免疫組化原理及流程介紹

1、免疫組化原理及流程介紹第1頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一主要內(nèi)容免疫組化原理及流程介紹一.免疫組化的發(fā)展簡史二.免疫組化的原理三.免疫組化的基本流程四.免疫組化的結(jié)果分析第2頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹一.發(fā)展簡史1941年 Coons 首先用熒光素標(biāo)記抗體檢測肺組織內(nèi)的肺炎雙球菌獲得成功。60年代 Akanke建立酶標(biāo)抗體技術(shù)鐵蛋白標(biāo)記Ab技術(shù)。70年代 Stemberger 改良上述技術(shù)，建立辣根過氧化物酶抗體過氧化物酶（PAP）技術(shù)，使免疫細(xì)胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)用。第3頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分

2、，星期一80年代 Hsu 等建立了抗生物素生素（ABC）法之后，免疫金銀染色法、半抗原標(biāo)記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問世。90年代 分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)分類方法迅速發(fā)展。2000年 各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功 能代謝綜合研究的一項有力工具。其應(yīng)用范圍深達醫(yī)學(xué)各個學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一。第4頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹 二 免疫組化的原理 免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進行定性、

3、定位、定量測定的一項新技術(shù)。第5頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹 它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。 第6頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一三 免疫組化的基本流程免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化2.細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶 3.抗原修復(fù)、暴露抗原決定簇 4.封閉非特異性蛋白 5.一抗孵育 6.二抗孵育 7.SP 反應(yīng) 8.顯色 9.復(fù)染、脫水、透明、封片 2.

4、細(xì)胞通透、封閉內(nèi)源性過氧化物酶 第7頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹1.脫蠟與水化 脫蠟與水化的目的是確保抗體等其他試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合發(fā)生反應(yīng)。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。第8頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一60 20 minXylene：2 10 minutes； 100% absolute ethanol： 2 5 minutes；95% ethanol 2 minutes； 80% ethanol 2 minutes； 70% ethanol 2 minutes；di

5、stilled water:5 min；PBS 洗 3 3 min。 具體操作第9頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹2.細(xì)胞通透與封閉內(nèi)源性過氧化酶 目的是使抗體能夠充分地進入胞內(nèi)進行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。(1)細(xì)胞通透第10頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹(2)封閉內(nèi)源性過氧化酶 其主要目的是降低內(nèi)源性過氧化物酶的活性。在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易受到內(nèi)源性過氧化物酶的干擾，必須用過氧化氫等進行滅活。 第11頁，共46頁，2022年，5月20日，

6、5點24分，星期一1)用封閉通透液浸潤切片 30 min（RT 避光）。 其配法是用預(yù)熱 40 ml PBS 加120ul TritonX-100 加熱幾分鐘，在臨用前加 400 ul的30H2O2。2)PBS 溶液洗 3 次3 min。 免疫組化原理及流程介紹具體操作:第12頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹3. 抗原修復(fù) 暴露抗原決定簇 由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。 第13頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24

7、分，星期一免疫組化原理及流程介紹 常用的修復(fù)方法從強到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。 抗原修復(fù)的主要方法:酶消化方法一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原應(yīng)用高頻電磁波打開蛋白質(zhì)間的交聯(lián)鍵第14頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹將切片放入 0.01 M 檸檬酸鈉緩沖 溶液（pH6.0）后，在微波爐里高火 4 min 至沸騰后，取出，冷卻至室溫，再加熱，約4次，每次間隔補足液體，防止干片。2)PBS 溶液洗 3 次3 min。具體操作（微波修復(fù)）：1)第15頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹4.封閉特異性蛋白組織

8、切片上有些剩余的位點可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性。封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中有一些動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點發(fā)生結(jié)合。 第16頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹 將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內(nèi)組織滴入 5%羊血清（與二抗來源一致）后放入濕盒中,室溫 (約30)下1030min。 具體操作：大一點第17頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹5.一抗孵育一抗:可以特異結(jié)合底物，就是識別出我們想要檢測的東西。一抗和底物結(jié)合與否用肉眼是

9、看不出來的。 第18頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。 一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，然后4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。 免疫組化原理及流程介紹1.防止脫片；2.使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。第19頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗（1：250、500、1000）后，放入濕盒中室溫 1 小時，然后 4 度過夜，冰箱中

10、取出后需37 復(fù)溫 45 min。 免疫組化原理及流程介紹具體做法：第20頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹6.二抗孵育二抗:可以和一抗結(jié)合，并帶有可以被檢測出的標(biāo)記(如帶熒光、放射性、化學(xué)發(fā)光或顯色基團），作用是檢測一抗。第21頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索。 但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r間。 免疫組化原理及流程介紹第22頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 1)將一抗倒掉并用 PBS

11、 洗 5 min5 次； 2)用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入 37恒溫烤箱中 30 min。 3)用 PBS 洗 5 次5 min 免疫組化原理及流程介紹具體操作：第23頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一7.SP反應(yīng) SP染色法即鏈霉素抗生物素蛋白 生物素過氧化酶連接法。 該法是ABC法基礎(chǔ)上的進一步改良，使卵白素與鏈霉（而非生物素）結(jié)合，而后再結(jié)合PO基。第24頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 免疫組化原理及流程介紹1） 加入 SP 復(fù)合液后放入 37 度烤箱中 30 min。 2） 用 PBS 洗 5 次5 min。具體操作：

