細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課

1、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)課程組成員：楊慈清 、李虎、王紅霞、許重潔辦公電話：3029114新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞融合技術(shù)與染色體提前凝集標(biāo)本制備實(shí)驗(yàn)一 動物細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)三 小鼠MEF飼養(yǎng)層的制備實(shí)驗(yàn)五 原生質(zhì)體的分離、純化和活力鑒定實(shí)驗(yàn)四 MS培養(yǎng)基的配制和愈傷組織誘導(dǎo)目 錄實(shí)驗(yàn)一 動物細(xì)胞的培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆崭蔁釡缇ā駸釡缇ê蜑V過除菌法的操作。了解化學(xué)消毒法的使用方法。了解傳代細(xì)胞的傳代方法及操作過程，學(xué)習(xí)觀察體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況及細(xì)胞增殖動力學(xué)測定的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)技術(shù)。要使細(xì)胞能在體外長期生長，必須滿足兩個(gè)基本要求

2、：一是供給細(xì)胞存活所必需的條件，如適量的水、無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關(guān)的生長因子、氧氣、適宜的溫度，注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調(diào)節(jié)。二是嚴(yán)格控制無菌條件。顯微鏡下的培養(yǎng)細(xì)胞三、實(shí)驗(yàn)方法1、玻璃器材的清洗處理方法2、塑料器材的清洗處理方法3、橡皮器材的清洗處理方法4、金屬器材的清洗處理方法5、細(xì)胞的消化傳代方法方法1、玻璃器材的清洗處理方法清潔液浸泡或用2%磷酸三鈉或潔消精浸泡過夜自來水沖10次培養(yǎng)瓶再用三蒸水浸泡過夜晾干包裝滅菌單蒸水洗2次晾干備用備用刷洗浸泡2、塑料器材的清洗處理方法用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡過夜（單用或交叉處理）水洗10次單蒸水2次紫外線或輻射滅菌備用三

3、蒸水浸泡過夜晾干刷洗浸泡3、橡皮器材的清洗處理方法5%NaOH煮10 20水洗4%鹽酸煮10 20單蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干備用水洗810次刷洗浸泡金屬器材的清洗處理方法紙擦去表面的油脂洗衣粉煮沸或用1%碳酸氫鈉煮沸15分鐘水洗95%酒精紗布擦干包裝滅菌4、金屬器材的清洗處理方法吸除或倒掉舊培養(yǎng)液加入2mL，無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時(shí)，倒掉消化液繼續(xù)作用23分鐘顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止消化5、細(xì)胞的消化傳代方法加入完全培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)分瓶培養(yǎng)

4、細(xì)胞的消化傳代方法生長細(xì)胞形態(tài)四、作業(yè)與思考1簡述細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作程序及注意事項(xiàng)。2細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功的關(guān)鍵要素是什么?3簡述體外培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)特征及其生長階段。4繪制細(xì)胞生長曲線圖。5繪制細(xì)胞分裂指數(shù)圖。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)胞融合技術(shù)與染色體提前凝集標(biāo)本制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過細(xì)胞融合技術(shù)，初步了解染色體提前凝集標(biāo)本制備原理、方法及間期細(xì)胞三種時(shí)相的提前凝集染色體特點(diǎn)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 M期細(xì)胞內(nèi)有某種促進(jìn)染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細(xì)胞融合和染色體技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立了制備染色體提前凝集標(biāo)本的方法。即讓M期細(xì)胞與間期（I期）細(xì)胞融合，從而誘導(dǎo)I期細(xì)胞染色質(zhì)提前濃縮成染色體。形成的這種染色體稱提前

