單抗的制備方法(實驗室Protocol)

1、單抗的制備方法免疫BALB/C小鼠的免疫BALB/C小鼠的免疫按常規(guī)方法進行，二免后一個星期分別用斷尾抽真空法采血200PL進行抗體檢測，二免采血后讓小鼠休息兩周進行加強免疫，三天后融合。表1BALB/c小鼠的免疫方案（供參考免疫次數時間免疫劑量（pg/mL）免疫方法佐劑首免0d100頸背部皮F弗氏完全佐劑二免21d100腹腔注射兆氏不完全佐加強42d（融合前三200腹腔注射劑天）不加佐劑BALB/c小鼠的抗體檢測2.1BALB/c小鼠血清的制備將采集的全血樣品于37C溫箱放置30min后，4C放置半天，待血清析出后，4500i7min,離心lOinin,用移液器吸岀血清，4C放置待檢。2.2

2、間接ELISA法的建立BALB/c小鼠免疫后，用間接ELISA法対其血清抗體水平進行檢測，間接ELISA法步驟如下：包被：4C包被過夜。洗板：棄去包被液，拍干，向酶標板內加入洗滌液，每孔200j.iL,35min后倒掉洗滌液，再拍干。如此重復三次。加待檢血清：將血清用ELISA洗滌液從1：10000開始進行倍比稀釋（即1：10000、20000、40000、80000、160000、320000、640000、1280000）,共8個濃度。將稀釋好的血清按濃度宙低至高的順序加入酶標板內，每孔lOOpL,每只小鼠的血清做兩列，在37C溫箱內孵育30min。同時設陰性血清対照。洗板：同上。加HRP

3、標二抗：工作濃度1：10000,每孔100j.iL,在37C溫箱內孵育30min后，洗板三次。顯色：加底物（TMB-iS氧化MK）,每孔lOOpL,37C溫箱放置10min,加2mol/LH.SO,終止顯色反應，每孔50pL,用酶標儀測定OD值。24450結果判定：P.2,判為陽性（P、N分別為待檢和陰性血清的OD值）。4502.3SP2/0骨髓瘤的復蘇當血清效價高于1：10000時，開始復蘇瘤細胞并注射一只BALB/C小鼠，過程如下：將裝右SP2/0骨髓瘤細胞的紗布袋從液氮罐中取出，用止血鉗夾出一管，將紗布袋放回液氮罐，用止血鉗夾著裝有SP2/0骨髓瘤細胞的凍存管在37C水浴中轉動，肖到細胞

4、解凍，用RPMI-1640基礎培養(yǎng)液10mL,1200i7min,5min,洗細胞兩次，用8mL完全培養(yǎng)液將細胞巫懸后加入培養(yǎng)瓶中，在CO,恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待SP2/0骨尚瘤2細胞長滿瓶底（培養(yǎng)3天左右），將細胞吹洗下來，離心去上清，用lmL上清將細胞重懸，取0.5mL注射到BALB/c小鼠頸背部皮下，一周后開始觀察注射部位是否有瘤子長出。待到瘤子長到金豆大小時（9天左右），對BALE/c小鼠進行加強免疫，三天后做融合。2.4細胞融合與培養(yǎng)2.4.1細胞融合器材與試劑的準備小剪刀、小毀子（各10套）：用酒精棉球擦過后，晾于，裝入小鋁盒滅菌；玻璃勻漿器（至少三套）：檢查是否破損、配套，裝盒滅菌

5、；玻璃吸管10mL、5mL（用定制的鋁盒盛裝，至少各一盒，約40支），lmL（l支）用報紙卷好滅菌；linL注射器（1支，用報紙包好）和7號針頭（用小鋁盒裝）滅菌，抽取HAT用；50mL離心管：4支，裝少量三蒸水，包上報紙，用橡皮筋扎好，再把蓋擰松,裝入500niL燒杯，用紗布蓋口，滅菌；吸水紙：剪成10cm見方的小塊（若干張），用報紙包好，滅菌，細胞融合時控干水滴用；無菌96孔板四塊；血球記數板1塊；lOOinL葡萄糖瓶（2個）滅菌，一個用來裝飼養(yǎng)細胞，另一個用來裝501HLRPMI-1640基礎培養(yǎng)液并提前溫育到37C；泡沫板一塊：15cmx25cm,解剖小鼠用；RPMI-1640基礎培養(yǎng)

