細胞生物學(xué)實驗

1、細胞生物學(xué)實驗 主講人:康美玲 單 位:棗莊學(xué)院生命科學(xué)系實驗一 血涂片的制備及細胞大小的測量一、實驗?zāi)康?.掌握血涂片的制備方法；2.認識紅細胞及各種白細胞的典型形態(tài)；3.掌握顯微測微尺的使用方法。二、實驗原理涂片技術(shù)是制備血液樣品最常用的技術(shù)。將血液樣品制成單層細胞的涂片標本，染色后可對血液中各種細胞形態(tài)進行形態(tài)觀察、細胞計數(shù)、細胞大小測量等工作。三、實驗用品1.器材:醫(yī)用一次性采血針、酒精棉球、鑷子、經(jīng)脫脂洗凈的載玻片 、雙凹片（推片） 。2.試劑:Wrights染液：Wrights色素粉末0.1g，溶于60 ml甲醇。 四、方法與步驟一.血涂片的制備與血細胞的觀察二.顯微測微尺的使用

2、采血前用70酒精棉球消毒人的指腹采血由于第一滴血中含單核白細胞較多，因此棄去第一滴血。推片：擠出第二滴血置于載玻片的右側(cè)再取另一張邊緣光滑的雙凹片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開成線狀。3045兩玻片的角度以3045為宜，輕輕將雙凹片向前勻速推進，即涂成血液薄膜。染色待涂片在空氣中完全干燥后，滴加數(shù)滴Wrights染液蓋滿血膜為止，染色3 min。然后滴加等量蒸餾水，使其與染液均勻混合，靜置5 min。用蒸餾水沖去染液，吸水紙吸干，鏡檢。 結(jié)果顯示淋巴細胞單核細胞嗜中性粒細胞嗜酸性粒細胞嗜堿性粒細胞顯微測微尺的使用顯微測微尺是用來測量在顯微鏡下所觀察到的物體的長

3、度、面積的工具，包括鏡臺測微尺、目鏡測微尺兩部分。在使用的過程中，鏡臺測微尺起標定作用，利用它可以確定目鏡測微尺旋鈕上每小格代表的實際長度。目鏡測微尺標定完成后，即可用于細胞樣品的測量。每個大格又可分為10個小格，每小格的實際長度為0.01mm總長0.1mm鏡臺測微尺總長1mm共分為10格目鏡測微尺可以通過旋轉(zhuǎn)旋鈕移動目鏡測微尺中交叉線的位置使用方法1.取下目鏡,將目鏡測微尺的刻度面向下放入目鏡中,旋上透鏡；2.將鏡臺測微尺蓋片面朝上放在載物臺上,用低倍鏡觀察,調(diào)節(jié)焦距看清鏡臺測微尺的刻度；3.移動鏡臺測微尺,同時轉(zhuǎn)動目鏡,使目鏡測微尺與鏡臺測微尺平行靠近,并將兩尺的“0”點刻度線或某刻度線對

4、齊.然后從左向右查看兩尺刻度線另一重合處,記錄重合線間目鏡測微尺與鏡臺測微尺的格數(shù).按下式計算目鏡測微尺每格等于多少微米。目鏡測微尺的標定 naX= MX:目鏡測微尺每格的實際長度a:鏡臺測微尺每格的實際長度n:鏡臺測微尺的刻度數(shù)。M:目鏡測微尺的刻度數(shù)。4.移去鏡臺測微尺，換血涂片，目鏡測微尺測量細胞所占小格數(shù)X目鏡測微尺每小格代表的實際長度=被測細胞的實際長度。實驗作業(yè) 1.繪制各種不同類型的血細胞,并說明它們的主要作用？ 2.任選20個紅細胞，測量其直徑，并計算出平均值. 實驗二 細 胞 凝 集 反 應(yīng) 一、實驗?zāi)康模?1. 學(xué)習(xí)制備土豆凝集素 2. 掌握細胞凝集反應(yīng)的實驗方法及細胞凝聚