5、凝集的染色體(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。 三、實(shí)驗(yàn)方法1、細(xì)胞融合方法 2、PCC誘導(dǎo)和觀察 收集1瓶M期細(xì)胞、消化一瓶貼壁細(xì)胞混合離心用Hanks液洗1次離心棄上清（吸干）輕彈使細(xì)胞分散90s后1、細(xì)胞融合方法 37滴加50PEG0.5ml（12滴）加入2ml 1640（含10血清）加一滴秋水仙素（10gml ）分別在5min、15min、20min觀察細(xì)胞融合加入5ml1640洗一次（不要吹打）離心細(xì)胞融合90分鐘后離心棄上清加入0.075mol/lKCl8ml混勻3725分鐘加入1ml固定液混勻離心棄上清2、PCC誘導(dǎo)和觀察 加7ml固定

6、液固定20min離心棄上清加0.5ml固定液滴片（冰、高、烤）Giemsa染色12min水沖、晾干、鏡檢四、作業(yè)與思考根據(jù)PCC圖像的觀察，試說明對于理解細(xì)胞周期和DNA復(fù)制有什么啟示?簡述細(xì)胞融合的原理。PCC實(shí)驗(yàn)的主要意義是什么？實(shí)驗(yàn)三 小鼠MEF飼養(yǎng)層的制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握常用飼養(yǎng)層的制備原理和方法。2.鞏固細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)的的技術(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)原理 胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells,ES）的體外培養(yǎng)要求增殖的同時(shí)保持未分化的狀態(tài)，因此，我們要進(jìn)行體外培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，必須環(huán)境中滿足兩個(gè)條件：細(xì)胞生長因子和分化抑制因子。體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞可以分泌細(xì)胞生長因子和分化抑制因

7、子，前者可以促進(jìn)ES細(xì)胞的增值，后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用來制作飼養(yǎng)層的細(xì)胞有多種，其中原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）取材方便，易于鋪層，分泌能力強(qiáng)而成為ES細(xì)胞首選的飼養(yǎng)層細(xì)胞。 將原代培養(yǎng)的MEF細(xì)胞進(jìn)行傳代，多為36代，這樣不僅可以使得MEF細(xì)胞的純度較高，而且生長狀態(tài)也很好。在制備飼養(yǎng)層前將MEF細(xì)胞用絲裂霉素C或射線照射預(yù)處理，抑制DNA的復(fù)制使其在保持分泌功能的基礎(chǔ)上失去增值能力，以免與ES的生長發(fā)生競爭。在具體實(shí)驗(yàn)中，MEF細(xì)胞的原代分離時(shí)胎齡的選擇，作為飼養(yǎng)層使用時(shí)細(xì)胞代數(shù)的選擇，絲裂霉素處理的濃度都

8、會影響飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系的質(zhì)量。胎齡過大，則成纖維細(xì)胞的成分降低，分離效率低下，且易混雜其他細(xì)胞，難以去處。若胎齡過小，胚胎形態(tài)小，軀干部分不易分辯，操作困難。細(xì)胞代數(shù)過多，則出現(xiàn)衰老征象；細(xì)胞代數(shù)過少，不容易純化。絲裂霉素的濃度處理和處理時(shí)間直接影響細(xì)胞的狀態(tài)。二、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1.MEF的獲取： （1）激素處理小鼠，同期發(fā)情和超數(shù)排卵 （2）2：1合籠過夜 （3）取出有陰道栓的開始記時(shí)間為0.5天 （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠為實(shí)驗(yàn)材料 （5）無菌 取出胚胎 （6）去除頭、尾、內(nèi)臟和四肢，僅留軀干部 （7）用眼科剪刀剪成1mm3組織塊 （8）0.25%胰蛋白酶消化20min/室溫，

