硫化砷對(duì)骨髓增生異常綜合征骨髓單個(gè)核細(xì)胞體外凋亡的作用

1、硫化砷對(duì)骨髓增生非常綜合征骨髓單個(gè)核細(xì)胞體外凋亡的作用袁紅建，徐瑞容，丁潤(rùn)生，姜?jiǎng)偃A，陸偉【摘要】為了研究硫化砷As2S2在體外對(duì)骨髓增生非常綜合征患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞增殖的影響，并探究其大概的作用機(jī)制，接納TT法、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PR等多參數(shù)檢測(cè)差異濃度As2S2誘導(dǎo)DS細(xì)胞的凋亡。效果表白：低濃度0-0.6g/L的硫化砷對(duì)DS細(xì)胞無(wú)顯著按捺作用；相對(duì)高濃度的硫化砷1.5-50g/L對(duì)低危組DS以及高危組DS的單個(gè)核細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用，且呈時(shí)間濃度依靠干系；bl-2RNA在As2S2作用后表達(dá)顯著下調(diào)，bl-2/bax比例顯著落落(P0.05)；DS病人存在骨髓造血細(xì)胞的過(guò)分凋亡。結(jié)論：D

2、S病人存在骨髓造血細(xì)胞的過(guò)分凋亡；低濃度的硫化砷對(duì)DS細(xì)胞沒(méi)有顯著的增殖按捺作用，高濃度的硫化砷重要通過(guò)誘導(dǎo)凋亡使DS細(xì)胞殞命。【關(guān)鍵詞】骨髓單個(gè)核細(xì)胞ApptsisfInVitrulturedBNfrDSPatientsInduedbyArseniSulfideAbstratTheaifthisstudyastinvestigatetheinhibitineffetfarsenisulfide(As2S2)nthegrthfinvitrulturedBNfrDSpatientsandtexplreitspssibleellularandleularehanissTheapptsisfDSel

3、lsinduedbyAs2S2slutinfdifferentnentratinserestudiedithTT，flytetry，andRT-PR.Theresultsshedthat(1)lnentratinfAs2S20-0.6g/Lhadnarkedinhibitineffetnprli-feratinfDSells；(2)aftertreatentith1.5-50g/LfAs2S2，bthlriskDSellsandhighriskDSellspresentedtypialfeaturesfapptsisithadse-dependentanner，theexpressinfbl-

4、2RNAandtheratifbl-2/baxbviuslydereasedafterAs2S2treatent(P0.05);(3)BNfrDSpatientshadhigherapptsisratithanthatfBNfrntrl.ItisnludedthatBNexessiveapptsisexistsinDSpatients;lnentratinfAs2S20-0.6g/LshsninhibitineffetnprliferatinfDSells；highnentratinfAs2S21.5-50g/LinduesapptsisfDSells.Keyrdsyeldysplastisy

5、ndres;arsenisulfide;BN;apptsis;bl-2;bax骨髓增生非常綜合征(yeldysplastisyndres，DS)是一種造血干細(xì)胞非?？寺⌒耘c異質(zhì)性疾病，其重要特性為病態(tài)造血和無(wú)效造血，部門(mén)患者易向白血病轉(zhuǎn)化。DS發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)1，但如今對(duì)其治療仍無(wú)很好的要領(lǐng)。經(jīng)研究創(chuàng)造，砷劑具有致癌、致畸、致突變的協(xié)同作用；作為微量元素，砷尚能促進(jìn)造血、細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖2。硫化砷As2S2是中藥雄黃的重要身分，比年來(lái)，用雄黃治療DS獲得了必然的療效3，本研究以不雅察硫化砷As2S2在體外對(duì)DS骨髓單個(gè)核細(xì)胞的作用，查明其大概的治療機(jī)理，開(kāi)拓其應(yīng)用范疇。質(zhì)料和要領(lǐng)病例選擇DS

