免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)講稿

1、關(guān)于免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)第一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月中性粒細(xì)胞的吞噬作用【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.熟悉中性粒細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)的原理和方法。2.通過本實(shí)驗(yàn)理解機(jī)體的非特異性免疫機(jī)制。第二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)原理】中性粒細(xì)胞具有吞噬殺菌功能，當(dāng)與顆粒性物質(zhì)（如葡萄球菌等）混合孵育一定時(shí)間后，顆粒性物質(zhì)被吞噬殺滅，根據(jù)吞噬率、吞噬指數(shù)可反映該細(xì)胞的吞噬功能。第三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)材料】1.表皮（白色）葡萄球菌菌液（濃度610億/ml)。2.肝素溶液（25U/ml）；甲醇，堿性美藍(lán)（或瑞氏）染液。3.血紅蛋白吸管，凹玻片，載玻片，采血針，微量加樣器，

2、濕盒，顯微鏡，恒溫培養(yǎng)箱，75%酒精，棉簽，香柏油，二甲苯等。第四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)方法】1、用微量加樣器，吸取肝素20ul加入潔凈凹玻片凹孔內(nèi)。2、用酒精棉簽消毒手指后，刺破皮膚，以血紅蛋白吸管取血40ul，立即放入盛有肝素的凹玻片凹孔內(nèi)，并充分混勻。3、用微量加樣器取葡萄球菌菌液20ul加入上述凹玻片凹孔內(nèi)，充分混勻。4、將凹玻片置于濕盒內(nèi)，30溫箱中30min，其間每隔10min搖勻一次。5、取一小滴上述混合液，置于載玻片上，用另一載玻片推成薄血片，待干。6、滴加甲醇固定3min，水洗。7、加堿性美藍(lán)染色12min，水洗，印干。8、置油鏡下觀察吞噬和未吞噬的

3、白細(xì)胞并計(jì)數(shù)。第五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】第六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)思考】1、在吞噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌時(shí)，如何區(qū)別吞噬的細(xì)菌和粘附在吞噬細(xì)胞表面的細(xì)菌？2、簡(jiǎn)述機(jī)體非特異性免疫的概念及特點(diǎn)。第七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月凝集反應(yīng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?了解凝集反應(yīng)的原理、基本類型及其臨床意義。2掌握玻片凝集實(shí)驗(yàn)、間接凝集實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果分析。第八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【概述】 在一定濃度的電解質(zhì)溶液中，顆粒性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后，出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，稱為凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)是一種定性的檢測(cè)方法，也可以進(jìn)行半定量檢

4、測(cè)。凝集反應(yīng)可分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)。由于凝集反應(yīng)方法簡(jiǎn)便，目前在臨床檢驗(yàn)中仍被廣泛應(yīng)用。 第九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、直接凝集反應(yīng)細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)電解質(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱為直接凝集反應(yīng) 。常用的凝集試驗(yàn)有玻片法和試管法兩種。玻片凝集試驗(yàn)ABO血型鑒定玻片凝集試驗(yàn)為定性試驗(yàn)，一般用已知抗體作為診斷血清，與受檢顆?？乖?，如菌液或紅細(xì)胞抗原各加一滴在玻片上，混勻，數(shù)分鐘后即可用肉眼觀察凝集結(jié)果，出現(xiàn)凝集顆粒的為陽性。此法簡(jiǎn)便，快速，適用于從病人標(biāo)本中分離得到的菌種的診斷或分型，也可用于紅細(xì)胞ABO血型的鑒定。 第十張，PPT共五十六頁