5、的原理。 3. 觀察凝集的現(xiàn)象 Company Logo 二、 實驗原理 細胞質(zhì)膜外表面的一層黏性多糖物質(zhì)構(gòu)成的細胞全委會被在細胞間的聯(lián)系和識別、細胞的生長分化、免疫反應(yīng)及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要作用。 動物細胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖鏈伸向膜表面，它們是細胞識別、細胞免疫及細胞接觸抑制現(xiàn)象的必要組分。 凝集素是一類含糖的(少數(shù)例外)并能與糖專一性結(jié)合的蛋白質(zhì)，它具有凝集細胞和刺激細胞分裂的作用。凝集使細胞凝集是由于它與細胞表面的糖分子連接，在細胞間形成“橋”的結(jié)果。凝集素與糖分子結(jié)合有一定的專一性和結(jié)合價，并與細胞膜上受體的分布有關(guān)。 三、實驗儀器 顯微鏡、粗天平、載玻片、滴 管、 離心管

6、、離心機等. Company Logo土 豆 塊 莖四、實驗材料雞血細胞Company Logo五、實驗內(nèi)容與實施過程1.凝集素粗提液制備（50分鐘）： 用天平稱取去皮的土豆塊莖2g+10mlPBS緩沖液，浸泡2h粗提液中含有可溶性土豆凝集素。2.雞紅細胞懸液制備（35分鐘）： 以無菌方法抽取雞血注射器中抽取3.8%檸檬酸鈉1ml抽取雞靜脈血液2ml，用生理鹽水洗5次，每次2000r/min，離心5min，最后按壓積紅細胞體積用生理鹽水配成2%紅細胞液。實驗內(nèi)容與實施過程3.細胞凝集反應(yīng)現(xiàn)象的觀察與討論（50分鐘）：用滴管吸取土豆凝集素和2%紅細胞液各一滴，置載玻片上，充分混勻，靜置20min

7、后于低倍顯微鏡下觀察血球凝集現(xiàn)象。 本實驗過程很簡單，只需要將植物凝集素與紅細胞混合后用低倍顯微鏡觀察現(xiàn)象即可。具體如下：實驗組 凝集素1滴 紅細胞懸液1滴 對照組 PBS液1滴 紅細胞懸液1滴 實驗內(nèi)容與實施過程4、實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。共150分鐘。 實驗作業(yè) 1.細胞間凝集的原理是什么？ 2.簡圖表示血細胞凝集原理. 實驗總結(jié)1.為什么對照組有PBS液作對照呢？ 沒什么巧，因為凝集素中本身含PBS緩沖液，當含本身凝集素是不含PBS的，只是因為本實驗中凝集素的提取時用

8、到了PBS.實驗總結(jié)2.那么紅細胞懸液是怎么制備的呢？ 其實也不難，無菌抽取動物靜脈血液，當然血液抽出來后肯定要先加抗凝劑了，然后再加生理鹽水。那么怎么從血液中將紅細胞分離出來呢？想想，血液中有血清、紅細胞、白細胞和血小板，按道理來講紅細胞應(yīng)該最重吧(有待查證)，用離心機在2000r/min下離心5min，去掉上清液，得到的應(yīng)該就是紅細胞了，再加適量生理鹽水洗滌幾次后，加一定量是(按壓積紅細胞體積算)生理鹽水即可配成相應(yīng)濃度的紅細胞懸液了。備注凝集素是一類含糖、并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì),被認為與糖的運輸、儲存物質(zhì)的積累、細胞間的互作以及細胞分裂的調(diào)控有關(guān)。 實驗三 細胞膜的滲透性 一、實驗?zāi)康?/p>

