有關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑篩選及評估機體免疫狀態(tài)的實驗

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè) 有關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑篩選及評估機體免疫狀態(tài)的實驗第一章 檢測非特異免疫功能的實驗小白鼠碳粉廓清試驗基本原理靜脈注射一定大小的顆粒物質(zhì)，迅速被肝、脾等器官內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞吞噬而使其在血漿濃度降低，因此可從其廓清率了解整個單核巨噬細胞系統(tǒng)的吞噬功能。材料和儀器印度墨汁0.1%Na2CO3溶液毛細滴管72分光光度計操作步驟體重18一22g小白鼠，雌雄各半，隨機分為實驗組與對照組。每鼠尾靜脈注射印度墨汁0.05ml/kg體重，于l（t1）和5（t5）分鐘后分別從眼眶靜脈取血20ul，

2、加到2ml、0.1%Na2CO3溶液中搖勻；用72型分光光度計在680mm下比色,測光密度（以下分別用OD1和OD5來表示l分鐘和5分鐘所取血樣的光密度）；按下式計算廓清指數(shù)K值： 廓清指數(shù)K=LogOD1logOD5=LogOD1/OD5T5-t14 K值經(jīng)體重及肝脾重換算后得吞噬指數(shù)值： 吞噬指數(shù)體重肝脾重 以X來表示給藥組與對照組的 k值和 值，進行組間 t檢驗，比較差異的顯著性。 注意事項印度墨汁應(yīng)用生理鹽水稀釋l一5倍左右。最好經(jīng)超聲處理后離心，棄出沉淀物，以免凝集的碳粒阻塞肺毛細血管，引起動物致死。尾靜脈注射要熟練，取血時間也可延長至10分鐘，但必須準確無誤。參考文獻劉輝2000研

3、究生免疫學(xué)教程大連大連出版社258-259（張璐劉輝）小白鼠腹腔巨噬細胞吞噬試驗 基本原理通過定量地觀察巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬情況，反映小鼠巨噬細胞的吞噬能力。 材料和儀器5雞紅細胞生理鹽水懸液37孵箱固定液：1:1丙酮甲醇溶液染色液：4（VV）Glemsa一磷酸緩沖液 墊有濕紗布的搪瓷盒操作步驟 1 取體重 18一22g 的健康小白鼠隨機分成給藥組試驗組、陰性對照組和陽性對照組。2每鼠腹腔注射 5雞紅細胞生理鹽水懸液0.5ml。 3 8-12小時后,頸推脫臼處死小鼠；正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹膜注入生理鹽水2m1，輕輕按揉鼠腹部 1分種，然后吸出腹腔洗液 lml，分滴于兩片載玻片上，放人墊有濕

4、紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37孵箱溫育30分鐘。4以生理鹽水漂洗，以除去未粘片的細胞，晾干。51:1丙酮甲醇溶液固定5分鐘。64（VV）Glemsa一磷酸緩沖液染色3分鐘，用流水沖洗，晾干。 7結(jié)果判定：油鏡下計數(shù)巨噬細胞，每片 200個按下式計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù) 100%200個巨噬細胞（吞及未吞噬的） 吞噬指數(shù)被吞噬的雞紅細胞2個巨噬細胞 在計數(shù)時，應(yīng)同時觀察雞紅細胞被消化的程度，借以判定巨噬細胞吞噬和消化功能通常分為4級： 級：未消化。被吞噬的雞紅細胞完整，胞質(zhì)淺紅或淺黃綠色，胞核淺紫紅色。 II級；輕度消化。胞質(zhì)淺黃綠色，胞核固縮呈紫藍色。 III級：

