家蠅抗菌肽分子結(jié)構(gòu)及抗菌譜研究

1、家蠅抗菌肽分子布局及抗菌譜研究周義文申萍涂植光尹一兵陳輝孟江萍王小中陳如山盧亮陳正庚【關(guān)鍵詞】家蠅抗菌肽；抗菌譜；分子布局；氨基酸測序KEYRDSusadestiaantibaterialpeptide;Antibaterialspetra;leularstruturefantibaterialpeptide;Ainaidsequening抗生素的普及應(yīng)用，耐藥菌株和多重耐藥菌株日益增長，臨床抗熏染治療已面對嚴肅挑釁，探求廣譜高效的抗細菌、抗病毒藥物，仍舊是一個非常困難的使命?？咕?antibaterialpeptides)有非特異性地抗細菌、真菌、病毒等病原體作用，還大概具有抗腫瘤細胞的作

2、用1，2，是一類具有生長潛力的新型藥物。蠅生長在腐物、糞便和垃圾等含有大量細菌的惡劣情況中，其自身卻不會由于熏抱病原菌而引起殞命，這說明蠅應(yīng)該對病原微生物有強盛的免疫力。對家蠅資源的使用外洋已投巨資作為高科技財產(chǎn)舉行開拓，我國還處在起步階段。本研究從家蠅幼蟲體內(nèi)分散到了一種廣譜抗菌活性肽，并測定了其抗菌譜和部門氨基酸序列，現(xiàn)報道如下。1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1菌株和家蠅(1)尺度菌株大腸埃希菌AT25922、銅綠假單胞菌AT27853和金葡菌AT25923購自衛(wèi)生部臨床查驗中央。(2)臨床分散菌株銅綠假單胞菌(P.aerugi-nsa)、大腸埃希菌(E.li)、傷寒沙門菌(S.typhi)、平凡變形菌

3、(P.vulgaris)、異形檸檬酸桿菌(.diver-sus)、肺炎克雷伯菌(K.pneuniae)、暗溝腸桿菌(E.laa)、福氏痢疾桿菌(S.flexneri)、表葡菌(S.epideridis)、耐甲氧西林金葡菌(etheillinResistantStaphylusaureus，RSA)和白念珠菌(.albians)均為臨床送檢標本中分散菌株(重慶醫(yī)科大學(xué)熏抱病學(xué)研究所提供)。(3)家蠅為田野捕捉人工多代生殖的種群。1.2重要試劑苯甲磺酰氟(PSF)由上海生工ARES分裝，聚乙二醇為上?；瘜W(xué)試劑總廠產(chǎn)物，氨芐西林藥敏紙片為北京天壇生物所產(chǎn)物，SephadexG50(Siga公司)，卵

4、白質(zhì)標識表記標幟(BIFerentas公司)，酵母抽提物、胰卵白胨(xid公司)，兩性離子緩沖劑、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺和四甲基乙二胺(ARESD公司)。1.3重要試劑配制緩沖液A：0.1l/LpH6.8Tris-Hl緩沖液，含尿素2.0l/L，苯甲基磺酰氟化物0.1l/L，EDTA2l/L；緩沖液B：0.1l/LpH6.8磷酸鹽緩沖液，PSF0.1l/L，EDTA0.02l/L；緩沖液：0.1l/LpH6.8磷酸鹽緩沖液。1.4重要東西X-A108T碎冰機(廣東番禺星威機器廠)，UF3TG超濾柱，.10000(illipre公司)，透析袋(Siga公司)，PharaiaLKB2152柱層析系列