9、：了解細胞膜的滲透性及各類物質(zhì)進入細胞的速度。 二、 實驗原理 細胞膜為一種半透膜，對物質(zhì)的通透具有選擇性。當紅細胞放入低滲溶液中時，細胞吸水膨脹而發(fā)生溶血。 當紅細胞放入含不同溶質(zhì)的等滲溶液中時，由于細胞膜對不同溶質(zhì)的透性不同，細胞發(fā)生溶血的時間也會不同，故發(fā)生溶血現(xiàn)象時間長短可作為測量物質(zhì)進入紅細胞速度的一種指標。 三、實驗儀器 離心機移液槍試管架試管 雞 血 四、實驗材料雞 血細 胞五、實驗內(nèi)容與實施過程1.雞血細胞懸液的制備：一份雞血+10份0.17mol/L氯化鈉，形成一種不透明的紅色液體，此即稀釋的雞血。2.低滲溶液：一支試管中，加入10ml蒸餾水+1ml稀釋的雞血，觀察溶液顏色的

10、變化？實驗內(nèi)容與實施過程3.雞紅細胞的滲透性觀察：在10種等滲溶液中觀察細胞溶血現(xiàn)象及時間。實驗內(nèi)容與實施過程4、實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。 實驗作業(yè) 將觀察到的現(xiàn)象列入下表，對實驗結(jié)果進行比較和分析。實驗作業(yè) 試管編號是否溶血時間結(jié)果分析1.10ml氯化鈉+1ml稀釋羊血2.10ml氯化銨+1ml稀釋羊血3.10ml醋酸銨+1ml稀釋羊血4.10ml硝酸鈉+1ml稀釋羊血5.10ml草酸銨+1ml稀釋羊血6.10ml硫酸鈉+1ml稀釋羊血7.10ml葡萄糖+1ml稀釋羊血

11、8.10ml甘油+1ml稀釋羊血 9.10ml乙醇+1ml稀釋羊血 10.10ml丙酮+1ml稀釋羊血實驗總結(jié) 溶血時間及現(xiàn)象的觀察比較困難，可采用離心輔助的方法來判別雞血在哪些等滲液中最易溶血，哪些較慢，做一些定性的分析。經(jīng)過離心之后，若上清液無色，證明在這個時間段血細胞沒發(fā)生溶血，若上清液略紅，證明有溶血發(fā)生。當然這個方法不很精確，但卻快速、便于觀察。 實驗四 線粒體和液泡系的 超活染色與觀察一、實驗?zāi)康模?.觀察動、植物活細胞內(nèi)線粒體和液泡系的形態(tài)、數(shù)量及分布；2.掌握細胞超活染色技術(shù)及原理；3.學(xué)習(xí)一些細胞器的超活染色技術(shù)。 二、 實驗原理 活體染色：應(yīng)用無毒或毒性較小的染色劑真實地顯

12、示活細胞內(nèi)某些細胞結(jié)構(gòu)而又很少影響細胞生命活動的染色方法。 中性紅：中性紅對高爾基體、液泡系的染色具有專一性。只將活細胞中的液泡系當成紅色，細胞核與細胞質(zhì)完全不著色(這可能與液泡系中某些蛋白質(zhì)有關(guān)。詹納斯綠B：詹納斯綠B能專一的對線粒體進行活體染色。線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)，即有色狀態(tài)，呈藍綠色，而在周圍的細胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)三、實驗儀器 顯微鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙。 人口腔上皮細胞四、實驗材料洋蔥、小麥種子或黃豆幼根根尖 五、實驗內(nèi)容與實施過程1.人口腔粘膜上皮細胞線粒體的超活染色

13、與觀察清潔載玻片放在37恒溫水浴鍋的金屬板上 滴2滴1/5000詹納斯綠B染液 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細胞 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中 染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液) 蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察 實驗內(nèi)容與實施過程2. 植物細胞液泡系的超活染色與觀察 取小麥種子發(fā)芽的根尖 用刀片縱切根尖 放入中性紅染液滴中，染色510min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 蓋上蓋玻片進行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察) 實驗內(nèi)容與實施過程3.實驗結(jié)果 在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點的細胞，可見細胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小