5、重度消化。胞質(zhì)淡染，胞核呈淺灰黃色。 IV級：完全消化。巨噬細胞內(nèi)僅見形態(tài)類似雞紅細胞大小的空泡，邊緣整齊胞核隱約可見。 注意事項實驗過程中應(yīng)注意無菌操作。若篩選免疫抑制藥，預(yù)先可用巨噬細胞誘導(dǎo)劑，在實驗前34天，腹腔注射 0.5淀粉生理鹽水溶液，每鼠 0.5ml。免疫增強劑多可激活小鼠腹腔巨噬細胞，并增強其吞噬功能一般不再使用巨噬細胞誘導(dǎo)劑。若滴片染色過深，可用1HCI脫色；過淺則可復(fù)染。每鼠兩片的計數(shù)應(yīng)基本一致，若差距過大，應(yīng)予淘汰。由小鼠腹腔吸出的液體為出血性滲出液時，不宜使用。必要時用低滲法溶解胞外紅細胞，這樣容易鑒別細胞內(nèi)外的雞紅細胞。本法簡便但難于測定吞噬速率及其動力學(xué)改變，而且費

6、時。參考文獻巴德年1998當代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，261263（張璐劉輝）溶菌酶測定法（光學(xué)法）基本原理體液或分泌物中溶菌酶活性可以通過檢查其對指定敏感菌株的裂解作用來進行測定，將檢品與菌液混合，用分光光度計觀察指定時間內(nèi)透光度改變的百分數(shù)反映溶菌酶的活性。 材料與儀器菌種；溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是從空氣中分離出的一種革蘭氏陽性球菌，菌落呈黃色，普通培養(yǎng)基上生長良好， 個月傳代次或凍干成菌種保存。PH6.4,1/15M磷酸鹽緩沖鹽水（）：1/15M磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀9.04g,，加蒸餾水至1000ml。1/

7、15M磷酸氫二鈉溶液：磷酸氫二鈉2H2O11.87g，加蒸餾水至1000ml。PH6.4, 1/15M PBS： 1/15M磷酸二氫鉀溶液73ml, 1/15M磷酸氫二鈉溶液27ml，氯化鈉0.5g 混勻，溶解即成。溶菌酶標準品：結(jié)晶純品。5N氫氧化鉀：氫氧化鉀56g加蒸餾水至200ml。分光光度計操作步驟菌液制備：將溶壁微球菌接種于普通瓊脂斜面上，37 培養(yǎng) 24一36小時用 PH6.4、1/15M PBS洗下，配成混懸菌液。用分光光度計波長640nm測定，并調(diào)整其濃度達到透光率40。溶菌酶標準液：稱取溶菌酶標準純品，用PH6.4、l15M PBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。臨用

8、時再稀釋成100、50、25及10ugml標準液。檢品應(yīng)根據(jù)估計溶菌酶含量作適當稀釋取適當稀釋（或不稀釋）檢品0.2ml放小試管內(nèi)。置37 水浴箱預(yù)熱5分鐘，再向管內(nèi)加人預(yù)熱的菌液1.8ml混勻，立即記下開始時間，至2分鐘時加入1滴5N氫氧化鉀停止反應(yīng)，立即將菌液倒入比色杯內(nèi)用640nm濾光板，0.5cm比色杯測其透光率T1%。另取同樣濃度的檢品 0.2ml先加入 1滴 5N氫氧化鉀搖勻，在37預(yù)熱分鐘，再加入1.8ml經(jīng)37預(yù)熱的菌液，在同樣溫度下2分鐘后同法測定其透光率0。T一0為透光率差值，即溶菌酶所致透光率的變化，從標準曲線上可查得檢品中溶菌酶含量。計算：以0.2ml各種濃度的溶菌酶標

