞分離液將雜交瘤細(xì)胞分離出來再凍存一部分。細(xì)胞凍存兒個(gè)月后耍進(jìn)行復(fù)蘇，對細(xì)胞活力和分泌抗體的能力進(jìn)行檢測。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的具體方法如下：用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液將雜交瘤細(xì)胞重懸，1200i7min,離心5min,洗細(xì)胞兩次，棄上清，用細(xì)胞凍存液將細(xì)胞重懸，用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使細(xì)胞6濃度在15x10個(gè)/毫升范圍內(nèi)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入凍存管，每管1.5111L,放進(jìn)H制的雙層小紗布袋，6管/袋，先置液氮罐上氣相或26C冰箱30min

17、,再置液氮罐下氣相過夜，最后將小紗布袋浸入液氮中長期保存。細(xì)胞復(fù)蘇方法同1.2.2.5瘤細(xì)胞復(fù)蘇。對細(xì)胞活力和分泌抗體的能力進(jìn)行檢測。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的具體方法如下：用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液將雜交瘤細(xì)胞重懸，1200r/min,離心5min,洗細(xì)胞兩次，棄上清，用細(xì)胞凍存液將細(xì)胞車懸，用血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，使細(xì)胞6濃度在15x10個(gè)/毫升范圍內(nèi)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入凍存管，每管1.5mL,放進(jìn)口制的雙層小紗布袋，6管/袋，先置液氮罐上氣相或26C冰箱30min,再置液氮罐下氣相過夜，最后將小紗布袋浸入液氮中長期保存。細(xì)胞復(fù)蘇方法同122.5瘤細(xì)胞復(fù)蘇労單克隆抗體的鑒定3.1雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的

18、檢測在細(xì)胞傳代培養(yǎng)48h后加入秋水仙索，使其瑕終濃度達(dá)到0.04pgmL,繼續(xù)培養(yǎng)2.02.5ho終止培養(yǎng)后，將貼壁的細(xì)胞全部用吸管吹下，移入10mL的離心管，以1OOOr/niin離心lOmin,棄去上清液。加入37C預(yù)溫的0.075mol/L的KCL低滲溶液5.0mL,用吸管吹打均勻，置37C水浴15min20min。每管加入新鮮配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3：l）1.0inL混勻，以100017mm離心lOinin,去上清。再每管加固定液5.0111L,輕輕混勻，靜止30miiiJS,以1OOOr/min離心lOmin,棄上清。再次I占j定，加固定液5.0mL,輕輕混勻靜止30min,以

19、10001/min離心lOmiii,棄上清,用同樣方法加固定液5.0mL打勻，封上管口于4C靜止過夜。輕輕吸去上清液，留下0.5inL左右的上清液，混勻使細(xì)胞懸浮，用滴管吸取細(xì)胞懸液23滴，滴在已用冰水浸泡的潔凈的載玻片上，立即吹散，并在火焰上通過兒次，促使細(xì)胞平鋪于載玻片上，口然干燥。以10%Giemsa染液染色lOinin,洗去洗液口然干燥。最后于顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。3.2單克隆抗體亞型的鑒定釆用HBT公司的鼠源單抗亞類鑒定試劑盒（MouseMabisotypingKit）對單克隆抗體亞型進(jìn)行鑒定，操作過程如下：將試劑盒內(nèi)的緩沖液溫育到37C,加500pL緩沖液到裝有分型試紙卡（k輕鏈）的小