14、泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細胞中，一般只有一個淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細胞的絕大部分，將細胞核擠到細胞一側(cè)貼近細胞壁處。實驗內(nèi)容與實施過程4、實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。實驗作業(yè) （1）繪口腔上皮細胞示線粒體的形態(tài)與分布 （2）繪小麥根尖細胞示液泡的形態(tài)與分布 實驗總結(jié) 人口腔上皮細胞的線粒體的超活染色與觀察效果很好，但是洋蔥表皮細胞和小麥根尖細胞的染色效果不是很理想。 實驗五 葉綠體

15、的分離與熒光觀察 一、實驗?zāi)康模?1.通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法； 2.觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。 二、 實驗原理 組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心，是分離細胞器的常用方法。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分。 三、實驗儀器 普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡。燒杯2個,

16、 250ml量筒1個, 滴管20支, 10ml刻度離心管20支, 試管架5個，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。 新 鮮 菠 菜 四、實驗材料五、實驗內(nèi)容與實施過程（一）葉綠體的分離與觀察 1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，裝入組織搗碎機。 2. 利用組織搗碎機低速(5000r/min)勻槳3-5min。 3. 將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。 4. 取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀。 5. 將上清液在3000r/min下離心5min。棄去上清液，沉淀即是葉綠體(混有部分細胞核)。實驗內(nèi)容與實

17、施過程6. 將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮。7. 取葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在顯微鏡下觀察。在普通光鏡下觀察。在熒光顯微鏡下觀察。取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙熒光染料，在熒光顯微鏡下觀察。實驗內(nèi)容與實施過程（二）實驗結(jié)果：普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。在選用B（blue）激發(fā)濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。加入丫啶橙后，葉綠體可發(fā)出橘紅色熒光，其中混有的細胞核則發(fā)綠色熒光。 實驗內(nèi)容與實施過程(三)實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功

18、，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。實驗作業(yè) 1.在分離葉綠體時應(yīng)注意些什么問題？ 2.在倒置顯微鏡相連的電腦軟件支配下，測量一下葉綠體的長軸和短軸，分別測量510個葉綠體，求其平均值。實驗總結(jié)實驗結(jié)果非常理想，提醒學(xué)生們在使用熒光顯微鏡時應(yīng)注意保護眼睛，避免紫外線的傷害。 實驗六 植物原生質(zhì)體的 分離與培養(yǎng) 一、實驗?zāi)康模?原生質(zhì)體是除去細胞壁的裸露細胞。在適宜的條件下，分離的原生質(zhì)體能夠再生細胞壁，進行細胞分裂，并再生完整植株。通過實驗，掌握原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的基本方法，并對培養(yǎng)結(jié)果進行觀察和分析。 二、 實驗原理 植物原生質(zhì)體是除去細胞壁后為原生

19、質(zhì)所包圍的“裸露細胞”，是開展基礎(chǔ)研究的理想材料。其中酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù)，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁而使原生質(zhì)體釋放出來。 原生質(zhì)體分離純化或融合后，在適當?shù)呐囵B(yǎng)基上應(yīng)用合適的培養(yǎng)方法，能夠再生細胞壁，并啟動細胞持續(xù)分裂，直至形成細胞團，長成愈傷組織或胚狀體，再分化發(fā)育成苗。其中，選擇合適的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法是原生質(zhì)體培養(yǎng)中最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。 三、實驗儀器 臺式離心機、 高壓滅菌鍋、倒置顯微鏡、超凈工作臺 三角瓶、離心管、燒杯、200目不銹鋼濾網(wǎng)、解剖刀、長、短鑷子、培養(yǎng)皿、濾紙、0

20、.2m濾膜、濾器、培養(yǎng)瓶（注：以上用品要進行高壓滅菌） 煙草幼苗的葉片 四、實驗材料新鮮菠菜的葉 五、實驗內(nèi)容與實施過程1、實驗原理的講解；（15分鐘）2、液體培養(yǎng)基的配制；（實驗前由教師完成）3、酶液的制備：（20分鐘）1纖維素酶、1果膠酶、0.6mol/L甘露醇 、0.1%MES、0.05mol/LCaCl22H2O、 pH6.87.0 實驗內(nèi)容與實施過程4、植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)（ 課內(nèi)完成，180min）取充分展開的嫩葉，用自來水沖洗干凈；將葉片在0.1%升汞溶液中浸泡滅菌10min，然后用無菌蒸餾水漂洗5次；用鑷子撕去葉的下表皮，然后將葉放有酶液的培養(yǎng)皿或帶蓋三角瓶，每10ml酶液