9、準液代替檢品，操作步驟與待檢品相同。以不同濃度標準液測得的透光率差值為縱坐標（ 對數(shù)坐標），溶菌酶濃度為橫坐標，在半對數(shù)紙上繪制標準曲線。按檢品的T（2分鐘的讀數(shù)減去零時的讀數(shù)）查出其對數(shù)，由標準曲線上查出稀釋的檢品中溶菌酶的含量，乘以稀釋倍數(shù)，即為檢品中溶菌酶的含量。注意事項溶菌酶是一種小分子蛋白質(zhì)，存在于機體的淚液、唾液、痰、鼻涕、白細胞和血清等。測定它在體液或分泌物中的含量及其變動情況，可作為側(cè)面了解機體防御功能一個指標。在選擇標本及評價其意義時應(yīng)予以注意。參考文獻劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社260261（張璐劉輝）溶菌酶測定法（平板法）基本原理體液或分泌物中溶菌酶活性可以

10、通過檢查其對指定敏感菌株的裂解作用來進行測定，在混有菌液的瓊脂疑膠上打孔，將檢品放在孔內(nèi)，一定時間后測定溶菌環(huán)的直徑?？煞从橙芫傅幕钚浴?材料與儀器菌種：溶壁微球菌（Micrococus Lysodeilicus）是從空氣中分離出的一種革蘭氏陽性球菌，菌落呈黃色，普通培養(yǎng)基上生長良好， 個月傳代次或凍干成菌種保存。PH6.4,1/15M磷酸鹽緩沖鹽水（）1/15M磷酸二氫鉀溶液：磷酸二氫鉀9.04g,，加蒸餾水至1000ml。1/15M磷酸氫二鈉溶液：磷酸氫二鈉2H2O11.87g，加蒸餾水至1000ml。PH6.4, 1/15M PBS： 1/15M磷酸二氫鉀溶液73ml, 1/15M磷酸

11、氫二鈉溶液27ml，氯化鈉0.5g 混勻，溶解即成。溶菌酶標準品：結(jié)晶純品。普通瓊脂培養(yǎng)基 操作步驟菌液制備：將溶壁微球菌接種于普通瓊脂斜面上，37 培養(yǎng) 24一36小時用 PH6.4、1/15M PBS洗下，配成混懸菌液。用72型分光光度計波長640nm測定，并調(diào)整其濃度達到透光率40。溶菌酶標準液：稱取溶菌酶標準純品，用PH6.4、l15M PBS配成1000ug/ml原液，放冰箱保存。臨用時再稀釋成100、50、25及10ugml標準液。加熱融化1.2%瓊脂粉，待冷卻至60-70時將溶壁微球菌混入搖勻，使其濃度為1mg/ml，立即傾入已夾好的兩玻片中（厚度為4mm）。待瓊脂凝固后，以15

12、mm間隔，用打孔器穿鉆2.5mm直徑小孔，每孔中加入20ul檢樣品，并在同一板上加上不同濃度的標準溶菌酶樣品，置24-26，12-18小時，用測微尺測溶菌環(huán)的直徑。用半對數(shù)紙（以溶菌酶濃度為縱坐標，即對數(shù)坐標，溶菌環(huán)直徑為橫坐標）繪制標準曲線。從線上查出每毫升樣品所含溶菌酶的ug數(shù)。注意事項在缺乏培養(yǎng)細菌的條件下也可使用干菌粉，將溶壁微球菌24小時培養(yǎng)物用60倍體積蒸餾水洗下，離心沉淀棄上清液，沉積的菌體加約5倍體積的丙酮，用玻棒攪勻，放冰箱內(nèi)30分鐘、取出離心沉淀棄上清液。按此法用丙酮浸洗3次，再用乙醚洗2次，將菌體放于燥器內(nèi)過夜，即得干菌粉。用乳體研碎備用，使用時稱干菌粉500mg，放人上

