細胞核的制備實驗原理及步驟

1、實驗3 細胞核的制備、鑒定原理為研究細胞核及其組成成分，如：染色質(zhì)、DNA及核內(nèi)小分子RNA等，需分離制備細胞核。對于所分離的細胞核，要求保持形態(tài)上的完整性，核內(nèi)成分不滲漏，不污染細胞質(zhì)等其他細胞器，并且能有較高的得率。根據(jù)實驗的需要可以選擇不同的分離細胞核的方法，通常用來分離細胞核的方法主要有二大類：第一大類有機溶劑的方法，經(jīng)Allfrey改進的方法，主要包括如下操作過程：（1）將組織冷凍干燥；（2）研碎細胞；（3）利用不同比重有機溶劑使細胞核與細胞質(zhì)其他成分分開。這類方法可以防止細胞核內(nèi)水溶性的成分丟失，同時也能阻止細胞質(zhì)的某些成分滲入細胞核內(nèi)。雖然有這些優(yōu)點，但這種方法不能保持細胞核的正

2、常形態(tài)，某些酶活力可能因變性而喪失。所以一般采用非水溶劑分離細胞核，常用于定量分析細胞核的生化成分及其他一些特殊的研究目的。第二大類，1956年由Chauveau等人提出，用高密度介質(zhì)來分離細胞核。由于細胞核的比重較大，在高密度介質(zhì)中，在高速離心條件下被沉降下來，從而達到細胞核與細胞質(zhì)其他成分分開的目的。Chauveau的方法是將動物肝臟直接在2.2mol/L蔗糖溶液中勻漿，然后高速離心40 000g 1小時，細胞核沉淀在底部，線粒體和完整細胞，包括紅血球漂浮在液面，通過一步操作好可分離得到細胞核。其后又有不少研究工作者對此方法作了改進，例如加進氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀等，改變分離介質(zhì)的滲透壓；

3、選擇介質(zhì)的pH以及不同的高密度蔗糖溶液離心方法等。這樣減少了細胞核的脆性，防止聚集，維持恒定的pH，就能保持細胞核的精細結(jié)構(gòu)。雖然這一方法比較簡單，能得到較高純度的細胞核，也已被廣泛采用，但是實驗需要高速離心機，這在一般實驗室不能進行，另外此方法要用高濃度的蔗糖，如果要分離大量的細胞核，也很不經(jīng)濟。目前在一般實驗室中更多的是用檸檬酸分離細胞核，在檸檬酸介質(zhì)中分離細胞核可以顯蓍地除去附著在細胞核膜上的細胞質(zhì)成分。由于檸檬酸降低了溶液pH，這樣可以減少細胞核的破碎率，并能分離得到較高分子量的核酸，可能是由于核糖核酸酶（一種酸溶性蛋白）被檸檬酸除去，以及二價陽離子被檸檬酸絡(luò)合所致。檸檬酸的濃度對分離

4、細胞核的質(zhì)量有較大影響。通常在較低的pH時，可以得到較高純度的細胞核。但在過酸條件下，可能引起細胞核成分的改變和酶的失活。為了研究細胞核內(nèi)核酸，一般常在pH4，甚至在pH2.5時分離細胞核。如為了分離細胞核內(nèi)的酶，則需要較溫和的條件，此時可以在pH66.2的極稀檸檬酸溶液中分離細胞核。細胞核純度的鑒定，可以從兩方面進行，用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡進行形態(tài)觀察和生物化學(xué)方法進行酶活力的測定，某些細胞質(zhì)的酶（如過氧化氫酶、堿性磷酸酯酶、淀粉酶和脂酶等），在純細胞核制品活力應(yīng)較低或檢查不出來。本實驗以動物肝臟為材料用檸檬酸的方法分離細胞核，用光學(xué)顯微鏡觀察細胞核的形態(tài)。操作方法一、細胞核的分離實驗前2

5、4小時內(nèi)饑餓動物使成空腹，然后將動物斷頭殺死，取出肝臟，在生理鹽水溶液中充分漂洗，用濾紙把液體吸干，將肝臟放入-20低溫冰箱過夜待用。取3g肝臟剪成小塊，按1：10（重量：體積）加入1.5%檸檬酸溶液，用玻璃勻漿器或組織搗碎器，破碎細胞，（注意不要把細胞核破壞）如果用高速組織搗碎機，要搗3次，每次510秒鐘。（轉(zhuǎn)速為10 00020 000r/min）然后把搗液用4層紗布過濾，濾液以800900r/min離心10分鐘，棄去上清液，沉淀再用1.5%檸檬酸溶液洗1次，然后將沉淀再懸浮于1mL0.25mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸溶液中制成懸液。將離心管內(nèi)預(yù)先加好8mL0.88mol/L蔗糖-1.5

6、%檸檬酸溶液，并將上述懸液置于0.88mol/L蔗糖檸檬酸溶液之上以1 000r/min離心10分鐘，即可得到較純的細胞核沉淀。二、細胞核純度鑒定用玻璃棒碰一下細胞核沉淀與完整肝細胞，分別放在載玻片上輕涂，然后加一滴臺盼藍（trypan bluc）染色液于玻片，即可在光學(xué)顯微鏡下進行觀察，高純度的細胞核制品必須在計數(shù)400個核中不能有個完整的細胞；在1 000個細胞核中不能有一個帶有細胞質(zhì)的核。試劑和器材試劑 1. 0.9%氯化鈉溶液 2. 1.5%檸檬酸溶液 3. 0.25mol/L蔗糖-1.5%檸檬酸溶液 4. 0.88mol/L蔗糖-1.55檸檬酸溶液 5. 臺盼藍染色液：取0.4g臺盼藍，0.81g氯化鈉，0.06g磷酸二氫鉀和0.05g羥基苯甲酸鹽于95ml，重蒸水中