21、放2g葉片；在2528黑暗條件下，酶解23h,用200目網(wǎng)過濾除去未完全消化的殘渣。在1000rpm條件下離心5分鐘，棄上清。加入3 4ml 0.2mol/LCaCl22H2O洗液，用注射器向離心管底部緩緩注入20蔗糖溶液6ml，在1000rpm條件下離心510分鐘，由于密度梯度離心的作用，生活力強狀態(tài)好的原生質(zhì)體漂浮在20的蔗糖與0.2mol/LCaCl22H2O之間，破碎的細胞殘渣沉入管底。實驗內(nèi)容與實施過程用200l移液器輕輕將狀態(tài)好的原生質(zhì)體吸出(注意盡可能不要吸入下層的蔗糖溶液)，放入另一干凈的離心管中加4ml 0.2mol/LCaCl22H2O懸浮，1000rpm離心25分鐘，棄上

22、清實驗內(nèi)容與實施過程將收集的原生質(zhì)體懸浮在適量的DPD培養(yǎng)基中，用血球計數(shù)板調(diào)整原生質(zhì)體密度為5104/ml（請參考細胞計數(shù)）之間。用帶皮頭的移液管將原生質(zhì)體懸液分裝在培養(yǎng)皿中，每皿放5ml。用石蠟?zāi)Х饪?。?6左右條件下進行暗培養(yǎng)。實驗內(nèi)容與實施過程5、培養(yǎng)結(jié)果的觀察（活力檢查，細胞壁再生的觀察，細胞分裂的觀察）:在課外由教師指導(dǎo)學(xué)生進行.實驗內(nèi)容與實施過程實驗內(nèi)容與實施過程6、實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。共225分鐘。 實驗的意義植物原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)在理論和實踐上都有很

23、大的意義，在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，它不僅能克服遠緣雜交有性不親和障礙，也可克眼傳統(tǒng)的通過有性雜交誘導(dǎo)多倍體植株的麻煩，最終將野生種的遠緣基因?qū)朐耘喾N中，原生質(zhì)體融合技術(shù)可望成為作物改良的有力工具之一。 實驗作業(yè) 1酶解液及原生質(zhì)體起始培養(yǎng)基中，為何要保持較高滲透壓？ 2.如何判斷分離原生質(zhì)體的活力和新壁再生？實驗總結(jié) 將原生質(zhì)體培養(yǎng)分化過程進行顯微攝影，并分析結(jié)果。以植物根、莖、葉、葉柄作為原生質(zhì)體的分離材料,經(jīng)過分離收集在一定條件下才能培養(yǎng)獲得完整的原生質(zhì)體,原生質(zhì)體培養(yǎng)基的滲透壓應(yīng)與酶液的滲透壓相等. 實驗七 動物血細胞的 電

24、融合技術(shù) 一、實驗?zāi)康模?本實驗使學(xué)生在了解電融合原理的基礎(chǔ)上，學(xué)會掌握各種細胞懸液的制備及電融合過程的操作。 二、 實驗原理 制備的游離細胞或原生質(zhì)體，置于電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細胞被極化，成為偶極子，造成細胞之間相互連接，如果施加的高頻交流電壓(即正弦波的p-p值)過高或作用時間過長，則細胞連接成串珠狀，應(yīng)適當控制以上條件，盡量使兩細胞處于點接觸狀態(tài)，然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細胞接觸點部位的質(zhì)膜，此時質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時由于細胞表面的張力作用，使兩細胞融合逐步完全。 動物的游離細胞在電刺激下可進行細胞融合，且具有融合率高、無毒性、操作簡