5、，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)原理】人類ABO血型抗原主要有A和B兩種，根據(jù)紅細(xì)胞表面這兩種抗原的有無可把血型分為四種。據(jù)此，將抗A和抗B抗體分別與待測(cè)紅細(xì)胞混合，抗A或（和）抗B抗體與紅細(xì)胞表面上的相應(yīng)抗原結(jié)合而引起紅細(xì)胞凝集，據(jù)其凝集情況便可判定出受試者的血型。ABO血型的劃分 紅細(xì)胞表面Ag血清中AbA型A抗BB型B抗AAB型A、B、O型、抗A、抗B第十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)材料】1ABO血型鑒定試劑盒內(nèi)含抗A分型試劑和抗B分型試劑各1支。2一次性采血針1枚、潔凈玻片2塊、75酒精、滅菌棉簽。384消毒液第十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 3用酒精

6、棉簽消毒被檢者手指尖端，以采血針刺破皮膚，稍加擠壓，使血液流出。用另一載玻片一端取適量血液加入抗抗A分型試劑，并混勻；用另一端再取適量血液加入抗抗B分型試劑，并混勻。用干棉簽止血。 4觀察紅細(xì)胞有無凝集發(fā)生。如有凝集，可見紅細(xì)胞凝集成塊；無凝集，紅細(xì)胞呈均勻分散。判定結(jié)果后把玻片放入消毒液中。AB【實(shí)驗(yàn)方法】1取潔凈載玻片1塊，并標(biāo)記（如圖） 2將抗A、B分型試劑分別加1滴于標(biāo)記有A、B的玻片兩側(cè)?？笰抗B第十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月抗A分型試劑側(cè)抗B分型試劑側(cè)血型+A+B+ABO“”表示紅細(xì)胞凝集，“”表示紅細(xì)胞未凝集【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】記錄受檢者紅細(xì)胞凝集情況，根據(jù)ABO血型鑒

7、定表(下表)，判斷受檢者的血型。 ABO血型鑒定表第十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、間接凝集反應(yīng)將可溶性抗原或抗體先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體表面（這種載體與免疫無關(guān)），然后與相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合，在適量的電解質(zhì)存在下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱為間接凝集反應(yīng)。根據(jù)載體的不同可將間接凝集反應(yīng)分為：間接血細(xì)胞凝集試驗(yàn)、間接乳膠凝集試驗(yàn)（及間接乳膠凝集抑制試驗(yàn)）和金黃色葡萄球菌協(xié)同凝集試驗(yàn)等。第十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月間接凝集抑制試驗(yàn)妊娠試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)原理】可溶性抗原致敏的乳膠顆粒與相應(yīng)抗體作用可使乳膠顆粒凝集，此為間接乳膠凝集試驗(yàn)。若使抗體先與可溶性抗原作用，再加入

8、該抗原致敏的乳膠顆粒，則乳膠凝集被抑制，此為間接乳膠凝集抑制試驗(yàn)。孕婦尿中絨毛膜促性腺激素（HCG）含量明顯增高。HCG與抗HCG抗體先作用后，再加入HCG致敏的乳膠顆粒，不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，此為妊娠試驗(yàn)陽性；非孕婦尿中HCG含量不足以消耗掉抗HCG抗體，抗體與后加入的HCG致敏乳膠結(jié)合呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則妊娠試驗(yàn)陰性。第十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)材料】1妊娠診斷試劑盒：內(nèi)含抗血清（抗HCG）、乳膠抗原（HCG致敏）各一支2待檢尿、孕婦尿、正常尿。3有格玻片和毛細(xì)吸管等。第十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)方法】1在玻片的第1、第2和第3格內(nèi)分別加1滴正常尿

9、、待檢尿及孕婦尿。2每格內(nèi)加入妊娠診斷試劑抗血清1滴。輕輕搖動(dòng)12 min使其充分混勻。 3每格加入乳膠抗原1滴，輕輕搖動(dòng)玻片35 min后觀察結(jié)果，記錄各標(biāo)本有無凝集現(xiàn)象。 第十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】孕婦尿格呈均勻渾濁乳狀液，無凝集，妊娠試驗(yàn)陽性；正常尿格出現(xiàn)白色細(xì)小凝集物，隨時(shí)間延長(zhǎng)凝集物變成小塊狀，妊娠試驗(yàn)陰性。待檢尿若為乳狀液，妊娠試驗(yàn)陽性；若出現(xiàn)凝集，則妊娠試驗(yàn)陰性。第十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【注意事項(xiàng)】1試驗(yàn)所用診斷試劑用前應(yīng)充分搖勻，而且應(yīng)在有效期內(nèi)使用。2加樣用的滴管及混勻用的牙簽不能共用。3加樣不宜太多，玻片應(yīng)始終保持水