6、液1瓶；RPMI-1640培養(yǎng)完全液1瓶;HAT（lOOx）；50%PEG-1450用凍存管分裝成每管0.83111L后，4C保存，融合當天取一管置COJH溫2培養(yǎng)箱內溫育至37C,備用。2.4.2飼養(yǎng)細胞的制備在制備飼養(yǎng)細胞時，本實驗室采用BALB/c小鼠的腹腔巨噬細胞和脾細胞的混合細胞作為飼養(yǎng)細胞，其制備步驟如下：脫頸椎處死空白BALB/c小鼠1只，用75%的酒精浸泡5mino于超凈工作臺內，將小鼠腹部朝上，用針頭將4個腳學固定在墊有滅菌報紙的泡沫板上。用止血鉗（酒精燈火焰燒過）從鋁盒中夾出一套小剪刀和小銀子，用小錢子夾緊小鼠下腹部皮膚并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，將剪刀尖從小

7、口伸進去，打開剪刀將小口向兩邊撐開并向下按住小鼠的兩后肢，將小銀子從撐開的小口伸進去，夾緊并掛住剪開的皮膚向前撕扯，直到胸腹部完全暴露出來。換一套小剪刀和銀子，用小銀子在小鼠腹中部捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一3mm左右的小口，將小銀子擱在腹膜上，小剪刀擱在小鋁盒蓋沿備用。用5mL吸管吸取2.5inLRPMI-1640礎培養(yǎng)液，小鍛子提起腹膜，吸管尖從剪開的小口伸進去，將培養(yǎng)液注入小鼠的腹腔，吹吸數次后，將培養(yǎng)液吸出轉移到50mL離心管中，如此重復一次。將小鼠兩后肢交叉固定（左后肢在上以便于脾臟的暴露），用小鐵子在遠離脾臟的部位捏住腹膜并向上提起，用小剪刀在提起部位后剪一小口，將

8、剪刀尖從小口伸進去,三天后做融合。2.4.3SP2/0骨髓瘤細胞的制備本實驗室將BALB/C小鼠體內生長的SP2/0骨髓瘤勻漿后制備SP2/0骨髓瘤細胞，然后再用于融合，其制備步驟如下：將背部皮下長出骨髓瘤的BALB/c小鼠脫頸椎處死，用75%的酒精辱盜mA、在一支滅菌50mL離心管中事先加入15mL淋巴細胞分離液。背部朝上固電小鼠，參照飼養(yǎng)細胞的制備方法，分離骨髓瘤（只要蠶豆大小的一塊瘤子即夠做一姻合少勻漿制備骨髓瘤細胞。取15mL骨髓瘤細胞懸液輕輕加到淋巴細胞分離液湖玄注意：要保證兩種液體呈分層狀態(tài)，千力不能將液體混勻。1700r/inin,水平離心10min后，取出離心管可見，在骨髓瘤細

9、胞懸液和淋巴細胞分離液的交界處仃一層白色的細胞，這就是骨髓瘤細胞，用10mL吸管吸走上層細胞懸液后，將中層的骨髓瘤細胞懸液轉移到另一支滅菌50mL離心管中，用15mLRPMI-1640ffi礎培養(yǎng)液，1200r/miii,5min洗細胞兩次。用10mLRPMI1640煎礎培養(yǎng)液巫懸骨髓瘤細胞，用4血球計數板計數。骨髓瘤細胞濃度=（四角+中央中方格的細胞數）x5xl0個/毫升2.4.4免疫睥細胞的制備將免疫小鼠的脾細胞分離出來并勻漿制備免疫睥細胞，其方法同2.2.2.6.2飼養(yǎng)細胞制備時脾細胞的制備，只是免疫過的脾臟被大量結締組織包裹分離起來比正常脾臟困難一些，如果不能完整的分離，可以分小塊分離

