黑曲霉脂肪酶基因的克隆及其在黑曲霉中的同源表達(dá)

1、tifi曲霉脂肪酶基因的克隆及其在黑曲霉中的同源表達(dá)脂肪酶(EC3.1. L3,lipase)又稱為三?；视退饷?，是一 類重要的水解酶，可催化酯水解、酯化和酯交換等反響脂肪酶普遍存在于自然界中，在植物、動(dòng)物和微生物中均有 發(fā)現(xiàn)4。目前脂肪酶的工業(yè)化生產(chǎn)主要利用微生物發(fā)酵 5-6 o脂肪酶在兩相界面、水性介質(zhì)或有機(jī)相體系中均能 進(jìn)行催化反響，是工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的關(guān)鍵酶，在生物柴油、食 品、化妝品、皮革、紡織、洗滌業(yè)和制藥等領(lǐng)域具有良好的 應(yīng)用前景7-8。黑曲霉作為外源蛋白表達(dá)宿主，具有優(yōu)異的蛋白分泌能力、 準(zhǔn)確的翻譯后加工能力以及出色的遺傳穩(wěn)定性，同時(shí)具有良 好的平安性。黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)重組

2、蛋白領(lǐng)域具有巨大 潛力，逐漸成為蛋白工廠9T0。黑曲霉脂肪酶多為胞外酶， 因此不僅可以利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，還能采用低本錢的 固體培養(yǎng)基進(jìn)行生產(chǎn)。朱思遠(yuǎn)11通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平改 造提高了黑曲霉脂肪酶的表達(dá)量，開展了 CRISPR/Cas9技術(shù) 在黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用，構(gòu)建了尿嗨噫缺陷型菌株。但 是近年來對(duì)于微生物資源的開發(fā)利用率相對(duì)較低，僅在1% 左右12。脂肪酶在工業(yè)化生產(chǎn)中也面臨著生產(chǎn)效率不高的 問題，因此探索提高脂肪酶產(chǎn)量和活力的方法是當(dāng)前研究的 熱點(diǎn)ANL-H3對(duì)不同碳鏈長度底物的水解活性不同，其中對(duì)pNPA 的催化活性最高，具有較廣的底物特異性，對(duì)不同碳鏈長度 脂肪酸酯的底物都

3、有良好的催化活性。圖6黑曲霉脂肪酶ANL-H3對(duì)p-NP酯的底物特異性Fig. 6SubstratespecificityofANL-H3towardspNPesters2. 5. 4金屬離子對(duì)酶活力的影響金屬離子是影響酶催化性能的重要參數(shù)之一17。金屬離子 可以通過與酶的二硫鍵作用，從而改變酶的結(jié)構(gòu)?？疾觳煌?金屬離子對(duì)ANL-H3的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表 明在離子濃度較低（Immol/L）時(shí)，金屬離子對(duì)脂肪酶的抑制 作用不明顯，其中Mg2+、K+等有激活作用；當(dāng)離子濃度為 5mmol/L時(shí)，Mn2+、Cu2+完全抑制脂肪酶的活性，酶活力只 有對(duì)照組的10%左右。Mg2+、K+等金

4、屬離子對(duì)ANL-H3有較明 顯的激活作用，可分別提高20%30%左右的酶活力。圖7金屬離子對(duì)黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響Fig.7EffectsofmetalionsontheactivityofANL-H32. 5. 5有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響酶催化反響可在非水相介質(zhì)中進(jìn)行，由于有機(jī)溶劑等非水相 介質(zhì)對(duì)催化體系pH值、離子濃度及極性等性質(zhì)的改變，使 得酶蛋白分子在非水相介質(zhì)中容易失去催化活性在酶催化反響體系中分別加入5%和10%的有機(jī)溶劑，以不加 有機(jī)溶劑作為對(duì)照組。由圖8可知，甲醇和DMSO對(duì)ANLTI3 酶活力有一定的促進(jìn)作用，在甲醇和DMSO質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 時(shí),酶活力分別為對(duì)照組

5、126.5%和116.23%,其余4種溶劑 對(duì)ANL-H3有不同程度的抑制作用。圖8有機(jī)溶劑對(duì)黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響Fig.8EffectsoforganicsolventsontheactivityofANL-H32. 6黑曲霉脂肪酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)以pNPA為底物，在0.l3.0mmol/L濃度下測(cè)定脂肪酶 ANL-H3的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，所得結(jié)果如圖9所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 計(jì)算，通過Origin8.5擬合獲得的米氏常數(shù)Km為 1. 893mmol/L,最大反響速度 Vmax 為 1. 610mmol/(L min), 催 化常數(shù)kcat為90.45min-l ,催化效率kcat/Km為