10、平，以防兩格之反應(yīng)液相混。第二十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)思考】 1記錄血型鑒定試驗(yàn)、乳膠妊娠診斷試驗(yàn)的材料、方法及結(jié)果判定（可用圖示或表格方式表示）。2直接凝集試驗(yàn)與間接凝集試驗(yàn)有何不同？3在各凝集試驗(yàn)中都設(shè)有相應(yīng)對(duì)照，有何意義？若對(duì)照出現(xiàn)異常如何分析及解決？第二十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 沉 淀 反 應(yīng) 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1掌握對(duì)流免疫電泳的基本原理、方法。 2熟悉瓊脂單向擴(kuò)散，雙向擴(kuò)散的基本原理、方法、結(jié)果分析及臨床用途。 3了解火箭免疫電泳的基本原理、方法。第二十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【概述】 可溶性抗原如血清、毒素、細(xì)菌浸出

11、液等與相應(yīng)抗體結(jié)合，當(dāng)兩者比例合適、并有適量電解質(zhì)存在時(shí)，形成肉眼可見的沉淀物或沉淀線，稱為沉淀反應(yīng)。 沉淀反應(yīng)是臨床上最常用、最基本的方法之一。它的種類較多，可分為瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳試驗(yàn)、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)及絮狀沉淀試驗(yàn)等。 第二十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，當(dāng)兩者比例合適時(shí)，就出現(xiàn)白色沉淀線，為陽性反應(yīng)。本試驗(yàn)可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂內(nèi)進(jìn)行操作。 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可分為單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。 (一)單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) (示教) (二)雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn) (示教)第二十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作

12、于2022年6月二、對(duì)流免疫電泳【實(shí)驗(yàn)原理】 帶電的膠體顆?？稍陔妶?chǎng)中移動(dòng)，移動(dòng)方向與膠體顆粒所帶電荷有關(guān)。多數(shù)蛋白質(zhì)抗原在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在電泳時(shí)從負(fù)極向正極移動(dòng)?？贵w屬球蛋白，在堿性緩沖液只帶微弱的負(fù)電荷，而且相對(duì)分子質(zhì)量較大，電泳力較小，在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負(fù)極移動(dòng)。這樣就使抗原和抗體定向?qū)α?，在兩孔間相遇時(shí)發(fā)生反應(yīng)，并在比例合適處形成肉眼可見的白色沉淀線。這種將雙向瓊脂擴(kuò)散和電泳技術(shù)結(jié)合在一起的方法稱為對(duì)流免疫電泳 。第二十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)材料】 1電泳緩沖液：pH 8.6巴比妥-鹽酸緩沖液。 2抗體：抗AFP。 3抗原：AFP陽性血清

13、、待檢病人血清。 41瓊脂 用pH 8.6巴比妥-鹽酸緩沖液配制，冰箱保存?zhèn)溆谩?5電泳儀、電泳槽、載玻片、打孔器、10 ml吸管、移液器、移液頭。 第二十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)方法】 1制板 2打孔 3加樣 將抗原加入瓊脂板上有標(biāo)記孔側(cè)的小孔中，抗體加入另一側(cè)小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。(如圖示) 4電泳 將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側(cè)置陰極端，抗體孔側(cè)置陽極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓610 V/cm板長(zhǎng)，電泳約3060 min。 5關(guān)閉電源，取出瓊脂板，觀察結(jié)果。 AgAbAgAb標(biāo)記孔沉淀線第二十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【