10、。2.4.5免疫脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合本實驗室用分子量為1450的50%PEG作融合劑進行細胞融合，細胞融合按常規(guī)方法進行，其操作步驟如下：7取1x10個SP2/0骨髓瘤細胞與免疫睥細胞混合，用15mLRPMI-1640基礎培養(yǎng)液巫懸，1500r/min,5min洗細胞兩次。于超凈工作臺內取出滅菌的吸水紙，將裝有骨髓瘤細胞與免疫睥細胞混合細胞的50mL離心管上清倒盡后，倒扣在吸水紙上控干水滴。用小鋁鍋裝2/3容積的水，于電爐上加熱到37C后放進超凈工作臺；從CO,培養(yǎng)箱取出溫育至37C的50%PEG,用1mL的吸管吸取0.8inL,手持裝有混合細胞的50mL離心管，將其放置于37C

11、水浴小鋁鍋中，將PEG緩緩加到混合細胞上，邊加邊輕輕攪拌，持續(xù)90Sec后，將離心管插到離心管架上，移走小鋁鍋,從CO,培養(yǎng)箱取出溫育至37C的50niLRPMI-1640棊礎培養(yǎng)液，用吸管吸取10inL緩緩加到融合細胞上邊加邊輕輕攪拌（千丿j不能吹打），使細胞團塊分散，先加1111L,再加2mL,再加3mL,放后加完剩下的4mL,加完第一個10mL后，接著沿管壁加完剩下的40mL,加完后，擰緊蓋，反復顛倒兒次，使細胞混勻。1500Wmim離心5min,棄上清，用巫懸有飼養(yǎng)細胞的72inL含1%HAT的RPMI-1640完全培養(yǎng)液將融合細胞亜懸。注：動作要輕，將用吸管將細胞輕輕攪拌起來，不要吹

12、打。將重懸起來的細胞滴加到96孔細胞培養(yǎng)板內，2滴/孔，置CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)。融合后第4天即口J觀察到小集落；第7天補加含1%HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)液1滴/孔;第10天左右，集落長到占孔底1/4大小，培養(yǎng)液變黃，即可進行抗體檢測。2.5陽性孔的篩選2.5.1集落孔的標記融合后第7天，在倒置顯微鏡下對培養(yǎng)板進行觀察，在有集落出現孔的培養(yǎng)板蓋上方用記號筆打上小點，標明集落的位置，以便檢測時取樣以及原始孔的對號入座。2.5.2篩選采用間接ELISA方法對有雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)孔進行篩選。2.5.3雜交瘤細胞的克?。ㄓ邢尴♂尫ǎ┛寺〔捎糜邢尴♂尫ㄟM行，具體過程如下：飼養(yǎng)細胞的制備：1只BALB/

13、C小鼠的腹腔巨噬細胞和脾細胞口J鋪46塊96孔細胞培養(yǎng)板，放好只鋪4塊。鋪24孔板時，4滴/孔，所用飼養(yǎng)細胞量和96孔細胞培養(yǎng)板相當。于超凈工作臺內取岀若干滅菌小青霉索瓶，兩個一組擺成兩列（每個待克隆孔需兩個小青霉索瓶），其中一列每瓶加3.8inL含0.5%HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，另一列每瓶加6.21I1L；取出若干滅菌1.5inL離心管，四個一列擺成若干列（每個待克隆孔用一列）。以后的克隆均使用不含HT的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。稀釋：用剪斷尖端的100pL槍頭在待克隆孔內吹打數次使細胞重懸起來，用血球計數板對細胞計數，用移液器取100pL加到第1個1.5inL離心管中。細胞

14、濃度=25個中方格的細胞總數xio個/毫升。細胞濃度一般在10數量級。在第1個1.5m（n3離心管內將細胞稀釋成1x10個/毫升,再將細胞進行10 x稀釋，直到細胞濃度為1x103個/毫升。將1x10個/毫升濃度的細胞取200pL加到裝有3.8inL培養(yǎng)液的小青霉索瓶中（細胞濃度為50個/毫升），混勻后，取0.7111L加到裝右6.2111L培養(yǎng)液的小青霉索瓶中（細胞濃度約為5個/毫升）。先將濃度約為5個/毫升的細胞加到鋪好飼養(yǎng)細胞96孔培養(yǎng)板的前8列，在將濃度約為50個/毫升的細胞加到同一塊96孔培養(yǎng)板的后4列，每孔1OOgLo加完置CO,培養(yǎng)箱培養(yǎng)。一般克隆后第4天即町見到小集落，第7天補