25、便及融合后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)成活率高等特點，是細胞工程手段的又一進展。三、實驗儀器 CRY-3型細胞融合儀、細胞融合池、倒置顯微鏡 刻度離心管、移液槍、血細胞計數(shù)板 四、實驗材料雞 血細 胞五、實驗內(nèi)容與實施過程（一）動物血細胞的制備（二）細胞電融合（三）實驗結(jié)果 （四）實驗小結(jié)實驗結(jié)果 在倒置顯微鏡下可觀察到由同種細胞融合形成的細胞，稱為同核體 (homokaryons). 利用不同親本的不同細胞彼此融合所形成的細胞，稱為異核體 (heterokaryons)，還可觀察到3個以上細胞融合在一起的合胞體。返回實驗內(nèi)容與實施過程（四） 實驗小結(jié)（15分鐘）：總結(jié)實驗過程中學(xué)生的操作是否規(guī)范；實驗是否

26、成功，如果不成功，問題出在哪里；哪些實驗作得比較好。提醒預(yù)習(xí)下節(jié)課實驗內(nèi)容，提問。共180分鐘。 返回實驗作業(yè) 1.繪圖表示所觀察到的融合細胞 2.請寫出細胞電融合的注意事項 實驗總結(jié)1.影響細胞電融合因素： 用于供原生質(zhì)體或動物細胞懸浮的介質(zhì)，必須滿足兩個條件：一是為了保持細胞的生物活性，使融合后的細胞能繼續(xù)存活，并通過培養(yǎng)能繼續(xù)分裂和分化，其介質(zhì)要求與細胞本身具有等滲性；實驗總結(jié)二是為了保證融合之前所施加的各項電參數(shù)充分發(fā)揮作用，其介質(zhì)應(yīng)具有高純度的非離子溶液，如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金屬離子或Cl離子，將使介質(zhì)的導(dǎo)電性增加，當施加脈沖波刺激時，據(jù)報導(dǎo)，其總能量Q將通過離

27、子的傳導(dǎo)作用損失80以上，而直接通過細胞，用于擊穿膜接觸點使其細胞融合的能量僅占1020%，當有離子存在并使電脈沖能量高度損失的情況下，將不能保證細胞進行融合。實驗總結(jié)在介質(zhì)中有金屬離子存在，當施加高頻正弦波電場時，不能將細胞極化成偶極子，從而不能使細胞間相互接觸和連接，更談不上細胞間相互融合。為了解決以上存在的問題，一是采用高純度的蒸餾水(三蒸水或四蒸水)來配制介質(zhì)，二是選用適當?shù)姆请娊橘|(zhì)溶質(zhì)如甘露醇、山梨醉或蔗糖等來配制供細胞懸浮的等滲溶液，另外，在清洗電融合室時，以要以高純度的蒸餾水用毛筆擦凈。 備注 電融合發(fā)展于20世紀80年代，是使細胞在電場中成為偶極子，沿電力線排布成串，再利用高強

28、度、短時程的電脈沖擊破細胞膜，膜的脂類分子發(fā)生重排，由于表面張力作用，兩細胞發(fā)生融合。 實驗八 利用PEG為媒介 物進行動物血細胞融合 一、實驗?zāi)康模?掌握利用聚乙二醇為介導(dǎo)物對各類細胞的融合方法 二、 實驗原理 制備的游離細胞或原生質(zhì)體，置于電融合室中，在高頻交流電場的作用下，細胞被極化，成為偶極子，造成細胞之間相互連接，如果施加的高頻交流電壓(即正弦波的p-p值)過高或作用時間過長，則細胞連接成串珠狀，應(yīng)適當控制以上條件，盡量使兩細胞處于點接觸狀態(tài)，然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細胞接觸點部位的質(zhì)膜，此時質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組，同時由于細胞表面的張力作用，使兩細胞融合逐步完全。 動物的游離細胞在電刺激下可進行細胞融合，且具有融合率高、無毒性、操作簡便及融合后