免疫共沉淀技術(shù)

1、免疫共沉淀技術(shù)第1頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一定義及原理操作流程優(yōu)點和不足注意事項應(yīng)用及實例展望第2頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一定義及原理免疫共沉淀定義 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,CO-IP)也稱免疫共吸附或免疫下拉技術(shù)，能夠從細胞裂解物中特異性的分離并富集目標蛋白。 CO-IP是通過抗原抗體之間的專一性作用為基礎(chǔ)來研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。也是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。第3頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一基本原理 在細胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗體，孵

2、育后再加入與抗體特異結(jié)合的偶聯(lián)于sepharose beads上的proteinA/G,與細胞中的抗體結(jié)合，形成一種復(fù)合物：目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗體-proteinA/G,經(jīng)過變性凝膠電泳，復(fù)合物分開。 最后通過免疫印跡或質(zhì)譜檢測目的蛋白。第4頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一原理流程示意圖第5頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一操作流程免疫共沉淀實驗流程(1)蛋白樣品準備 （如果為細胞樣品需先裂解）(2)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)(3)Protein A/G 與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合 (4)免疫復(fù)合物與protein A/G 解離 （2%SDS煮沸處理）

3、(5)分析鑒定 （Western Blot或質(zhì)譜分析）第6頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一實驗流程如圖所示第7頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一優(yōu)點和不足優(yōu)點1.可以分離到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物2.蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進行的，可以避免人為影響。缺點和局限性1.難以檢測蛋白質(zhì)的低親和力和短暫的相互作用2.不能夠確定第三種蛋白的橋聯(lián)作用第8頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一應(yīng)用及實例應(yīng)用領(lǐng)域： 免疫共沉淀實驗用途非常廣泛，但一般主要用于低豐度蛋白的富集和濃縮，為SDS和MS質(zhì)譜分析鑒定準備樣品。應(yīng)用范圍:1.尋找新的

4、相互作用蛋白2.驗證目的蛋白和待測蛋白是否有相互作用第9頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一實例鼻咽癌細胞中p53相結(jié)合蛋白的分離和鑒定P53基因是一種人體抑癌基因，人體癌癥一半由于該基因突變失活1.抗P53抗體與HEN1和HEN2細胞總蛋白進行免疫共沉淀。2.SDS分離免疫沉淀復(fù)合物3.切取p53結(jié)合蛋白條帶，酶解后進行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到相應(yīng)肽列標簽4.搜索數(shù)據(jù)庫分析目的蛋白相關(guān)數(shù)據(jù)進行后續(xù)研究第10頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一染色質(zhì)免疫沉淀 (CHIP)研究體內(nèi)DNA蛋白質(zhì)相互作用的重要工具。 它不僅可以靈敏地檢測目標蛋白與特異DNA

5、片段的結(jié)合情況，還可以用來研究組蛋白與基因表達的關(guān)系。第11頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一CHIP原理在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段對目的片斷的純化與檢測第12頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一操作步驟一、固定 在活細胞狀態(tài)下，用甲醛固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機械（超聲波）的手段將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段。二、免疫沉淀 利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體，然后沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。三、純化與檢測 經(jīng)蛋白質(zhì)與DNA 解偶聯(lián)，DNA片段純化等處理后，用PCR等方法檢測DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況.第13頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一注意事項超聲波破碎條件的選擇抗體量的選擇PCR反應(yīng)條件的選擇Input對照陽性對照：如組蛋白抗體陰性對照：陰性引物條件選擇對照設(shè)置第14頁，共16頁，2022年，5月20日，5點19分，星期一基因表達:反式因子和順式作用元件之間相互作用。 真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明