20、試管內(nèi)。加500yL樣品（培養(yǎng)上清或稀釋過的腹水，一般用PBS做1000倍稀釋）,輕輕晃動(dòng)小試管使試紙卡充分浸沒。搖動(dòng)裝右大鼠抗小鼠K輕鏈抗體一膠體結(jié)合物的試劑瓶（大瓶），混勻后，取ImL加到小試管，保持試紙卡有字一而朝下。在1825C晃動(dòng)小試管，直到兩個(gè)小點(diǎn)出現(xiàn)（車鏈同種型和K輕鏈）。在晃動(dòng)的過程中要始終保持試紙卡浸沒在溶液中，而且有字一而朝下。3.3單克隆抗體電泳鑒定將飽和硫酸錢粗提的單抗、葡聚糖凝膠G-200純化的單抗以及蛋白質(zhì)Marker用濃度為12%的分離膠進(jìn)行SDS,對單抗的蛋白質(zhì)本質(zhì)加以鑒定，并驗(yàn)證G-200純化效果。單克隆抗體的純化4.1硫酸錢鹽析法純化單克隆抗體（少最提?。└?/p>

21、水的預(yù)處理（二氧化硅吸附法）：取一定量的腹水，加等體積的巴比妥緩沖液,加適量二氧化硅粉末，室溫下，攪拌30min,然后1800i7min,清的腹水。用50%的飽和硫酸錢（按最終飽和度算）粗提一次，33%的飽和硫酸錢粗提兩次,用1/2腹水體積的PBS將單抗溶解，裝入透析袋，用PES透析兩天，用小青霉索瓶分裝，每瓶2mL,凍干，于26C保存。使用時(shí)用2mL蒸館水溶解。葡聚糖凝膠G-200純化單抗：將葡聚糖凝膠G-200用PES于4C浸泡三天，裝柱，將粗提的單抗取lmL上樣，用PES洗脫，20%磺基水楊酸檢測，出現(xiàn)白色渾濁后開始收集，渾濁度較低時(shí)停止收集。用小青霉索瓶分裝成每瓶2mL,凍十，于26C

22、保存。4.2辛酸-硫酸錢鹽析法純化單克隆抗體（大量提?。┬了崃蛩岚胞}析法是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)的方法，辛酸在偏酸條件下能將血清中除IgG外的蛋白質(zhì)都沉淀下來，上清中只有IgGo辛酸加入量因抗體的來源不同而不同，人血清為70|.d/mL,兔血清中為75gl/mL,小鼠血清為4Opl/mL,小鼠腹水為33pl/mL。這種方法IgG的回收率可達(dá)90%,具體操作如下：向一份預(yù)處理過的腹水中加入2份0.06mol/mL、pH5.0的乙酸緩沖液，用O.lmol/niL的HC1調(diào)pH至4.5。于室溫?cái)嚢柘略?0min內(nèi)逐滴緩慢加入辛酸，按每毫升稀釋前的腹水加33pL,4C靜置2h,15OOOr/niiii離心30min

23、,棄沉淀。上清經(jīng)砂芯漏斗或125pm的尼龍網(wǎng)過濾，加入1/10體積的0.1mol/LPB（pH7.4）、8.5%NaCl（用lmol/L的NaOH調(diào)pH至7.4）。在4C冰浴下于30min內(nèi)加入0.277助血的硫酸鞍，使成45%飽和度，靜置lh以上。4C下12000r/min離心30min,棄上清。沉淀溶于適量137mmol/LNaCl、2.6imnol/LKC1、0.2minol/LEDTA的PBS（pH7.4）中,對50100倍的上述PES于4C透析過夜。4C下12000r/min離心30min,除去不溶性沉渣。該法主要用于IgG2b和IgGl的純化，對IgA和IgG3的回收率及純化效果都較差。辛酸硫酸錢鹽析法純化單克隆抗體可獲得95%的純度，其中鼠IgG純度達(dá)98%以上。附錄：所用試劑及溶液:細(xì)胞培養(yǎng)溶液雙抗：取青霉索G鈉100丿j單位和硫酸慶大霉索lg溶于lOOmL三蒸水，過濾除菌后分裝小青霉索瓶，于26C保存。基礎(chǔ)培養(yǎng)液：RPMI-1640粉劑一袋，補(bǔ)加2.0g碳酸氫鈉（NaHCOp,于