6、47. 78L/(min mmol), kcat/Km被認(rèn)為能最全面的衡量酶催 化能力的指標(biāo)，數(shù)值越大催化效率越高。ANL-H3的Km值低 說明其對(duì)底物pNPA的親和力高，酶促反響易于進(jìn)行20, 且ANL-H3的Kcat/Km值較高，說明酶的催化效率較高。圖9黑曲霉脂肪酶ANL-H3以pNPA為底物的米氏方程圖 Fig. 9Michae1is-MentenequationdiagramofANL-H3usingpN PAassubstrate3結(jié)論本研究以1株低蛋白背景的黑曲霉MA作為表達(dá)宿主，構(gòu)建 以潮霉素B抗性為篩選標(biāo)記的重組表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)8種不同 黑曲霉脂肪酶基因在黑曲霉中的同源表達(dá)，確

7、定表達(dá)最好的 轉(zhuǎn)化子MA-H3-PglaA-SglaA。經(jīng)重組表達(dá)與別離純化后，該 重組酶的比酶活力為31.44U/mg,純化倍數(shù)為65.5倍，酶純 化的回收率為7. 84%o在以pNPA為底物時(shí)，酶的最適溫度為 45,最適pH為7.5。ANL-H3對(duì)pNPA(C2)的水解活力最高, 傾向于中短鏈脂肪酸的底物。在高濃度的金屬離子條件下， Mn2+、Cu2+使ANL-H3基本失活，K+、Mg2+等金屬離子對(duì)ANL-II3 有較明顯的激活作用。ANL-H3對(duì)甲醇和DMSO有較好的有機(jī) 溶劑耐受性。ANL-H3的米氏常數(shù)Km為1. 893mmol/L, Vmax 為 1. 610mmol/(L mi

8、n) , kcat 為 90. 45min-l,催化效率 kcat/Km 為 47. 78L/(min mmol)o本研究利用生物學(xué)信息庫進(jìn)行信息分析和比照，對(duì)黑曲霉基 因組中的脂肪酶功能基因進(jìn)行挖掘和篩選。利用原生質(zhì)體 -PEG轉(zhuǎn)化法構(gòu)建黑曲霉工程菌，實(shí)現(xiàn)8種黑曲霉來源脂肪酶 基因的同源表達(dá)。通過對(duì)表達(dá)質(zhì)粒啟動(dòng)子和信號(hào)肽的優(yōu)化以 提高蛋白表達(dá)水平，并對(duì)重組脂肪酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)表 征。1材料與方法1. 1菌種與質(zhì)粒黑曲霉(Aspergillusniger)AS3. 350、E. coliDH5 a、 E.coliRosetta(DE3)、黑曲霉 MA、質(zhì)粒 pCAMBIA 和質(zhì)粒 pET-

9、28a (+)均為本實(shí)驗(yàn)室保存。L2材料與試劑DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA凝膠回收試劑盒，寶日醫(yī)(北 京)生物技術(shù)；質(zhì)粒小提試劑盒、片段純化試劑盒 和RNA提取試劑盒，北京全式金生物；一步克隆連 接試劑盒，南京諾唯贊生物科技。1. 3黑曲霉脂肪酶基因的生物信息分析從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找黑曲霉來源脂肪酶并比對(duì)分析后，選 取了 8個(gè)黑曲霉脂肪酶，目的基因詳情見表1。利用在線工 具M(jìn)AFFT對(duì)這8個(gè)脂肪酶的編碼序列進(jìn)行多序列比對(duì)，利用 在線工具SignalPd. 1對(duì)這8個(gè)脂肪酶進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)等生 物信息學(xué)分析。表1脂肪酶基因來源和氨基酸信息TablelThesourcesoflipasege

10、neandaminoaci dinformation 1.4黑曲霉脂肪酶基因克隆與表達(dá)黑曲霉AS3. 350總RNA的提取、cDNA的制備與純化按照試劑 盒說明書進(jìn)行，質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物酶切、連接、熱激法轉(zhuǎn)化、 原生質(zhì)體-PEG轉(zhuǎn)化法及轉(zhuǎn)化子篩選等均采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方 法進(jìn)行15。1. 5黑曲霉工程菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的優(yōu)化L5.1含不同信號(hào)肽質(zhì)粒的構(gòu)建分別設(shè)計(jì)弓I 物 pCAMBIA-F 和 pCAMBIA-Scbh I -R； pCAMBIA-F 和 pCAMBIA-SANL-R 以 pCAMBIA-PgpdA-SglaA-H3 為模板擴(kuò)增。 將含有不同信號(hào)肽的目的基因與載體連接構(gòu)建 pCAMBIA-P