13、述磷酸緩沖液約50ml，如上調(diào)整菌液濃度約30一40%.參考文獻劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社260261（張璐劉輝）檢測特異性免疫功能的實驗血清溶血素測定基本原理經(jīng)綿羊紅細胞（SRBC）免疫動物的淋巴細胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素）。并釋放至外周血。這種抗體在試管內(nèi)與SRBC溫育在補體參與下可產(chǎn)生溶血反應(yīng)免疫動物血清中溶血素的含量可以通過溶血過程中釋放的血紅蛋白來測出。材料與儀器SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化鈉 0.42g，檸檬酸鈉 0.8g，蒸溜水100ml，無菌過濾（漏斗）或8磅10分鐘滅菌后備用。都氏試劑（測血紅蛋白用）；碳酸氫鈉 1.0g，高

14、鐵氰化鉀 0.2g，氰化鉀0.05g，蒸餾水1000ml。補體：新鮮豚鼠（至少3只）混合血清經(jīng)SRBC（10:1）于4吸收30分鐘后置-20以下備用。SRBC：在無菌條件下，自健康成年綿羊外頸靜脈取血，置血液于有玻璃珠的三角燒瓶中輕搖10分鐘以除去纖維蛋白，加人2 倍量的保存液，置4冰箱備用。臨用時用生理鹽水洗滌3次，經(jīng)2000rpm10分鐘得壓積紅細胞，再按所需濃度稀釋。 操作步驟免疫；小鼠腹腔注射20SRBC 0.2ml天，免疫后第4天去眼球或腹動脈取血，分離血清，將血清稀釋（一般500倍以上）后供測定。溶血反應(yīng)：反應(yīng)管內(nèi)依次加人經(jīng)稀釋的血清lml，5SRBC0.5ml，10補體lml置3

15、7恒溫水浴中保溫30分鐘，然后移至冰浴中終止反應(yīng)，1500rpm離心5分鐘，取血清液lml加都氏試劑3ml，搖勻放置10分鐘，于540nm波長比色讀取吸光度。SRBC半數(shù)溶血值：取SRBC 0.25ml加都氏液至 4ml，比色讀取吸光度值，即為實驗中所用SRBC半數(shù)溶血時的吸光度值。計算：樣品管中數(shù)溶血值 CH50按下式計算：每只鼠的血清CH50 =樣品的吸光度值稀釋倍數(shù)SRBC半數(shù)溶血時的吸光度值注意事項免疫用SRBC濃度可根據(jù)不同品系小鼠的敏感度和試驗藥物的作用強度作調(diào)整。參考文獻劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社261262（張璐劉輝）第二節(jié) 抗體形成細胞測定基本原理將經(jīng)SRBC

16、免疫的小鼠脾細胞、SRBC（靶細胞）及補體一起混合于瓊脂內(nèi)，抗體形成細胞分泌的抗體在補體參與下；使其周圍的SRBC溶解形成肉眼可見的溶血空斑，這種溶血空斑數(shù)大體上可以反映抗體形成細胞數(shù)。材料與儀器SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化鈉 0.42g，檸檬酸鈉 0.8g，蒸溜水100ml，無菌過濾（漏斗）或8磅10分鐘滅菌后備用。SRBC：在無菌條件下，自健康成年綿羊外頸靜脈取血，置血液于有玻璃珠的三角燒瓶中輕搖10分鐘以除去纖維蛋白，加人2 倍量的保存液，置4冰箱備用。臨用時用生理鹽水洗滌3次，經(jīng)2000rpm10分鐘得壓積紅細胞，再按所需濃度稀釋。100目尼龍網(wǎng)紗布Han

17、ks液（見附錄）瓊脂粉0.4%臺盼藍生理鹽水補體：新鮮豚鼠（至少3只）混合血清經(jīng)SRBC（10:1）于4吸收30分鐘后置-20以下備用。戊二醛37溫箱等操作步驟免疫：用 20SRBC 0.2ml只腹腔注射免疫小鼠。免疫后第 4天處死供實驗。制備脾細胞懸液：脫頸處死經(jīng)SRBC免疫的小鼠，立即剖取脾臟，在冰浴中，將脾置于100目尼龍網(wǎng)紗布上，加少許 Hanks液，輕輕擠壓出脾細胞。細胞計數(shù)時用 0.4%臺盼藍染色觀察活細胞應(yīng)在90以上。將脾細胞懸液配成107個ml濃度。制備瓊脂底層；平皿中加人用Hanks液配成的溶化的14瓊脂23ml制備瓊脂底層。加樣：取脾細胞懸液和 5SRBC各 0.lml及原