12、SP染色法的特點: 靈敏特異性低，成本低。第25頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹8.顯色 在免疫組化中，由于抗原抗體所形成的復(fù)合物本身沒有顏色，不能直接觀察，只能借助于其他某些化學(xué)基團的顯色作用，是復(fù)合物顯色，有利于顯微鏡下觀察。第26頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹 通常在過氧化物酶（HRP）法中，顯色劑為DAB。DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺顯色液)配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法第27頁，共46頁，2022年，5月20日，5

13、點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹9、復(fù)染、脫水、透明、封片 復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進行定位，經(jīng)常用的試劑為蘇木素。 片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返藍即可。第28頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一1) 用 PBS 3 次3min 后，用雙蒸水洗 5 min；加一大滴蘇木素染液，（胞核蛋白染幾秒，胞漿或胞膜蛋白染 20 s ），自來水沖洗，雙蒸水洗 5 min，再用 PBS 返藍 5 min。 2) 脫水：50% ethanol (1-2) min;70% ethanol (1-2) m

14、in ;95% ethanol （1-2） min； 95% ethanol （1-2） min； 100% absolute ethanol: (1-2) min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。3) 透明：Xylene 1(1-2) minXylene 2(1-2) min 4) 封片：中性樹膠。 免疫組化原理及流程介紹第29頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹四 免疫組化結(jié)果分析免疫組化結(jié)果的判斷原則：1.必須設(shè)對照。2.抗原表達必須在特定部位。3.陰性結(jié)果不能視為抗原不表達。第30頁，共46頁，2022年，5

15、月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹實驗分析的相關(guān)介紹陽性對照： 用已知抗原陽性的切片與待檢標(biāo)本同時進行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。對照切片呈陽性結(jié)果，標(biāo)為陽性對照。第31頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 用確證不含已知抗原的標(biāo)本作對照，應(yīng)呈陰性結(jié)果，稱陰性對照。其實這只是陰性對照中的一種，陰性對照還應(yīng)包括空白、替代、吸收和抑制實驗。陰性對照：第32頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹陽性對照陰性對照替代對照實驗 組結(jié)論1操作錯誤2非特異性反應(yīng)3陰性對照含定位Ag4陰性對照不含定位Ag5受檢組織非特異性染色6受檢組織不含定位

16、Ag7受檢組織含定位Ag免疫組化染色實驗組與對照組結(jié)果分析表第33頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹 從表上可以看出，只有6，7實驗結(jié)果有意義。15均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定Ab的特異性或因IHC技術(shù)操作存在錯誤等而使實驗結(jié)果失去意義，必須重復(fù)實驗或換用 Ab. 陽性對照陰性對照替代對照實驗 組結(jié)論6受檢組織不含定位Ag7受檢組織含定位Ag第34頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹1陽性染色特點 Ag定位，胞漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。（非特異性染色 細(xì)胞與組織無區(qū)別） 染色強度不同：顏色深淺不一（非特異性染

17、色 彌散性均勻）。除上述對照結(jié)果分析之外，還必須從以下幾個方面綜合評價：第35頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一 2組織切片制作過程的影響 固定不良非特異性染色，顯示不均。 邊緣干燥非特異性染色（常見），加抗體時勿干片。免疫組化原理及流程介紹3人工假象與特異性結(jié)果顯示不在同一 平面上。第36頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹染色失敗的幾種原因：(1)所染的全部切片均為陰性結(jié) 果，包括陽性對照在內(nèi)。染色失敗的可能情況(2)所有切片均呈陽性反應(yīng)(3)所有切片背景過深(4)陽性對照染色良好，檢測的 陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)第37頁，共46頁

18、，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹(1) 所有切片呈陰性 1）染色未完全嚴(yán)格按照操作步驟進行 2）漏加一種抗體，或抗體失活3）緩沖液內(nèi)含疊氮化鈉，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)?shù)?8頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹切片在染色過程中抗體過濃，或干片了。緩沖液配置中未加氯化鈉和PH值不準(zhǔn)確，洗滌不徹底。使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應(yīng)時間過長?？贵w溫育的時間過長。H2O2 濃度過高，呈色速度過快且粘 附劑太厚。（2）所有切片呈陽性反應(yīng)，其原因：第39頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹（3）所有切片背景過深 內(nèi)源性過氧化酶沒有完全阻斷 切片或涂片過厚 漂洗不夠 底物呈色反應(yīng)過久 蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血 使用全血清抗體稀釋不夠第40頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一免疫組化原理及流程介紹（4）陽性對照染色良好，檢測的陽性標(biāo)本呈陰性反應(yīng)。 最常見的原因是：標(biāo)本的固定和處理不當(dāng)?shù)?1頁，共46頁，2022年，5月20日，5點24分，星期一1.蘇木素復(fù)染時間需要摸索，尤其要考慮陽性染色的位置。2.切片脫蠟