雙歧桿菌DNA對小鼠巨噬細胞中PKC和NF

1、雙歧桿菌DNA對小鼠巨噬細胞中PKC和NF王立生李迎雪朱惠明,朱忠生馬曉冬【關(guān)鍵詞】雙歧桿菌DNA;,巨噬細胞;,蛋白激酶;,核因子InfluenefbifidbateriuDNAnPKandNFBinurinearphagesAbstratAI:TexplretheinfluenefDNAfbifidbateriuaadlesenenPKandNKBfurinearphages.ETHDS:ThefluresentintensityfPK、PKI、PKII、PK、PKandPKinurineperitnealarphagesasdetetedbyusinglasernfalirspe.The

2、densityfNKB+arphagesasdetetedbyiunytheialstaining.RESULTS:TheaveragefluresentintensityfPKandPKIIprduedbyuseperitnealarphagesinbifidbateriuDNAinjetingrupasarkedlyhigherthanthatinntrlgrupP0.01.ThereasnstatistiallysignifiantdifferenefaveragefluresentintensityfPKI、PK、PKandPKbeteenthetgrupsP0.05.Thedensi

3、tyfNKB+arphagesinbifidbateriuDNAinjetingrupasarkedlyhigherthanthatinntrlgrupP0.01.NLUSIN:DNAfbifidbateriaadleseneuldativatearphagesbyprtingtheativityfPK、PKIIandNFB.KeyrdsbifidbateriuDNA;arphage;prtEinkinase;nulearfatrB摘要目的:討論青春型雙歧桿菌的DNA對巨噬細胞中6種PK和NFB的影響。方法:通過激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠腹腔巨噬細胞中PK、PKI、PKII、PK、PK和PK的熒

4、光強度,以免疫細胞化學(xué)染色法檢測巨噬細胞中NFB+細胞的密度。結(jié)果:雙歧桿菌DNA注射組小鼠腹腔巨噬細胞中,PK和PKII的平均熒光強度明顯高于對照組P0.01;而PKI、PK、PK和PK的平均熒光強度在兩組間那么無統(tǒng)計學(xué)意義P0.05。雙歧桿菌DNA注射組巨噬細胞中,NFB+細胞的密度顯著高于對照組P0.01。結(jié)論:青春型雙歧桿菌的DNA可通過活化PK、PKII和NFB來激活巨噬細胞。關(guān)鍵詞雙歧桿菌DNA;巨噬細胞;蛋白激酶;核因子B雙歧桿菌是人體和動物腸道內(nèi)數(shù)量最多的生理性厭氧菌,能調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡,也有抗腫瘤、抗感染和免疫激活等多種重要的功能1。目前研究發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌的DNA中含有非

5、甲基化的胞嘧啶磷酸鳥嘌呤基序(ytidinephsphateguansine,pGDNA),可作為免疫刺激序列(iunstiulatrysequene)激活樹突狀細胞(D),上調(diào)其外表分子和共刺激分子(如D69、HI、HII類分子、D80以及D86等)的表達。同時,其還能激活NK細胞和B細胞,使之產(chǎn)生較多量的IFN和抗體2。此外,其亦可激活巨噬細胞,增強其吞噬和細胞毒作用,并分泌較多量的IL1及IL6,但其詳細的作用機制目前仍不清楚3。本研究中應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡和免疫細胞化學(xué)染色法,檢測了青春型雙歧桿菌的DNA對小鼠腹腔巨噬細胞中PK和NFB的影響,旨在討論其激活巨噬細胞的信號途徑。1材料和

6、方法1.1材料BALB/小鼠,68周齡,雌雄各半,體質(zhì)量為1823g,購于南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。兔抗鼠PK、PKI、PKII、PK、PK和PK,購自NeEnglandBilab公司。FIT標(biāo)記的羊抗兔IgG、兔抗p65抗體和生物素化的羊抗兔IgG,均購自北京中山生物技術(shù)。溶菌酶和LPS為Siga公司產(chǎn)品。其他生化試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1菌種來源及其培養(yǎng)雙歧桿菌由本室從安康嬰兒糞便中別離培養(yǎng)獲得,經(jīng)API20A及TAB系統(tǒng)和屢次生化反響鑒定為青春型。實驗時,將雙歧桿菌接種至硫乙醇酸鹽肉湯中,置厭氧培養(yǎng)箱,于37培養(yǎng)72h。將含菌培養(yǎng)液以3000r/in離心10in,去上

7、清,沉渣以PBS液洗3次,并調(diào)整細菌數(shù)為11013/L。1.2.2雙歧桿菌DNA的制備和鑒定將雙歧桿菌接種于硫乙醇酸鹽肉湯中,置厭氧培養(yǎng)箱中于37培養(yǎng)72h。搜集細菌,參加溶菌酶1g/L與SDS終濃度為10g/L裂解菌體后,用飽和酚抽提去除菌體蛋白并透析。用紫外分光光度計測定所提取的雙歧桿菌基因組DNA的A260/A280為1.976。測定DNA的濃度后,經(jīng)薄板層析證實,所制備的雙歧桿菌DNA中無脂多糖存在,冷凍枯燥后備用4。1.2.3實驗分組及雙歧桿菌DNA的處理實驗動物分為兩組,即(1)雙歧桿菌DNA注射組:20只小鼠,于實驗的第1天向小鼠腹腔注射100g/L硫乙醇酸鹽肉湯2L,第2天起腹