5、(瑞士BRA公司)，Agilentll00series高效液相色譜儀(美國)，Lihrspher18色譜柱(漢邦公司)，PRTEINPAR300色譜柱(美國aters公司)。1.5免疫誘導(dǎo)3把盛有乙醚的造就皿放在蠅籠內(nèi)，使蠅麻醉。然后用沾有細菌懸液(大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金葡菌)的不銹鋼針刺透體壁，立即放入另一籠內(nèi)使其清醒。刺傷后豢養(yǎng)24h。1.6構(gòu)造液制備家蠅1.0g加液氮5g的比例混淆，敏捷用研缽研磨，加少量4緩沖液A，繼承研磨成糊狀，以1g構(gòu)造加緩沖A10l的比例混勻，4下50000g離心60in，取上清液-80冰凍留宿，室溫下融化，4下50000g離心60in，取上清液裝入分子量截

6、留值為1200U的透析袋內(nèi)，包埋于聚乙二醇中，在4下透析留宿。1.7抗菌肽純化4待測樣品溶液用UF3TG超濾柱以50000g離心超濾，在SephadexG50色譜柱加樣12l，用活動相溶液以1.0l/in的流速舉行洗脫，在214n檢測波長下，舉行樣品的部門網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)的樣品真空冷凍濃縮，反相高效液相半制備柱進一步分散純化，闡發(fā)柱闡發(fā)。按照色譜柱型號差異決定上樣量和流速，半制備柱為1.02.0l，流速為1.0l/in；闡發(fā)柱一樣平常為10100l，流速為0.5l/in；檢測波長為214n。將網(wǎng)絡(luò)樣品真空冷凍枯燥，濃縮后加雙蒸水溶解，使體積為原體積的1/10，用Lry法舉行卵白定量。1.8稀釋法抗菌

7、試驗2，31.9氨基酸測序5抗菌肽的PAGE膠塊脫色后置于真空枯燥器中枯燥20in，然后參加510g/L的胰卵白酶液，4冰箱中安排40in后，加10l25l/L碳酸氫銨緩沖液，于37溫育留宿。用5%TFA于40提取酶切肽段；再用同體積的AN-TFA溶液于30提?。荒┝擞肁N超聲提取一次；歸并3次提取液，真空枯燥器枯燥?？菰锖蟮臉悠酚肨FA溶液溶解。用裝備有毛細管液相色譜和納升噴霧源的納升電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Nan-ESI-Q-TF2-S/S)技能測定肽段的質(zhì)譜圖，確定抗菌肽氨基酸序列。1.10檢索數(shù)據(jù)庫所測定得的質(zhì)譜圖用irass的專用軟件asSeq直接推導(dǎo)出肽段序列，按照肽段的

8、氨基酸序列用SpetruList通過ast查詢NBI數(shù)據(jù)庫，建立其一級布局。2效果2.1家蠅抗菌肽抗菌譜斷定效果用紙片瓊脂擴散法即KB法(Kirby-Bauerethd)檢測有抗菌活性的身分，再用微量稀釋法(irdilutintest)測定最小抑菌濃度(inialinhibitrynentratin，I)。實行效果表現(xiàn)，分散到的家蠅抗菌肽分子量約9.0kU，具有顯著的廣譜抗菌活性，對革蘭陰性桿菌、革蘭陽性球菌和真菌均有按捺作用。該抗菌肽對11種臨床分散菌株的I在2.2213.33l/L(20120g/l)之間。家蠅抗菌肽對大腸埃希菌的抗菌活性相對較強，而對陽性球菌和其他腸桿菌的抗菌活性相對較弱

9、，對白念珠菌的抗菌活性最弱。在比較組，氨芐西林對10種臨床分散菌株的I在21.5486.16l/L(832g/l)之間。臨床分散菌株傷寒沙門菌、福氏痢疾桿菌敏感，大腸埃希菌、異形檸檬酸桿菌、暗溝腸桿菌中敏，銅綠假單胞菌、平凡變形菌、肺炎克雷伯菌、表葡菌和耐甲氧西林金葡菌(RSA)耐藥。試驗組和比較組對臨床分散菌株的I見表1。2.2氨基酸測序抗菌肽被胰卵白酶水解后得到5個隨機酶解片斷，隨機酶解片斷用Nan-ESI-S/S技能舉行質(zhì)譜闡發(fā)，測定出的質(zhì)譜信息借助irass的專用軟表1家蠅抗菌肽對臨床分散菌株的I用SpetruList通過ast查詢NBInr數(shù)據(jù)庫，經(jīng)檢索未創(chuàng)造有與之序列相匹配的卵白質(zhì)