14、實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 將玻片對(duì)著強(qiáng)光源，先觀察AFP陽性血清孔與抗體孔之間的白色沉淀線，然后再觀察待檢血清孔與抗體孔之間是否也有沉淀線出現(xiàn)，如有沉淀線，則表示AFP試驗(yàn)陽性，否則AFP試驗(yàn)為陰性。第二十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【注意事項(xiàng)】 1電泳時(shí)電流不宜過大，以免蛋白變性。 2抗原和抗體的電極方向不能搞錯(cuò)。 3抗原和抗體的濃度要適當(dāng)，抗原太濃或太稀都不易出現(xiàn)沉淀線。 4電泳所需時(shí)間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳時(shí)間越長(zhǎng)。 第二十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)思考】 1單向擴(kuò)散與火箭電泳、雙向擴(kuò)散與對(duì)流免疫電流比較各有何特點(diǎn)？ 2對(duì)流免疫電泳中，抗原為何放陰極端，

15、抗體為何放陽極端？ 第三十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1熟悉免疫細(xì)胞分離的常用方法。 2掌握外周血單個(gè)核細(xì)胞分離方法的原理、操作規(guī)程。 第三十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)原理】 人外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細(xì)胞不同。因此利用一種介于1.0751.090之間而近于等滲的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）混合分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細(xì)胞在分離液中呈梯度分布。從而分

16、離出PBMC。第三十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)材料】1肝素溶液 用生理鹽水將肝素配成125250 U/ml的溶液，置4 下保存?zhèn)溆谩?淋巴細(xì)胞分層液 市售或自配，20 時(shí)密度應(yīng)為(1.0770.001) g/L。3Hanks平衡鹽溶液（HBSS）或磷酸鹽緩沖液（PBS）pH 7.27.4。4完全RPMI-1640培養(yǎng)液。515 ml或50 ml錐底離心管。6水平離心機(jī)，顯微鏡。7玻璃吸管，滴管，細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。82臺(tái)盼藍(lán)染液。第三十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)方法】 1采集靜脈血若干毫升（隨需要而定），注入盛有肝素的無菌小瓶中（每ml全血加0.1 m

17、l 肝素溶液），加蓋后立即輕輕搖勻，使血液抗凝。 2用吸管加入等體積的室溫HBSS或PBS，使血液等倍稀釋。（此步驟亦可省去） 3吸取淋巴細(xì)胞分層液（每10 ml稀釋血加5 m1分層液）置于15 m1或50 m1離心管中，然后將離心管傾斜45角，將稀釋血液在距分層液界面上1 cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面。應(yīng)注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。 第三十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 4將離心管置水平式離心機(jī)內(nèi)，在1820 下，以2000 r/min離心30 min，離心后，管內(nèi)分層如下圖所示第三十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月 5用毛細(xì)吸管輕輕插入灰白色層，

18、沿管壁輕輕吸出該層的單個(gè)核細(xì)胞，盛入另一支離心管中。 6將所得到的PBMC懸液用5倍體積的HBSS或RPMI-l640洗滌2次，依次以2 000 r/min，1500 r/min在室溫（1825）下離心10 min，棄上清。 7用完全RPMI-1640定容細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞后再調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。 8用臺(tái)盼藍(lán)染液檢查所分離細(xì)胞的活性：取2滴細(xì)胞懸液加1滴2臺(tái)盼藍(lán)染液，510 min后取樣作濕片高倍鏡檢。 第三十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 臺(tái)盼藍(lán)染液檢查活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞百分率，一般活性應(yīng)在95以上。 第三十七張，PPT共五十六頁