6、患者25例，根據(jù)FAB分型4，RA15例，RAS3例，RAEB5例，RAEB-t2例。男性16例，女性9例，中位數(shù)年事4519-80歲，為初診及復(fù)診的患者，每例均經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和骨髓病理等相干的實(shí)行室查抄確診。以上病例來(lái)自南通大學(xué)隸屬病院血液科。標(biāo)本網(wǎng)羅和細(xì)胞分散自髂后上棘抽取5l骨髓液，0.1%肝素抗凝，網(wǎng)羅后2小時(shí)內(nèi)用淋巴細(xì)胞分散液密度梯度離心分散骨髓單個(gè)核細(xì)胞，RPI1640造就液洗3遍，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)備用。試劑硫化砷As2S2購(gòu)自美國(guó)Siga公司，純度99.99%，以0.2l/LNaH溶解，Hl中和滴定至pH7.35-7.45，制成0.1%的儲(chǔ)存液，4保存。TT購(gòu)自美國(guó)Siga公

7、司，臨用前以PBS配制成5g/l，抽慮除菌，保存在4條件下。RT-PR試劑盒購(gòu)自晶美公司，AnnexinVFIT試劑盒購(gòu)于聯(lián)科生物公司。TT增殖按捺實(shí)行硫化砷分成7種差異濃度0.3、0.6、1.5、3.0、15、30、50g/L組，加上調(diào)零孔沒(méi)有細(xì)胞和藥和比擬孔不加藥，共為9組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分散的骨髓單個(gè)核細(xì)胞以每孔1000-10000個(gè)接種到96孔板，每孔體積200l，造就液為含差異濃度的硫化砷的RPI1640含10%胎牛血清、100U/l青霉素、100g/l鏈霉素；37，5%2條件下別離造就24、48、72小時(shí)，每孔再參加TT20l，孵育4小時(shí)，警覺(jué)棄上清，加二甲亞砜150l振蕩溶解1

8、0分鐘，用酶標(biāo)儀測(cè)490n波長(zhǎng)A值，取5孔A490的均值，盤(pán)算按捺率。按捺率=陰性比擬的A值-實(shí)行孔的A值/陰性比擬的A值100%。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分散的骨髓單個(gè)核細(xì)胞以2-5105/L濃度接種在含硫化砷的RPI1640造就液中舉行造就37，5%2，別離取造就前0小時(shí)、造就后24小時(shí)、48小時(shí)的細(xì)胞，以AnnexinV-PI舉行標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。熒光共聚焦顯微鏡不雅察硫化砷處置懲罰后的細(xì)胞和未經(jīng)處置懲罰的細(xì)胞以AnnexinV和PI標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟，網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞涂片，用熒光共聚焦顯微鏡不雅察并拍攝圖片。RNA抽提和bl-2與baxRNA轉(zhuǎn)錄的RT-PR檢測(cè)用TrizL試劑盒(Gib公司)

9、提取細(xì)胞總RNA后測(cè)定其濃度和純度(紫外分光光度儀，Pharasia公司)。RT反響體系包羅RNA1-5g，lig(dT)18Prier(0.5g/l1l，5緩沖液4l，dNTP(l0l/L)2l，RNasin(20U/l1l，-uLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/l1l，總體系20l；RT-PR引物見(jiàn)表1。50lPR體系包羅：逆轉(zhuǎn)錄反響產(chǎn)物2l，上游及卑劣引物(10plL)各2l，dNTP(10l/L)0.8l，TaqDNA合成酶(25U/l0.5l，gl2(25l/L)3l，10PRbuffer5l；反響參數(shù)：95預(yù)變性5分鐘，9440秒，5540秒，7240秒，727分鐘，各反響32個(gè)循環(huán)；反響產(chǎn)

10、物各取10l，1.8瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V；凝膠成像體系(Bi-Rad公司)記載并對(duì)條帶作半定量闡發(fā)。RT-PR試劑由晶美生物工程提供，引物合成由北京華大中生科技生長(zhǎng)提供。Table1.PriersfRT-PR略統(tǒng)計(jì)學(xué)闡發(fā)實(shí)行數(shù)據(jù)用xSD表現(xiàn)，接納單因素方差闡發(fā)、多因素方差闡發(fā)和q查驗(yàn)，闡發(fā)實(shí)行效果團(tuán)體差異的明顯性；用t查驗(yàn)闡發(fā)比擬組和用藥組之間差異的明顯性；I50用回歸方程盤(pán)算。應(yīng)用STATE7.0統(tǒng)計(jì)軟件舉行統(tǒng)計(jì)闡發(fā)，以P0.05為差異具有明顯性意義。效果硫化砷As2S2對(duì)DS骨髓單個(gè)核細(xì)胞生長(zhǎng)的影響差異濃度的硫化砷As2S2對(duì)DS骨髓單個(gè)核細(xì)胞具有差異的作用。經(jīng)TT法檢測(cè)，低濃度的