10、，可以證實本研究分散純化到的家蠅抗菌肽是一個新的抗菌肽，定名為家蠅抗菌肽(usadestiaantibaterialpeptide，DAP)。3討論由于抗生素的大量應(yīng)用和濫用，臨床耐藥菌株和多重耐藥菌株的產(chǎn)生不竭增長，抗熏染治療形勢非常嚴肅。特殊是比年來新型病原體的不竭出現(xiàn)和爆發(fā)盛行，探求廣譜高效抗細菌、抗病毒藥物仍舊刻不容緩。比年來生物抗菌肽的創(chuàng)造為抗熏染藥物的開拓開拓了一個新途徑。自然抗菌肽是生物體免疫體系產(chǎn)生的一類對抗外界病原體熏染的小分子肽，普及存在于昆蟲、植物、動物及人體內(nèi)。研究創(chuàng)造抗菌肽具有非特異性抗細菌、抗真菌的本領(lǐng)6，7，特殊是對多重耐藥菌有按捺作用，有望成為治療耐藥性細菌的新

11、型藥物或前體藥物。蠅具有較強抗熏染本領(lǐng)810，家蠅抗菌肽的研究那么少有報道。本文對家蠅的研究，顛末一系列的卵白分散質(zhì)純化技能得到了純化的具有較強抗菌活性的蠅家抗菌肽dAP。該抗菌活性肽與文獻報道通過RT-圖1家蠅抗菌肽胰卵白酶水解的肽段1的質(zhì)譜圖PR克隆并表達的抗大腸埃希菌活性的天蠶素分子布局完全差異11，用SpetruList通過ast查詢NBI數(shù)據(jù)庫，經(jīng)檢索未創(chuàng)造有與之序列相匹配的卵白質(zhì)，可以證實本研究分散純化得到的家蠅抗菌肽是一個新的抗菌肽。該抗菌肽的創(chuàng)造為探求高效廣譜的抗菌物質(zhì)提供了一個新途徑?！緟⒖嘉墨I】1PratesV,SfraL,Regis.TheNR-derivedslutin

12、struturefaneatiniantiirbialpeptidefrtheskinseretinftheanuranHylapuntataJ.JBilhe,2022,279(13):1301813026.2uugluKY,IngberA,GileadL,etal.aggttherapyfrthetreatentfintratableundsJ.IntJDeratl,1999,38(8):623627.3urthDD,LkeyTD,RenisHE,etal.Indutinferpin-likeandattain-likeantibaterialbutntantiviralativityinH

13、elithisviresenslarvaeJ.BiheBiphyResun,2022,200(1):3544.4孫毓慶主編.闡發(fā)化學(xué)(第四版).北京：人民衛(wèi)生出書社，1999：272300.5王紅霞，靳寶峰，王杰，等.納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技能對阻斷泛素通路誘導(dǎo)凋亡相干卵白的斷定J.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，2002，34(5)：630634.6ilnerS,rtegaR.ReduedantiirbialpeptideexpressininhuanburnundsJ.Burns,1999,25(5):411413.7BalsR,angX,eegallaRL,etal.usebeta-defensin

14、3isaninduibleantiirbialpeptideexpressedintheepitheliafultiplergansJ.InfetIun,1999,67(7):35423547.8TaniaiK,TitaS.AnvellipplysahariderespnseeleentintheBbyxrierpinBprterJ.JBilhe,2000,275(18):1317913182.9rivelJ,RedekerV,LeaerJP,etal.Pneriins,neantibaterialandinsetiidalpeptidesfrthevenftheantPahyndylageldiiJ.JBilhe,2001,276(21):1782317829.10AlyR,GrantD,ahler-SlaskyY.Saharyeserevisiaeellsharbringthegene