19、，創(chuàng)作于2022年6月【注意事項(xiàng)】 1與血液樣品接觸時(shí)應(yīng)注意安全防護(hù)，避免血源性傳染病傳染。 2操作應(yīng)輕柔，細(xì)胞懸液應(yīng)充分混勻，避免損傷細(xì)胞活性及細(xì)胞丟失。 3細(xì)胞分層液在室溫下應(yīng)為(l.0770.001) g/L；應(yīng)避光4 下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用。使用中應(yīng)避免細(xì)菌污染。 4稀釋血液可降低紅細(xì)胞的凝集，提高淋巴細(xì)胞收獲量，但如果要保留血漿成分作其他實(shí)驗(yàn)用時(shí)，則不能稀釋血液，以免影響血漿成分。 第三十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫系統(tǒng)組分的分離及活性檢測(cè) 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?1掌握免疫系統(tǒng)組分中胸腺、脾組織結(jié)構(gòu)及淋巴細(xì)胞的功能。 2熟悉淋巴細(xì)胞分離方法。 3建立對(duì)

20、免疫學(xué)的整體概念，加深對(duì)免疫系統(tǒng)組成和功能及重要性的理解，提高學(xué)習(xí)興趣及主動(dòng)性。 4培養(yǎng)學(xué)生在實(shí)際工作中動(dòng)手、動(dòng)腦、觀察和分析與解決問題的能力。 第三十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、小鼠胸腺、脾摘除術(shù)【實(shí)驗(yàn)原理】 小鼠的胸腺和脾是研究T細(xì)胞和B細(xì)胞特性與功能最主要的材料來源。觀察其組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)目及活性等，可進(jìn)一步了解該機(jī)體的免疫狀況。是目前探討免疫學(xué)理論及與其有關(guān)疾病的最好模型之一。故摘除胸腺和脾是進(jìn)行研究的前提。第四十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)材料】 1昆明種小鼠2024 g。 275%酒精、無菌棉簽。 3小手術(shù)臺(tái)、大頭針、眼科鑷子、剪子。 第四十

21、一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)方法】1取小鼠一只以眼球采血（抗凝備用）處死。2小鼠用大頭針固定在小手術(shù)臺(tái)上，位置擺正。3用75%的酒精消毒小鼠皮膚。4打開腹腔及分離胸骨后軟組織。5用眼科剪從腹部向上沿正中線剪開胸骨到頸部。6暴露胸腺后輕輕剝離兩葉胸腺。7在上腹部剝離脾，剪除結(jié)締組織被膜。 第四十二張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 觀察胸腺、脾組織結(jié)構(gòu)及其是否完整。有時(shí)間可在電子天秤稱重。【注意事項(xiàng)】 1剝離胸腺時(shí)要特別小心，以保證兩葉完整性。 2剝離胸腺、脾時(shí)要完全去掉其他組織。第四十三張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月二、小鼠淋巴細(xì)胞分離及活

22、性檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)原理、材料、方法及結(jié)果略，與前述外周血單個(gè)核細(xì)胞分離基本相同，不同之處： 1小鼠淋巴細(xì)胞的密度為1.098 g/ml，故分層液的密度不同。 2取胸腺、脾經(jīng)200目鋼絲網(wǎng)過篩的細(xì)胞懸液，用分離層液分離淋巴細(xì)胞。 3取眼球血液用分層分離淋巴細(xì)胞。 第四十四張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)思考】 1為什么取胸腺和脾制備淋巴細(xì)胞，可了解機(jī)體的免疫功能？ 2如何理解機(jī)體免疫系統(tǒng)各組成部分功能正常的重要性？ 3分離淋巴細(xì)胞的意義何在？ 4為進(jìn)一步了解機(jī)體免疫功能還需進(jìn)行哪些檢測(cè)？ 第四十五張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月免疫酶技術(shù) 免疫酶技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與