9、每隔5min振蕩 一次 （ 9）過濾（200目篩網(wǎng)）并收集濾液（含有單個(gè)的MEF）二、實(shí)驗(yàn)方法與步驟2.接種并進(jìn)行原代培養(yǎng) （1）細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照1*105個(gè)/ml接種于培養(yǎng)瓶中 （2）48小時(shí)換液，4-5天后傳代3.傳代培養(yǎng) （1）傳3-5代，并長滿瓶底部，并換液備用于第 二天處理4.絲裂霉素C處理細(xì)胞 （1）用20mg/L和10 mg/L以及空白組的絲裂霉 素C處理2.5-3.5小時(shí) （2）棄去含有絲裂霉素C培養(yǎng)液小鼠胚胎成纖維細(xì)胞顯微圖體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞二、實(shí)驗(yàn)方法與步驟5.沖洗 （1）PBS沖洗3-6次，去除殘余的絲裂霉素，加常 規(guī)培養(yǎng)液，在5天內(nèi)用于步驟66.常規(guī)胰蛋白酶消化

10、，重新接種，貼壁后即可以應(yīng)用 （1）常規(guī)胰蛋白酶消化 （2）單細(xì)胞懸液以1*106個(gè)/ml接種于經(jīng)過0.1%明 膠處理30min的培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)板中 （3）貼壁后即可以使用四、注意事項(xiàng)無菌操作吹打細(xì)胞時(shí)要小心，用力均勻用酶消化時(shí)注意時(shí)間，不可過渡五、作業(yè)與思考1.細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制MEF細(xì)胞生長曲線，連續(xù)7天，至少5天。分三個(gè)處理20mg/L和10 mg/L以及空白組2.做好原代培養(yǎng)工作，并在48小時(shí)換液時(shí)和4-5天傳代時(shí)，仔細(xì)觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)并記錄結(jié)果，分析產(chǎn)生結(jié)果的原因。3.設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)室的理想布局，并且將儀器配備入內(nèi)。4.掌握細(xì)胞培養(yǎng)過程中的常用方法。5. 如何盡可能的做到無菌操作 實(shí)

11、驗(yàn)四 MS培養(yǎng)基的配制和愈傷組織誘導(dǎo)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過掌握MS培養(yǎng)基母液配制及常用培養(yǎng)基的制備和滅菌方法，為植物組織培養(yǎng)準(zhǔn)備合適的營養(yǎng)條件；掌握植物外植體的消毒技術(shù)、離體培養(yǎng)的無菌操作和愈傷組織誘導(dǎo)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理 植物材料培養(yǎng)要獲得成功，并正常生長，培養(yǎng)基的成分是一個(gè)決定性因素，不同植物要求不同的培養(yǎng)基。 大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基由無機(jī)營養(yǎng)物、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和有機(jī)附加物等五類物質(zhì)組成。二、實(shí)驗(yàn)原理 由于細(xì)胞的全能性，在合適的生長條件下，一定濃度的細(xì)胞分裂素和生長素配比可以誘導(dǎo)植物的外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織，為進(jìn)一步再分化創(chuàng)造條件。植物細(xì)胞全能性三、實(shí)驗(yàn)材料與器具 高壓滅菌

12、鍋、普通及精密天平、玻璃器皿（燒杯、1000、500mL容量瓶、移液管、試劑瓶、1000、500、100 mL 三角瓶）、化學(xué)試劑。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、配制幾種母液（1）配制100倍1L MS大量元素母液NH4NO3 165g KH3PO4 17gKNO3 190g CaCl22H2O44gMgSO47H2O37g四、實(shí)驗(yàn)步驟 （2）配制MS微量元素母液 配制成100倍1L母液，母液。依次稱取KI 0.083g Na2MoO42H2O 0.025gH3BO3 0.62g CuSO45H2O 0.0025gMnSO4H2O 1.69gCoCl26H2O 0.0025gZnSO47H2O0.86g

