分析化學 高效液相色譜

1、分析化學 高效液相色譜第1頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一3-1 概 述 HPLC是60年代在GC和經(jīng)典液相色譜基礎上發(fā)展起來的。 GC柱效高，且能分離、定量，但有些熱穩(wěn)定性差，不易揮發(fā)的組分不能用GC直接分析，人們想到模仿GC，用細顆粒固定相，薄殼固定液，以增加柱效。 模仿LC用液體作流動相，在室溫下進行，但阻力太大，液體流動相難以通過，所以又想到加高壓泵，加快流動相流速，這樣即增加了柱效，又加快了分析速度，也拓寬了應用范圍，把柱子、高壓泵、檢測器配成儀器，就形成高效液相色譜儀。 第2頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 HPLC與LC的比較

2、LC HPLC柱徑 1 2cm 2 5mm顆粒 150 200m 5 10 m壓力 常壓 高壓 tR 1 20h 1h內(nèi) n 2 50 105 / 米用途 初步分離 高效分離、高靈敏度定量裝置 非儀器化 精密儀器，自動化.智能化 HPLC 優(yōu)點： 柱效高 分析時間短 可定量 儀器分析第3頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 HPLC與GC的比較 GC HPLC 流動相 g l溫度 高溫 室溫組分 易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好 不受限制可測有機物 20% 75%80% tR 130min 160min靈敏度 10-1210-14g/ml 10-910-11g流出物 不易收集 易收集

3、HPLC 優(yōu)點： 應用范圍廣，組分易回收第4頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 GC與 HPLC選擇：小分子熱穩(wěn)定性好GC大分子熱穩(wěn)定性差HPLC tR 短GC優(yōu)點： g 廉價 靈敏度高第5頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 二.HPLC法的特點： 1. 高效分離 n =105 /米 2. 高速 使用高壓泵，出峰時間幾分鐘到幾十分鐘 3. 高靈敏度 檢測下限：10-910-13g（最小檢測量） 4. 自動化程度高（儀器分析、電腦控制、色譜工作站） 5. 應用范圍廣 可測有機物75%80%一. HPLC法的分類 吸附色譜 l s 離子交換色譜法 尺

4、寸排阻色譜法l l 正向色譜 反向色譜第6頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一二、高效液相色譜法的特點 feature of HPLC 特點：高壓、高效、高速、高靈敏度 高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。第7頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一分配系數(shù) K=組分在固定相中的濃度 /組分在流動相中的濃度 =CS / CM分配系數(shù)的差異是所有色譜分離的實質(zhì)性原因3-2 影響分離的因素 factors influenced separation第8頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一1. 影響分離的因素與提高柱效的途徑

5、 在高效液相色譜中, 液體的擴散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴散項B/U較小，可以忽略不計，即： H = A + C u 故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。第9頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。第10頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 2.流速 流速大于0.5 cm/s時, Hu曲線是一段斜率不大的直

6、線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。 3.固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術要求非常高的工作，一般很少自行制備。第11頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一高效液相色譜儀 由五大部分組成：高壓輸液系統(tǒng) 進樣系統(tǒng) 分離系統(tǒng) 檢側(cè)系統(tǒng) 記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 分析流程：流動相1 高壓泵 進樣器 流動相貯液槽 壓力表流動相2 微機 梯度洗 脫裝置 色譜柱餾分收集器 檢測器第12頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星

7、期一儲液瓶分布器過濾2m高壓泵入口檢查出口檢查脈流消除抽氣過濾器反壓調(diào)節(jié)壓力計注樣閥分離柱到檢測器HPLC儀器詳解第13頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一第14頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一第15頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 一. 高壓輸液系統(tǒng) 1. 高壓輸液泵：恒壓泵（流量隨阻力變化重現(xiàn)性差） 恒流泵（多用）：往復式 注射式 作用：將流動相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)。 性能：有足夠的壓力 輸出流量恒定，可調(diào) 輸出壓力平穩(wěn) 泵室體積小 泵體抗腐蝕、耐酸馬達往復式拉動密封溶劑球閥脈動阻尼器到色譜柱機械往復柱塞泵

8、示意圖第16頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 2. 梯度洗脫裝置 作用：將兩種或兩種以上溶劑按一定程序連續(xù)改變配比，以改變流動相極性、離子強度、 PH值、提高分離效率。 低壓梯度洗脫（常壓混合，高壓進柱，1個泵。） 高壓梯度洗脫（高壓混合，高壓進柱，2個泵。） 貯液槽1 貯液槽2 貯液槽1 貯液槽2 梯度洗脫裝置 程序控制 高壓泵1 高壓泵2 混合室 高壓泵 梯度洗脫裝置 進柱 進柱 低壓梯度洗脫 高壓梯度洗脫不易改變流動向配比,自動化程度低 隨時改變流動向配比,自動化程度高第17頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 二.進樣系統(tǒng) 注射進樣：裝置