11、glaA-Scbh I -H3 和 pCAMBIA-PglaA-SANL-H3 重組 質(zhì)粒。將不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黑曲霉宿主，通過對(duì)酶活力的測(cè)定和 SDS分析，選擇最優(yōu)的黑曲霉系統(tǒng)表達(dá)信號(hào)肽。含不同啟動(dòng)子質(zhì)粒的構(gòu)建設(shè)計(jì)引 物 pCAMBIA-PglaA-F 和 pCAMBIA-PglaA-R 以 pCAMBIA-PgpdA-SglaA-H3為模板擴(kuò)增。將PglaA啟動(dòng)子與載 體連接構(gòu)建pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入黑曲 霉宿主，通過酶活力的測(cè)定和SDS分析，選擇最優(yōu)的 黑曲霉系統(tǒng)表達(dá)啟動(dòng)子。L6黑曲霉工程菌的活化與發(fā)酵培養(yǎng)將4七保藏的菌種劃線到潮霉素B抗性質(zhì)量濃度為 200

12、ug/mL的PDA平板上，30T培養(yǎng)4d,用無菌水沖洗苑子 做成抱子懸液，充分振蕩30min。按0. 8%的接種量接入到75mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30. 150r/min搖床培養(yǎng)6do發(fā)酵培 養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉50,玉米漿30,豆粕粉20。1.7黑曲霉脂肪酶的別離與純化收集發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液，用300目的過濾篩濾去菌絲體, 將粗酶液于10000r/min離心lOmin,保存上清液，再用 0. 22um的微濾膜進(jìn)行微濾。將粗酶液用鍥柱親和層析樹脂 純化，收集純化的酶液，透析去除高濃度咪哇獲得純化后的 酶溶液。L8脂肪酶的酶活力測(cè)定方法利用對(duì)硝基苯酚乙酸酯(pNPA)作為底物進(jìn)行脂肪酶酶活

13、力 的檢測(cè)。脂肪酶能夠水解pNPA產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(p-NP)。在 pH7. 0, 40(條件下，Imin釋放1 nmol的p-NP為1個(gè)酶活 力單位。1. 9黑曲霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)表征1. 9. 1酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性在不同溫度(2560t)下，通過測(cè)定脂肪酶ANL-H3催化 pNPA的水解活性來確定酶的最適反響溫度。將最適溫度條件 下的酶活力定義為100機(jī) 將酶溶液分別放置于不同溫度 (25-60)下孵育2h,每隔20min取樣檢測(cè)酶液的水解活性， 觀察ANL-H3的熱穩(wěn)定性。將放置Oh酶液的酶活力定義為 100%o9. 2酶最適反響pH及pH穩(wěn)定性在不同pH值(pH5.09.0)下，使用

14、pNPA作為底物測(cè)定脂肪 酶ANL-H3的水解活性來確定酶的最適pHo在4。(2條件下， 將酶液分別置于(PH5.09.0)的緩沖溶液中2h,每隔20min 取樣測(cè)定酶液的水解活性，觀察ANL-H3的pH穩(wěn)定性。將放 置Oh的酶液的酶活力定義為100%。各pH緩沖體系分別為： 50mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(pH5. 0 5. 5)； 50mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH6. 08.0) ； 50mmol/LTris-HCl 緩沖溶液(pH8.59. 0)oL9.3酶的催化底物特異性以不同碳鏈長度脂肪酸(C2C16)的對(duì)硝基苯酚酯為底物， 在4(TC, pH7.0的條件下測(cè)水解活性

15、。將最高酶活力定義為 100%o9. 4金屬離子對(duì)酶活性的影響在酶溶液中分別加入終濃度為1和5mmol/L的金屬離子(Na+、 Mn2+、Ca2+、K+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+和 Zn2+),在 4 放置l.5h,隨后測(cè)定脂肪酶ANL-H3催化pNPA的酶活力，以 未添加金屬離子處理的酶液作為對(duì)照組。計(jì)算相對(duì)酶活力， 將對(duì)照組的酶活力定義為100%。9. 5有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響在標(biāo)準(zhǔn)反響體系中分別加入5%、10%的有機(jī)溶劑(甲醇、乙庸、 丙酮、DMF、DMS0和四氫陜喃)，在4七放置L5h,測(cè)定脂肪 酶ANL-H3催化pNPA的酶活力，以不加有機(jī)溶劑的酶液作為 對(duì)照組。計(jì)算相