18、補體 0.05ml混合加入保溫于 45水浴的含0.4瓊脂糖0.8ml的試管中，搖勻后倒人平皿，旋轉(zhuǎn)平皿使混合物均勻平鋪于底層瓊脂上，凝固后將平皿裝人溫盒并置37溫箱中孵育34小時后計數(shù)PFC。如需保存，可加入生理鹽水或PBS配制的0.25戊二醛6ml加以固定。計算：以每106個脾細胞或整個脾臟所含的PFC數(shù)表示結(jié)果。注意事項PFC代表抗體產(chǎn)生細胞的數(shù)量，PFC的面積代表抗體的活性，討論試驗意義時應(yīng)予以注意。參考文獻巴德年1998，當代免疫學(xué)技術(shù)與應(yīng)用北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社， 207208（張璐劉輝）第三節(jié)特異性淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗基本原理 先用抗原刺激機體，再用該抗原在體外刺

19、激有關(guān)淋巴細胞，通過觀察淋巴細胞轉(zhuǎn)化情況評定機體的免疫功能。材料和儀器反應(yīng)細胞：取自體內(nèi)免疫后小鼠淋巴結(jié)的T細胞抗原：1mg/ml 抗原溶于PBS輔助細胞：經(jīng)照射或絲裂霉素C處理后同系小鼠脾細胞（或非T脾細胞）Freunds完全佐劑96孔圓底或平底細胞培養(yǎng)板3H-標記甲基胸腺嘧啶100%乙醇閃爍液多孔收集器玻璃纖維濾紙液體閃爍計數(shù)儀液閃管等【操作步驟】 免疫小鼠：制備抗原水溶液與Freunds完全佐劑的混懸液。若為引起淋巴結(jié)細胞的免疫應(yīng)答，可經(jīng)足墊免疫；若主要引起脾細胞免疫應(yīng)答，可經(jīng)腹腔免疫。皮下免疫后再經(jīng)尾靜脈免疫也是一條有效的免疫途徑。細胞抗原可經(jīng)腹腔免疫。需免疫2-3周才可進行體外試驗。

20、 將抗原做4倍或10倍稀釋，每孔加入30 ul蛋白質(zhì)抗原。對照孔加入30 ul培養(yǎng)基。 無菌取免疫后小鼠淋巴結(jié)和未免疫同系小鼠淋巴結(jié)，制成細胞懸液，并計數(shù)。 每孔加入100 ul反應(yīng)細胞。反應(yīng)細胞最好為純化后T細胞，否則可能會因非抗原特異細胞的增殖反應(yīng)使對照值增高。若使用未分離的淋巴結(jié)細胞，每孔可加入1-2106 細胞。 每孔加入100 ul 5106輔助細胞。 37，5% CO2培養(yǎng)4-5天。結(jié)束培養(yǎng)前6-18h每孔加入0.5-1.0Ci3H-胸腺嘧啶。 用細胞收集器將細胞收集在濾紙上，反復(fù)（至少10次）充吸培養(yǎng)孔，以保證DNA留在濾紙上，而未摻入的3H胸腺嘧啶被完全除去。100%乙醇處理以