9、簡單、死體積小。但進樣量小且重現(xiàn)性差。 六通閥進樣：目前最常用，由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準確，重復性好，如圖。 圖12-5 六通閥進樣示意圖a載樣(樣品進入定量管) b倒閥(樣品導入色譜柱) 1定量管 2樣品進入口 3流動相進口 4色譜柱1. 載樣管第18頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一裝入樣品出口進樣采樣環(huán)泵入溶劑進色譜柱第19頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 三.分離系統(tǒng)：色譜柱 不銹鋼 直型 分析：內(nèi)徑 26mm 長1030cm 制備：內(nèi)徑 1025mm 長1550cm 恒溫器：電熱恒溫裝置（室溫150） 恒溫水浴類套（70以

10、下） 作用：保證分析時溫度恒定，否則對tR影響較大 第20頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 四. 檢測系統(tǒng) 1.紫外可見光度檢測器： 固定波長：254nm ， 低壓汞燈。 可調(diào)波長：190800mm， 鎢燈，氘燈。 光電二極管矩陣檢測器： 190700nm。 石英窗接色譜柱UV光電倍增管廢液第21頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 光電二極管矩陣檢測器特點： 靈敏度高、分辨率好、方便、快速、準確，可掃描得三維流出曲線 紫外檢測器的應用： 對紫外有吸收的組分，且吸光度與濃度成正比。 紫外檢測器的特點： 靈敏度高 最小檢測濃度10-9g/ml 線性

11、范圍寬 對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫 應用范圍廣第22頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一波長可的松氟美松皮質(zhì)酮快速掃描光電二極管陣列（PDA）檢測所獲得的三維色譜-光譜圖第23頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 2. 熒光檢測器：多波長熒光檢測器（濾光片） 熒光分光檢測器（光柵分光） 氘燈作激發(fā)光源，波長范圍250600nm 應用：組分吸收一定波長紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì)，且熒光強度與濃度成正比。 特點：靈敏度更高 檢測限10-1210-13g/ml（靈敏度比UV檢測器高23個數(shù)量級） 選擇性好 對溫度和流速不敏感，可進行梯度洗脫 所需試樣量

12、少，適于痕量分析 應用范圍廣 3、電化學檢測器 電導、庫侖、極譜、安培、電位等檢測器。第24頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一一、液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatograph二、液-液分配色譜liquid- liquid partition chromatograph三、離子交換色譜ion-exchange chromatograph四、離子色譜ion chromatograph五、離子對色譜ion-pair chromatograph六、排阻色譜size- exclusion chromatograph七、親和色譜(AC)A

13、ffinity chromatograph3-3 主要分離類型與原理basic principle and main separating types第25頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一一、 液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性； 缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；第26

14、頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一二、 液-液分配色譜liquid- liquid partition chromatography 固定相與流動相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相和流動相上的分配； 流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。正相與反相的出峰順序相反； 固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學鍵合固定相：將各種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。第2

15、7頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一三、 離子交換色譜ion-exchange chromatography 固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂； 流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長； 陽離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH- 應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。第28頁，

16、共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一四、 離子色譜ion chromatography 離子色譜是在20世紀70年代中期發(fā)展起來的一中技術，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術和電導檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。 第29頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一五、 離子對色譜ion pair chromatography 原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配； 陰離子分離：常采用烷

17、基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子； 陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子； 反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+ X -后；在兩相間分配。第30頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一六、 排阻色譜size- exclusion chromatography 固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最

18、快；溶劑分子小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰； 可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離 第31頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一七、 親和色譜(AC) Affinity chromatograph 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。 先在載體表面鍵合上一種具有一般反應性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。第32頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一一、液相色譜固定相stationa

19、ry phase of HPLC二、液相色譜流動相 mobile phase of HPLC3-4 液相色譜的固定相與流動相stationary phase and mobile phase of HPLC第33頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一一、液相色譜固定相 stationary phases of LC 1. 液-液分配及離子對分離固定相 （1）全多孔型擔體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見； 現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料； （2）表面多孔型擔體 （薄殼型微珠擔體） 3040m的

20、玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；第34頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一（3）化學鍵合固定相 化學鍵合固定相: 目前應用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機溶劑，應用最廣； c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN第35頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一化學鍵合固定相的特點（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊； 耐水、耐光、耐有機溶劑，穩(wěn)定； （4）選擇性

21、好，可鍵合不同官能團，提高選擇性；（5）有利于梯度洗脫； 存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定分離機理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主； 第36頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 2.液-固吸附分離固定相 種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型； 粒度：510 m； 第37頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一3.離子交換色譜分離固定相 結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂 薄殼玻璃珠為擔體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團） 樹脂類別：（1）

22、陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）（2） 陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）第38頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一 4. 空間排阻分離固定相（1）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機凝膠； 非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機械強度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。第39頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一二、液相色譜的流

23、動相 mobile phases of LC 1. 流動相特性 （1）液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。 第40頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一2. 流動相類別 按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 己烷、

24、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調(diào)整出峰時間。第41頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一3. 流動相選擇 在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小)第42頁，共48頁，2022年，5月20日，10點32分，星期一4. 選擇流動相時應注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免