16、對(duì)酶活力，將對(duì)照組的酶活力定義為100%。 1.10黑曲霉脂肪酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定在最正確測(cè)定條件下，計(jì)算黑曲霉脂肪酶ANL-H3在不同pNPA 濃度下(1100mmol/L)的反響初速度。利用軟件0rigin8. 5 非線性擬合(參考Michaelis-Menten方程)得到米氏常數(shù)Km 和最大反響速率Vmaxo2結(jié)果與討論黑曲霉脂肪酶基因的克隆及工程菌的構(gòu)建利用生物學(xué)信息庫信息分析和全基因組檢索發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功 能與酶類似的同源酶編碼序列和一些未探究的編碼片 段，對(duì)黑曲霉全基因組中脂肪酶功能基因進(jìn)行挖掘篩選，選 取了 8個(gè)來源于黑曲霉，分子質(zhì)量為2040kDa的黑曲霉脂 肪酶基因。以黑曲霉AS3

17、.350的cDNA為模板，對(duì)該8個(gè)基 因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并命名為H1H8。重組質(zhì)粒pCAMBIA-H 1(-8) 轉(zhuǎn)化在黑曲霉MA中，獲得Hl(-8)重組黑曲霉工程菌，命名 為 MA-H1(-8)o高活力黑曲霉脂肪酶工程菌的篩選檢測(cè)8個(gè)黑曲霉工程菌MA-Hl(-8)發(fā)酵10d的上清液的脂肪 酶活力，結(jié)果如圖1所示。轉(zhuǎn)化子MATI2和MATI3的酶活力 較高，最高酶活力分別為1.37和L41U/mL。分別取重組脂 肪酶轉(zhuǎn)化子酶活力最高的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS分析， MA-H2、MA-H3的酶活力最高，相應(yīng)泳道中目的蛋白條帶也較 粗，說明了這2個(gè)重組黑曲霉菌株有較高的蛋白表達(dá)量，考 慮到最高酶活力以

18、及發(fā)酵周期長短等因素，最終選擇黑曲霉 脂肪酶ANL-H3基因作為目標(biāo)脂肪酶基因進(jìn)行后續(xù)的優(yōu)化研 究。圖1黑曲霉工程菌發(fā)酵上清液的酶活力情況Fig. lEnzymeactivityinfermentationsupernatantofA.nig erengineeringstrain3黑曲霉脂肪酶基因信號(hào)肽和啟動(dòng)子的優(yōu)化信號(hào)肽對(duì)蛋白質(zhì)的外源表達(dá)具有非常關(guān)鍵的影響，信號(hào)肽連 接目的蛋白形成1個(gè)蛋白嵌合體，最終的分泌效率受到其構(gòu) 型、外表電荷分布和分子質(zhì)量等因素的影響16。擴(kuò)增帶有 cbhl信號(hào)肽和ANL信號(hào)肽的目的基因，構(gòu)建 pCAMBIA-PglaA-Scbh I -H3 和 pCAMBIA-P

19、glaA-SANL-H3 重組 質(zhì)粒，將質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)入黑曲霉宿主。經(jīng)酶活力測(cè)定，以glaA. cbh I和ANL為信號(hào)肽的脂肪酶活力分別為1.41、L12和 0.57U/mL。因此選擇glaA為最優(yōu)的黑曲霉系統(tǒng)表達(dá)信號(hào)肽。 以黑曲霉cDNA為模板擴(kuò)增PglaA啟動(dòng)子，構(gòu)建 PCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒片段轉(zhuǎn)入黑曲霉 宿主，以PglaA為啟動(dòng)子的重組工程菌的蛋白表達(dá)量更高, 而且其脂肪酶酶活力為1.68U/mL,比以PgpdA為啟動(dòng)子的重 組菌的酶活力高，因此選擇PglaA為最優(yōu)的黑曲霉系統(tǒng)表達(dá) 啟動(dòng)子。通過插入基因的修飾以提高黑曲霉脂肪酶表達(dá)量的 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終選

20、擇pCAMBIA-PglaA-SglaA-H3重組質(zhì)粒進(jìn) 行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。2. 4黑曲霉脂肪酶的別離與純化利用銀離子親和層析柱純化酶蛋白，洗脫下來的蛋白溶液經(jīng) 超濾管（lOkDa）超濾除鹽和濃縮，純化后脂肪酶的比活力達(dá) 31. 44U/mg,純化倍數(shù)為65.5倍，但酶活力的回收率較低, 僅為7. 84%o5黑曲霉脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)5. 1酶最適溫度和溫度穩(wěn)定性在不同的溫度下，ANL-H3的酶活力變化結(jié)果如圖2所示。在 2545, ANL-H3活性隨著溫度升高逐漸增加,ANL-H3的 最適溫度是45T。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高，酶活力顯著下降。圖2溫度對(duì)黑曲霉脂肪酶ANL-H3活性的影響Fig.2EffectsoftemperatureontheactivityofANL-H3 進(jìn)一步測(cè)定了 ANL-H3在不同溫度條件下保持2h酶殘留的活 力，以考察其熱穩(wěn)