21、助于濾紙干燥?；蜢o置過夜。將干燥的濾紙片加入液閃瓶，每瓶含5ml 閃爍液。液閃儀計數(shù)cpm值。注意事項多數(shù)情況下，1106/ml細胞濃度對多數(shù)刺激能產(chǎn)生良好的增殖反應(yīng)。否則需預(yù)先滴定出合適的細胞濃度。當細胞濃度低時，改用96孔圓底培養(yǎng)板能提高增殖反應(yīng)。 細胞在培養(yǎng)前應(yīng)具有良好的活力。 3H-胸腺嘧啶摻入時間長，會提高實驗的重復(fù)性。每批實驗時，應(yīng)固定摻入時間和摻入量。參考文獻葉應(yīng)嫵1997全國臨床檢驗操作規(guī)程南京：東南大學(xué)出版社379-381（張璐劉輝）有關(guān)免疫實驗的動物模型免疫功能低下動物模型基本原理利用淋巴細胞敏感的細胞毒藥物抑制或殺傷淋巴細胞，使機體免疫功能低下。試劑與器材環(huán)磷酰胺氫化可的

22、松操作步驟方法一：健康小鼠，每鼠皮下注射環(huán)磷酰胺：80100mg/kg，5天后免疫功能顯著降低。方法二：健康小鼠，每鼠每天皮下注射氫化可的松：50100mg/kg，68天后免疫功能顯著受抑。注意事項必須設(shè)對照組，隨機分配。在用免疫功能障礙的動模型時，亦應(yīng)加設(shè)正常動物對照組，以檢驗?zāi)Ｐ褪欠癯晒?。由于免疫反?yīng)與基因類型有關(guān)，應(yīng)盡可能采用純系動物，并控制鼠齡、性別和體重，以減少個體差異。 參考文獻余傳霖1998，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫學(xué)上海：上海醫(yī)科大學(xué)出版社，12021214（張璐劉輝）第二節(jié)大鼠同種被動皮膚過敏反應(yīng)基本原理將致敏大鼠的血清（內(nèi)含豐富的lgE抗體）皮內(nèi)注射于正常大鼠腹壁或背部，每點形成一皮丘

23、。IgE與局部皮膚肥大細胞的FC受體結(jié)合，使之被動致敏。當抗原攻擊時，引起局部肥大細胞釋放過敏介質(zhì)，從而使局部血管的通透性增加，注入伊文思藍，可滲出于皮丘內(nèi)，形成一個藍斑。根據(jù)藍斑范圍或深淺程度，判定血管通透性變化，以反映皮膚過敏反應(yīng)的程度。試劑與儀器天花粉4氫氧化鋁5伊文思藍溶液（內(nèi)含天花粉1mg）操作步驟抗血清制備：取體重 90100g健康大鼠，天花粉以4氫氧化鋁凝膠配成5mgml的混懸液，給大鼠4個足跖注射各0.lml，共0.4ml。于致敏后1014天，處死動物采血，血經(jīng)低速離心，分離血清，置冰箱備用。被動皮膚致敏及抗原攻擊：另取體重150200g健康大鼠，在乙醚麻醉下剪去背部的毛，將稀

24、釋的抗血清（稀釋度可在I：20一1：80）皮內(nèi)注射于鼠背部，每一稀釋度注射二點。每點0.lml，至少注射兩個稀釋度。48小時后進行抗原攻擊，靜脈注射 lml、0.5伊文思藍溶液（內(nèi)含天花粉1mg）。20分鐘后斷頭處死動物，翻轉(zhuǎn)背部皮膚，測定藍色反應(yīng)斑的直徑大小。注意事項本法是抗 = 1 * ROMAN I型變態(tài)反應(yīng)藥物常用的篩選方法，方法簡便，篩選的結(jié)果與臨床效果基本吻合。注意假陽性的發(fā)生，有些藥物可以降低血管通透性，也能得到陽性結(jié)果，但不一定影響過敏反應(yīng)，應(yīng)予排除。為使結(jié)果更加客觀，可剪下藍斑皮膚，每點以5ml丙酮生理鹽水溶液(3:7VV），浸泡48小時，離心，取出上清液，以590nm測定光