11、硫化砷0-0.6g/L對(duì)DS骨髓單個(gè)核細(xì)胞無(wú)顯著生長(zhǎng)按捺作用F=0.95，P=0.46；相對(duì)高濃度(1.5-50g/L)的As2S2處置懲罰DS骨髓單個(gè)核細(xì)胞，具有差異的生長(zhǎng)按捺作用(F=22.0，P0.001)表2、表3，圖1，As2S2作用于DS骨髓單個(gè)核細(xì)胞差異時(shí)間，其生長(zhǎng)按捺作用也差異F=14.31，P0.001圖2。經(jīng)回歸闡發(fā)擬合趨勢(shì)線和方程盤(pán)算，其24、48和72小時(shí)I50別離為44.24、8和2.57gL。Table2.EffetfAs2S2ngrthfDSellsbyTTtest(略)As2S2對(duì)DS骨髓單個(gè)核細(xì)胞凋亡的影響經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，DS病人存在骨髓造血細(xì)胞的過(guò)分凋亡表

12、4，比擬組、低危DS組、高危DS組造就前的凋亡率各不雷同F(xiàn)=48.74，P0.05，低危及高危DS病人的單個(gè)核細(xì)胞凋亡率與比擬組比擬均有顯著增高，低危DS與正常比擬比q=28.73，P0.05；高危組DS與比擬比q=17.98，P0.05，而低危組DS比高危組DS有更高的凋亡率q=10.75，P0.05。硫化砷對(duì)3組單個(gè)核細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡作用配對(duì)t查驗(yàn)，P0.05；硫化砷對(duì)3組單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用差異F=444.82，P0.05；硫化砷對(duì)高危組DS具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用高危組與比擬組q=0.52，P0.05；高危組與低危組q=0.54，P0.05；而低危組與比擬組之間無(wú)顯著差異q=0.017

13、，P=0.57。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)效果見(jiàn)圖3。熒光顯微鏡下可見(jiàn)經(jīng)As2S2處置懲罰后的DS骨髓單個(gè)核細(xì)胞中，凋亡細(xì)胞和殞命細(xì)胞均有增長(zhǎng)圖4。Table4.FlytetryanalysisfapptsisratifBNfrdifferenttypesfDSandntrlinduedbyAs2S2(1.5g/L)treatentfrdifferentlengthftie略As2S2對(duì)DS細(xì)胞bl-2、baxRNA表達(dá)影響3g/LAs2S2處置懲罰DS細(xì)胞24小時(shí)后，測(cè)定bl-2、baxRNA表達(dá)效果如圖5。全部細(xì)胞均有bl-2、baxRNA表達(dá)，未處置懲罰組bl-2/bax為0.7300.088；經(jīng)3

14、g/l的As2S2作用24小時(shí)后，bl-2/bax為0.4120.073，兩組比力差異有明顯性t=7.87，P0.05；而在高危組DS和低危組DS之間未檢及差異P0.05，相干數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。Table5.Analysisfbl-2/baxRNAfBNinDSpatientseasuredbyRT-PR略討論比年來(lái)的研究創(chuàng)造，DS病人的骨髓中存在比力高的細(xì)胞凋亡比例。Raza等5通過(guò)給DS病人靜脈中注射碘去氧鳥(niǎo)苷和(或)溴去氧鳥(niǎo)苷，再取骨髓活檢樣本，經(jīng)單克隆抗體原位標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟碘/溴去氧鳥(niǎo)苷測(cè)定標(biāo)本中的S期細(xì)胞證明，S期的細(xì)胞比例顯著增長(zhǎng)。DS病人以血虛和全血細(xì)胞淘汰為特性，經(jīng)同時(shí)標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟細(xì)胞