13、四、實(shí)驗(yàn)步驟 （3）配制MS有機(jī)母液一般配制成100倍1L MS有機(jī)母液。依次稱取肌醇 10.0g 鹽酸硫胺素 0.01g煙酸 0.05g 甘氨酸 0.20g鹽酸吡哆醇 0.05g四、實(shí)驗(yàn)步驟 （4）配制MS鐵鹽母液一般配制成100倍lL MS鐵鹽母液。依次稱取EDTA二鈉 3.73g FeSO47H2O 2.78g四、實(shí)驗(yàn)步驟 2植物激素的配制 0.1mg/mL 的6-BA溶液：取25mg的6-BA，用少量1N的鹽酸溶解，再加蒸餾水定容至250mL。0.1mg/mL NAA：取25mg的NAA可溶于熱水中或用少量95%乙醇或少量1N的NOH溶解后，再加水定容至250mL。四、實(shí)驗(yàn)步驟 3培養(yǎng)

14、基的配制 分別吸取母液各10mL及6-BA 和NAA 母液各20mL，混合后，再加蔗糖至終濃度3%，用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0；加入瓊脂6g。最后加蒸餾水定容至于1L。然后用組織培養(yǎng)用封口膜封上，扎緊后滅菌 。四、實(shí)驗(yàn)步驟 4培養(yǎng)基滅菌和分裝 將分裝好的培養(yǎng)基放在高壓滅菌鍋中，加熱，待壓力上升到0.5kg/cm2時(shí)，排凈冷空氣，關(guān)閉放氣閥繼續(xù)加熱使壓力穩(wěn)定在1.2kg/cm2，溫度為121的條件下，維持1520分鐘。滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至65左右，分裝，每100mL三角瓶裝40mL，共裝25瓶。四、實(shí)驗(yàn)步驟 5消毒液的配制次氯酸納消毒液：取30mL次氯酸納溶液，用蒸餾水定容至100mL?，F(xiàn)配現(xiàn)用

15、。75%的酒精：75mL的95%的酒精加水定容至95mL。四、實(shí)驗(yàn)步驟 6外植體的制備和接種 將發(fā)芽的零余子用次氯酸納消毒液或者75%的酒精消毒后移入超凈工作臺的無菌培養(yǎng)皿中，用解剖刀切取苗芽，然后將其接種在培養(yǎng)基上，一般每瓶接種4-5片苗芽?？焖俜夂闷靠?，并寫上接種日期。四、實(shí)驗(yàn)步驟 7愈傷組織的誘導(dǎo) 接種后的三角瓶置于24條件下，黑暗培養(yǎng)一周，然后在同樣溫度下分為光照和黑暗培養(yǎng)直至愈傷組織形成。五、注意事項(xiàng) 配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)eS04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合， 并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20-30min)，調(diào)pH值至5.5，防止FeS04結(jié)晶析出。五、注意

16、事項(xiàng) 因?yàn)楦邷販缇鷷档蚿H值（約0.2-0.3個(gè)pH值），配制時(shí)常提高pH值0.2-0.3。 接種時(shí)嚴(yán)格注意無菌操作。六、作業(yè)與思考1植物培養(yǎng)基為什么要分成母液分開配制。2. 分析實(shí)驗(yàn)中植物愈傷組織生長所需要的必要條件。實(shí)驗(yàn)五 原生質(zhì)體的分離、純化和活力鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)植物細(xì)胞原生質(zhì)體分離和純化的方法。 2.了解原生質(zhì)體活性鑒定的原理。二、實(shí)驗(yàn)原理 植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁后為原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞”，是開展基礎(chǔ)研究的理想材料。其中，酶解法分離原生質(zhì)體是一個(gè)常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，除去細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。由于原生質(zhì)體內(nèi) 部與外界環(huán)境之間僅隔一層薄薄的細(xì)胞膜，必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保持其完整性。 其次,還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時(shí)間及溫度等因素對分離原生質(zhì)體的影響。測定原生質(zhì)體的活性有多種方法。熒光素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法，F(xiàn)AD 本身無熒光，無極性，可透過完整的原生質(zhì)膜。一旦進(jìn)入原生質(zhì)體后，由于受到酯酶分解而產(chǎn)生具有熒光的極性