25、密度。PCA抑制百分率可用下式計算：抑制百分率對照組藍斑直徑或光密度一用藥組藍斑直徑或光密度100%對照組藍斑直徑或光密度參考文獻劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社266267（張璐劉輝）第三節(jié)型變態(tài)反應(yīng)動物模型基本原理經(jīng)綿羊紅細胞（SRBC）免疫動物的淋巴細胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體（溶血素）。將這種抗體注射于正常動物的皮內(nèi)組織，在補體參與下，可引起皮膚血管炎，使血管通透性增加。皮膚血管炎反應(yīng)輕重可以通過血管通透性來反映。亦稱Forssmam皮膚血管炎反應(yīng)。試劑與儀器SRBC保存液（Alsever液）；葡萄糖2.05g，氯化鈉 0.42g，檸檬酸鈉 0.8g，蒸溜水100ml，無菌過濾（

26、漏斗）或8磅10分鐘滅菌后備用。SRBC：在無菌條件下，自健康成年綿羊外頸靜脈取血，置血液于有玻璃珠的三角燒瓶中輕搖10分鐘以除去纖維蛋白，加人2 倍量的保存液，置4冰箱備用。臨用時用生理鹽水洗滌3次，經(jīng)2000rpm10分鐘得壓積紅細胞，再按所需濃度稀釋。操作步驟抗SRBC血清制備：將109 SRBC混懸于 lml磷酸鹽緩沖液，給正常兔靜脈注射，隔天l次，共10次。于最后一次注射后14天，收集兔血清。本血清即為抗SRBC血清亦即溶血素?？寡褰臃N及觀察：取體重200300g健康豚鼠，剪去背部，將1：8以生理鹽水稀釋的抗血清皮內(nèi)注射于背部，每點0.lrnl?？筛鶕?jù)實驗要求，注射多個稀釋度的抗血

27、清，每個稀釋度至少注射兩點。 24小時后可見注射局部有炎癥反應(yīng)。靜脈注射 0.5伊文思藍溶液 lrnl，半小時后注射局部有一明顯的藍斑。處死動物，測定皮膚藍斑的直徑。注意事項為使結(jié)果客觀，可用比色法測定藍斑中伊文思藍的含量，每點以5ml丙酮生理鹽水溶液(3:7VV），浸泡48小時，離心，取出上清液，以590nm測定光密度?？捎孟率接嬎阋种瓢俜致剩阂种瓢俜致蕦φ战M藍斑直徑或光密度一用藥組藍斑直徑或光密度100%對照組藍斑直徑或光密度參考文獻劉輝2000研究生免疫學(xué)教程大連大連出版社268269（張璐劉輝）III型變態(tài)反應(yīng)動物模型基本原理本模型的形成需要有抗原的持續(xù)存在，將抗原物質(zhì)反復(fù)注射，抗原與

28、相應(yīng)抗體結(jié)合形成游離的免疫復(fù)合物，在一定條件下這種復(fù)合物沉積在血管壁基底膜或組織間隙，通過激活補體、中性粒細胞或血小板，造成沉積部位炎癥變化。亦稱Arthus反應(yīng)。試劑與儀器硫酸鈉卵白蛋Freunds完全佐劑（有商品出售）操作步驟取體重l2.5kg健康免，雌雄不拘。 將經(jīng)3次重結(jié)晶的卵白蛋白乳化于Freunds完全佐劑中，乳化必需充分。 每周肌肉注射 lml，共4次。 最后 1次注射后第 9天，背部剪毛，第天背部皮內(nèi)注射 10卵白蛋白，每點注射量為0.2ml。 抗原攻擊后 2、3、4、6、8、12、24小時觀察每點局部皮膚紅腫的最大直徑與反應(yīng)的程度，求其平均值。反應(yīng)程度標準分級；：2或5小時明顯充血、出血，呈融合狀；24小時明顯出血性變色。：2或5小時中度充血、出血，呈斑塊狀；24小時