8、腔注射雙歧桿菌DNA0.2g,每天1次,連續(xù)5d。(2)對照組:動物的數(shù)量及第1天的處理措施均同雙歧桿菌DNA注射組,不同之處為第2天起向其腹腔注射PBS液0.2L,每天1次,連續(xù)5d。1.2.4巨噬細胞的搜集及培養(yǎng)于實驗的第7天,常規(guī)消毒小鼠腹部的皮膚,以冷的Hanks液灌洗腹腔。洗出液以1000r/in離心10in,去上清,沉渣以無血清的RPI1640培養(yǎng)液重懸2次,并調(diào)整細胞數(shù)為1109/L。汲取100L細胞懸液加至孔底鋪有蓋玻片的24孔細胞培養(yǎng)板中,置37、50L/L2孵箱中培養(yǎng)2h。棄去未貼壁的細胞,即得巨噬細胞。再參加含100L/L小牛血清的RPI1640培養(yǎng)液及LPS(終濃度為1

9、0g/L),500L/孔,繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)24h。1.2.5巨噬細胞PK含量的檢測通過激光共聚焦顯微鏡觀察PK的熒光強度反映PK的含量。詳細操作步驟為:傾去培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液,取出爬有巨噬細胞的蓋玻片,滴加3L/LH22甲醇封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性;以0.01l/LPBS(pH7.2)液洗滌3次5in;滴加100g/L非特異性牛血清白蛋白,室溫孵育10in;以0.01l/LPBS(pH7.2)液洗滌3次5in;分別滴加兔抗鼠PK、抗PKI、抗PKII、抗PK、抗PK和抗PK抗體各100L,工作濃度均為1200,于37溫育60in;以0.01l/LPBS(pH7.2)液洗滌3次5in;滴加1100FI

10、T標(biāo)記的羊抗兔IgG100L,于37溫育30in;以0.01l/LPBS(pH7.2)液充分洗滌5次5in;用激光共聚焦顯微鏡逐個觀察巨噬細胞中的熒光強度。所用激發(fā)波長為488n,發(fā)射波長為475n,每孔于不同視野計數(shù)100個細胞以上,取其平均熒光值作為定量參數(shù)。1.2.6NFB的免疫細胞化學(xué)染色取出細胞培養(yǎng)板孔內(nèi)爬有巨噬細胞的蓋玻片,以0.01l/LPBS(pH7.2)液洗滌3次,枯燥。染色程序按免疫細胞化學(xué)SP法常規(guī)進展。一抗為兔抗p65抗體,二抗為生物素化的羊抗兔IgG。以PBS代替一抗作為陰性對照。1.2.7觀察指標(biāo)及統(tǒng)計學(xué)處理對每張蓋玻片以16D目鏡測微網(wǎng)在400倍放大下計數(shù)網(wǎng)格中細

11、胞核著色的陽性細胞數(shù),每例計數(shù)10個網(wǎng)格,取其均值作為該樣本中NFB+細胞的密度,以t檢驗行統(tǒng)計學(xué)處理。其余各組間的比擬也采用t檢驗。2結(jié)果2.1巨噬細胞中6種PK含量的檢測以激光共聚焦顯微鏡觀測巨噬細胞中PK、PKI、PKII、PK、PK和PK的熒光強度。結(jié)果顯示,小鼠腹腔巨噬細胞被青春型雙歧桿菌的DNA刺激后,其PK和PKII的熒光強度明顯高于對照組P0.01;而PKI、PK、PK及PK的熒光強度在兩組間無統(tǒng)計學(xué)意義P0.05,表1、圖1。表1巨噬細胞中PK、PKI、PKII、PK、PK及PK含量的檢測略圖1小鼠腹腔巨噬細胞中PK表達的激光掃描共聚焦顯微鏡觀測略2.2雙歧桿菌DNA對巨噬細

12、胞中NFB表達的影響NFB主要是由p50和p65組成的異源二聚體。實驗用兔抗p65抗體作為免疫細胞化學(xué)染色中的一抗,其結(jié)果即可反映NFB的存在。實驗結(jié)果中,NFB陽性產(chǎn)物表現(xiàn)為黃褐色顆粒狀物。雙歧桿菌的DNA注射組巨噬細胞中,NFB陽性產(chǎn)物存在于胞漿和胞核,但以胞核為主,其胞核上NFB陽性產(chǎn)物的密度為175631020個;對照組巨噬細胞中NFB的陽性產(chǎn)物主要位于胞漿,其胞核上NFB陽性產(chǎn)物的密度為8398764個,兩組比擬差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P001)。3討論PK是構(gòu)造相近、依賴鈣、磷脂和二酰基甘油激活的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的多基因超家族,對細胞生長和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)起重要作用。目前已說明,很多巨