23、酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合的一種方法。它以酶作為標(biāo)記物，與抗體（或抗原）聯(lián)結(jié)，與相應(yīng)的抗原（或抗體）作用后，通過底物的顏色反應(yīng)作抗原抗體的定性和定量，亦可用于組織中抗原或抗體的定位研究，即酶免疫組織化學(xué)技術(shù)。 目前應(yīng)用最多的免疫酶技術(shù)是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），它是將可溶性抗原（或抗體）吸附于固相載體上，加入酶標(biāo)抗體（或抗原）與吸附在載體上的抗原（或抗體）結(jié)合，形成酶標(biāo)記復(fù)合物，再加入酶底物時(shí)，即可顯色。顏色反應(yīng)的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原量相關(guān)。常用的酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP），相應(yīng)的底物分別是鄰苯二胺（OPD）和對(duì)硝基苯磷酸鹽。實(shí)驗(yàn)方法有間接法、夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法 。第四

24、十六張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 ELISA夾心法檢測(cè)HBsAg【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?熟悉ELISA的原理、夾心法。2了解免疫標(biāo)記技術(shù)的原理?！緦?shí)驗(yàn)原理】采用多克隆抗-HBS包被反應(yīng)板，加入待測(cè)標(biāo)本，同時(shí)加入單克隆抗-HBs-HRP，如待測(cè)標(biāo)本中含有HBsAg時(shí)就與包被抗-HBs、抗-HBs-HRP結(jié)合形成復(fù)合物，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)，反之就無顯色反應(yīng)。第四十七張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)材料】1乙肝病毒HBsAg酶聯(lián)免疫診斷試劑盒（由廠商供應(yīng)）。預(yù)包被微孔條（用純化的抗-HBs包被）。酶聯(lián)試劑（用HRP標(biāo)記的抗HBs）。HBsAg陽性對(duì)照。HBsAg陰性對(duì)

25、照。洗滌液(濃縮液)。顯色劑A、B。終止液（2 mol/L H2SO4）。2微量加樣器，混合振蕩器，酶標(biāo)測(cè)定儀，恒溫箱，吸水紙，蒸餾水等。第四十八張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)方法】1配液 濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水25倍稀釋使用。2編號(hào) 將微孔條固定于支架，按序編號(hào)。3加樣 分別用加樣器加待檢血清和陰、陽性對(duì)照50 1（1滴）于相應(yīng)孔中，設(shè)空白對(duì)照孔（加50 1洗滌液）。4加酶 除空白對(duì)照外，每孔加酶聯(lián)試劑50 l（1滴）。5溫育 振蕩混勻，置37 30 min后取出。6洗滌 甩去孔內(nèi)液體，扣干，用洗滌液注滿各孔，靜置2 s，甩干，重復(fù)5次后拍干。7顯色 每孔加顯色劑A、

26、B各50 l（1滴）振蕩混勻，37暗置15 min。第四十九張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】1目測(cè) 在白色背景下觀察各孔顯色情況，有明顯藍(lán)色者為陽性，無色者為陰性。2酶標(biāo)儀檢測(cè) 每孔加終止液50 l（1滴）混勻，用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔A值。計(jì)算P/N值：結(jié)果判斷：P/N值2.1者為陽性，2.1者判為陰性（陰性對(duì)照孔A值小于0.05時(shí)以0.05計(jì)）。第五十張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月【注意事項(xiàng)】1試劑盒應(yīng)于4存放，在有效期內(nèi)使用。2微孔條須密封防潮，從冷藏環(huán)境中取出時(shí),應(yīng)在室溫中平衡至潮氣盡干后方可開封啟用，余者及時(shí)封存。3滴加試劑前應(yīng)將瓶搖勻，使液體混勻。滴加時(shí)瓶身應(yīng)保持垂直，以使滴量準(zhǔn)確，注意勿將試劑滴在孔壁上。4洗滌時(shí)各孔均須加滿，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈。5待測(cè)標(biāo)本不可用NaN3防腐。所有樣品都應(yīng)按傳染源處理。第五十一張，PPT共五十六頁，創(chuàng)作于2022年6月ELISA競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗-HBc 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?熟悉E