15、核DNA斷端法證明，DS病人尚存在造血細(xì)胞的過(guò)分凋亡。用AnnexinV熒光試劑對(duì)凋亡早期磷脂酰絲氨酸外翻的細(xì)胞胞膜舉行標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟，同時(shí)碘化丙錠能被凋亡早期的細(xì)胞胞膜去除在外，而只能進(jìn)入殞命或凋亡后期的細(xì)胞中，從而使我們可以或許區(qū)別早期凋亡和殞命細(xì)胞。rhant等6用此要領(lǐng)測(cè)得DS病人骨髓單個(gè)核細(xì)胞的凋亡率均勻?yàn)?4.729.5%-60，而比擬組的凋亡率均勻?yàn)?1.61.5%-21。本實(shí)行用此要領(lǐng)測(cè)得的低危組DS的凋亡率均勻?yàn)?1.21，高危組DS的凋亡率均勻?yàn)?0.46，比擬組的凋亡率均勻?yàn)?2.48，與文獻(xiàn)報(bào)道根本相仿。本實(shí)行中測(cè)得的比擬組的凋亡率與低危及高危DS病人均有差異，實(shí)行效果支

16、持DS病人骨髓細(xì)胞的過(guò)分凋亡是DS病人的緊張病理特性的結(jié)論，推測(cè)骨髓細(xì)胞凋亡和增殖比例的失調(diào)是造成DS病人無(wú)效造血和三系血細(xì)胞淘汰的緊張緣故原由，改變DS凋亡和增殖比例大概是改進(jìn)病人血虛、進(jìn)步生存質(zhì)量的有用途經(jīng)。有學(xué)者用雄黃治療DS時(shí)創(chuàng)造其對(duì)DS高危組(RAEB、RAEB-t)的病人有較好的療效3。本實(shí)行用TT法檢測(cè)雄黃的重要身分As2S2對(duì)DS病人的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的作用，創(chuàng)造3g/L以上As2S2可以或許按捺DS細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，而且其效應(yīng)與時(shí)間和濃度成正比，DS細(xì)胞出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的特性性形態(tài)學(xué)改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)出細(xì)胞外貌外翻的磷酸酰絲氨酸，這些都說(shuō)明在必然劑量下，硫化砷可通過(guò)按捺細(xì)胞

17、增殖、誘導(dǎo)凋亡而起作用?，F(xiàn)已創(chuàng)造很多基因與細(xì)胞凋亡有關(guān)，包羅bl-2家屬、Ap-1/Fas(D95)、-y、白細(xì)胞介素-1轉(zhuǎn)化酶(IE)家屬(即aspase家屬)、p53等。這些基因在凋亡歷程中起著差異的作用.Bl-2卵白家屬是凋亡的重要調(diào)治者，其家屬成員包羅抗凋亡卵白Bl-2，Bl-XL，l-1，Al/Bfl-1和凋亡卵白Bax，Bl-XS，Bak，Bik和Bad.這些卵白互相形成二聚體，它們之間的比率影響著腫瘤細(xì)胞對(duì)種種凋亡刺激因子的敏感性或抗性，終極決定細(xì)胞的存亡存亡7，8。此中研究最多的是Bl-2和Bax。Bl-2(Bellleukeia/lypha-2)基因最早是從小鼠B細(xì)胞淋巴瘤中

18、分散出來(lái)的，其編碼的卵白質(zhì)由239個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。Bl-2由于可以或許按捺很多因素介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而引起人們的極大存眷9。Bax與Bl-2具21%同源性，由192個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。Bax/Bax二聚體在體內(nèi)過(guò)量表達(dá)時(shí)，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bl-2是通過(guò)與Bax形成異二聚體利用其成效的。aspase原通過(guò)與凋亡誘導(dǎo)卵白Apaf-1的NH2-末了地區(qū)結(jié)合而激活，抗凋亡卵白如Bl-XL那么可直接與Apaf-1結(jié)合，按捺它同aspase原的交聯(lián)，從而按捺aspase-9的激活10，而B(niǎo)ax那么可直接拮抗Bl-XL的作用，它可把Apaf-1從Bl-XL的結(jié)合中開(kāi)釋出來(lái)，從而激活aspase，產(chǎn)生自身催化的化學(xué)反響，引起線粒體膜電位落落，