15、液，第9左右進行抗體檢測，準備進行第2次克隆?？寺∫话阋M行3次克隆，直到岀現集落孔的陽性率為100%。2.5.4小鼠腹水法生產單克隆抗體本實驗室采用滅菌液體右蠟預處理BALB/C小鼠后，再注射雜交瘤細胞的方法生產腹水，其具體過程如下：BALB/c小鼠的預處理：用滅菌的液體和蠟處理小鼠，腹腔注射0.5mL/只，訃天后即可注射雜交瘤細胞。陽性孔的擴大培養(yǎng)：在24孔細胞培養(yǎng)板加入飼養(yǎng)細胞，4滴/孔，將96孔板內的陽性細胞轉到24孔細胞培養(yǎng)板進行擴大培養(yǎng)。注射：待到細胞長滿孔底將24孔板的細胞1200r/min,離心5min,細胞6計數，用RPMI-1640礎培養(yǎng)液稀釋成15x10個/毫升，腹腔注射

16、小鼠0.5mL/只,8天左右觀察到小鼠腹部隆起，即町采集腹水。2.5.5細胞的凍存與復蘇在雜交瘤細胞進行擴大培養(yǎng)后，應該凍存一部分細胞。采集腹水后還應該用淋巴細胞分離液將雜交瘤細胞分離出來再凍存一部分。細胞凍存兒個月后耍進行復蘇，對細胞活力和分泌抗體的能力進行檢測。細胞凍存和復蘇的具體方法如下：用RPMI-1640基礎培養(yǎng)液將雜交瘤細胞重懸，1200i7min,離心5min,洗細胞兩次，棄上清，用細胞凍存液將細胞重懸，用血球計數板對細胞進行計數，使細胞6濃度在15x10個/毫升范圍內，將細胞轉入凍存管，每管1.5111L,放進H制的雙層小紗布袋，6管/袋，先置液氮罐上氣相或26C冰箱30min

17、,再置液氮罐下氣相過夜，最后將小紗布袋浸入液氮中長期保存。細胞復蘇方法同1.2.2.5瘤細胞復蘇。對細胞活力和分泌抗體的能力進行檢測。細胞凍存和復蘇的具體方法如下：用RPMI-1640基礎培養(yǎng)液將雜交瘤細胞重懸，1200r/min,離心5min,洗細胞兩次，棄上清，用細胞凍存液將細胞車懸，用血球計數板對細胞進行計數，使細胞6濃度在15x10個/毫升范圍內，將細胞轉入凍存管，每管1.5mL,放進口制的雙層小紗布袋，6管/袋，先置液氮罐上氣相或26C冰箱30min,再置液氮罐下氣相過夜，最后將小紗布袋浸入液氮中長期保存。細胞復蘇方法同122.5瘤細胞復蘇労單克隆抗體的鑒定3.1雜交瘤細胞染色體數的

18、檢測在細胞傳代培養(yǎng)48h后加入秋水仙索，使其瑕終濃度達到0.04pgmL,繼續(xù)培養(yǎng)2.02.5ho終止培養(yǎng)后，將貼壁的細胞全部用吸管吹下，移入10mL的離心管，以1OOOr/niin離心lOmin,棄去上清液。加入37C預溫的0.075mol/L的KCL低滲溶液5.0mL,用吸管吹打均勻，置37C水浴15min20min。每管加入新鮮配制的固定液（甲醇：冰乙酸=3：l）1.0inL混勻，以100017mm離心lOinin,去上清。再每管加固定液5.0111L,輕輕混勻，靜止30miiiJS,以1OOOr/min離心lOmin,棄上清。再次I占j定，加固定液5.0mL,輕輕混勻靜止30min,以

19、10001/min離心lOmiii,棄上清,用同樣方法加固定液5.0mL打勻，封上管口于4C靜止過夜。輕輕吸去上清液，留下0.5inL左右的上清液，混勻使細胞懸浮，用滴管吸取細胞懸液23滴，滴在已用冰水浸泡的潔凈的載玻片上，立即吹散，并在火焰上通過兒次，促使細胞平鋪于載玻片上，口然干燥。以10%Giemsa染液染色lOinin,洗去洗液口然干燥。最后于顯微鏡下觀察計數。3.2單克隆抗體亞型的鑒定釆用HBT公司的鼠源單抗亞類鑒定試劑盒（MouseMabisotypingKit）對單克隆抗體亞型進行鑒定，操作過程如下：將試劑盒內的緩沖液溫育到37C,加500pL緩沖液到裝有分型試紙卡（k輕鏈）的小