13、噬細胞的激活劑均能使其胞內(nèi)PK的濃度上升。Lin等5證實,UTP可激活小鼠RA264.7巨噬細胞,進步磷脂酶A2及花生四烯酸的程度依賴的磷酯酰膽堿磷脂酶PIPL的活化以及胞內(nèi)a2+i濃度的升高,并證實PK的激活亦參與了這一過程。Kuar等6報道,催乳素能激活小鼠腹腔巨噬細胞,使之分泌大量的IL1和N,其機制主要是激活PK。Shishdia和U等7,8那么分別報道,順鉑和II型肺炎鏈球菌細胞壁多糖能激活巨噬細胞,產(chǎn)生多量的TNF,這一過程需要PK的活化。本研究說明,雙歧桿菌DNA注射組巨噬細胞中PK和PKII的熒光強度明顯高于對照組;而PKI、PK、PK及PK的熒光強度在兩組間無統(tǒng)計學(xué)意義,提示

14、青春型雙歧桿菌的DNA能活化巨噬細胞中的PK和PKII;而對PKI、PK、PK和PK的活性無明顯影響。靜息狀態(tài)下,NFB的同源或異源二聚體與抑制性蛋白IB結(jié)合而存在于胞質(zhì)中。當(dāng)細胞受到外界刺激時,可通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活I(lǐng)B激酶IKK,導(dǎo)致IB發(fā)生磷酸并被降解,于是NFB釋放出來并被激活,接著發(fā)生核易位,和靶基因的特定位點相結(jié)合,從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。NFB的活化是巨噬細胞的激活機制之一。vnKnethen等9發(fā)現(xiàn),亞致死量的H22能活化小鼠RA264.7巨噬細胞中的NFB,進而增強環(huán)氧合酶2的表達。Darieva等10證實,BG能激活小鼠J774巨噬細胞,使之分泌多量的IL6、N和TNF等具有殺瘤

15、活性的效應(yīng)分子,其機制主要是增強NFBDNA的結(jié)合。Liu等11報道,乳酸桿菌細胞壁中的肽聚糖peptidglyan,PG可作用于小鼠RA264.7巨噬細胞的Tlllike受體2(Tlllikereeptr2,TLR2),進而激活NFB,最終增強其細胞毒活性。andrika等12也發(fā)現(xiàn),具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的黑色素細胞刺激激素(alphaelanytestiulatinghrne,SH)能促使巨噬細胞中的NFB核轉(zhuǎn)位,進而上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶RNA的表達,最終催化底物精氨酸產(chǎn)生多量的N。李義軍等13那么證實,細菌內(nèi)毒素能明顯進步小鼠腹腔巨噬細胞NFB的活性。本研究說明,雙歧桿菌DNA注射組

16、巨噬細胞細胞核表達NFB+細胞的密度顯著高于對照組,提示青春型雙歧桿菌的DNA能有效地促進巨噬細胞中NFB的轉(zhuǎn)位和活化。雙歧桿菌的DNA能激活機體免疫系統(tǒng)中的巨噬細胞。宋文剛等14報道,嬰兒型雙歧桿菌的DNA能活化巨噬細胞,增強其吞噬功能,并使之分泌多量的IL1和TNF。Staey等15證實,分叉雙歧桿菌的DNA能刺激巨噬細胞釋放多量的IL6和IL12。目前認為,細菌DNA激活巨噬細胞的途徑主要為刺激性pGDNA與巨噬細胞Tll樣受體9(Tlllikereeptr9,TLR9)的結(jié)合,接著誘導(dǎo)細胞內(nèi)產(chǎn)生多量的活性氧(RS)。RS作為第二信使,進一步可活化APK和AP1等信號分子,最終調(diào)節(jié)相關(guān)基

17、因的表達16。結(jié)合本研究的結(jié)果,我們認為,活化PK、PKII及NFB是青春型雙歧桿菌DNA激活巨噬細胞的另一途徑。參考文獻:1王立生,朱惠明,潘令嘉,等.雙歧桿菌的脂磷壁酸對小鼠腹腔的活性作用J.細胞與分子免疫學(xué)雜志,2002,181:23-24.2AgrenJ,Thieerann,FsterSJ,etal.ytkinerespnsestpGDNAinhuanleukytesJ.SandJIunl,2022,64(1):61-68.3LiY,QuX,TangH,etal.BifidbaterialDNAinduesurinearphagesativatininvitrJ.elllIunl,20

18、22,2(6):473-478.4宋文剛,曲迅,張彬彬,等.雙歧桿菌DNA對小鼠腹腔巨噬細胞分泌和殺瘤功能的影響J.腫瘤學(xué)雜志,2002,8(2):89-91.5Lin,henB.PharalgialparisnfUTPandthapsigargininduedarahidniaidreleaseinuseRA264.7arphagesJ.BrJPharal,1998,123(6):1173-1181.6KuarA,SinghS,SdhiA.Effetrfprlatinnnitrixideandinterleukin1prdutinfurineperitnealarphages:rlefa2+

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