20、試管內。加500yL樣品（培養(yǎng)上清或稀釋過的腹水，一般用PBS做1000倍稀釋）,輕輕晃動小試管使試紙卡充分浸沒。搖動裝右大鼠抗小鼠K輕鏈抗體一膠體結合物的試劑瓶（大瓶），混勻后，取ImL加到小試管，保持試紙卡有字一而朝下。在1825C晃動小試管，直到兩個小點出現（車鏈同種型和K輕鏈）。在晃動的過程中要始終保持試紙卡浸沒在溶液中，而且有字一而朝下。3.3單克隆抗體電泳鑒定將飽和硫酸錢粗提的單抗、葡聚糖凝膠G-200純化的單抗以及蛋白質Marker用濃度為12%的分離膠進行SDS,對單抗的蛋白質本質加以鑒定，并驗證G-200純化效果。單克隆抗體的純化4.1硫酸錢鹽析法純化單克隆抗體（少最提?。└?/p>

21、水的預處理（二氧化硅吸附法）：取一定量的腹水，加等體積的巴比妥緩沖液,加適量二氧化硅粉末，室溫下，攪拌30min,然后1800i7min,清的腹水。用50%的飽和硫酸錢（按最終飽和度算）粗提一次，33%的飽和硫酸錢粗提兩次,用1/2腹水體積的PBS將單抗溶解，裝入透析袋，用PES透析兩天，用小青霉索瓶分裝，每瓶2mL,凍干，于26C保存。使用時用2mL蒸館水溶解。葡聚糖凝膠G-200純化單抗：將葡聚糖凝膠G-200用PES于4C浸泡三天，裝柱，將粗提的單抗取lmL上樣，用PES洗脫，20%磺基水楊酸檢測，出現白色渾濁后開始收集，渾濁度較低時停止收集。用小青霉索瓶分裝成每瓶2mL,凍十，于26C

22、保存。4.2辛酸-硫酸錢鹽析法純化單克隆抗體（大量提?。┬了崃蛩岚胞}析法是一個經驗的方法，辛酸在偏酸條件下能將血清中除IgG外的蛋白質都沉淀下來，上清中只有IgGo辛酸加入量因抗體的來源不同而不同，人血清為70|.d/mL,兔血清中為75gl/mL,小鼠血清為4Opl/mL,小鼠腹水為33pl/mL。這種方法IgG的回收率可達90%,具體操作如下：向一份預處理過的腹水中加入2份0.06mol/mL、pH5.0的乙酸緩沖液，用O.lmol/niL的HC1調pH至4.5。于室溫攪拌下在30min內逐滴緩慢加入辛酸，按每毫升稀釋前的腹水加33pL,4C靜置2h,15OOOr/niiii離心30min

23、,棄沉淀。上清經砂芯漏斗或125pm的尼龍網過濾，加入1/10體積的0.1mol/LPB（pH7.4）、8.5%NaCl（用lmol/L的NaOH調pH至7.4）。在4C冰浴下于30min內加入0.277助血的硫酸鞍，使成45%飽和度，靜置lh以上。4C下12000r/min離心30min,棄上清。沉淀溶于適量137mmol/LNaCl、2.6imnol/LKC1、0.2minol/LEDTA的PBS（pH7.4）中,對50100倍的上述PES于4C透析過夜。4C下12000r/min離心30min,除去不溶性沉渣。該法主要用于IgG2b和IgGl的純化，對IgA和IgG3的回收率及純化效果都較差。辛酸硫酸錢鹽析法純化單克隆抗體可獲得95%的純度，其中鼠IgG純度達98%以上。附錄：所用試劑及溶液:細胞培養(yǎng)溶液雙抗：取青霉索G鈉100丿j單位和硫酸慶大霉索lg溶于lOOmL三蒸水，過濾除菌后分裝小青霉索瓶，于26C保存?；A培養(yǎng)液：RPMI-1640粉劑一袋，補加2.0g碳酸氫鈉（NaHCOp,于