利用ITS序列鑒定真菌

1、北方民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)論文題目：利用ITS序列鑒定真菌學(xué)院：生物科學(xué)與工程學(xué)院專業(yè)：生物技術(shù)班級(jí)：082姓名：李曉飛李妍吾木爾古麗張瑞莉陳波艾克拜爾指導(dǎo)老師：劉建利完成日期：2011年5月18日2011年6月5日分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)利用ITS序列鑒定真菌第 頁(yè)共7頁(yè)利用ITS序列鑒定真李曉飛李妍吾木爾古麗張瑞莉艾克拜爾陳波（北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院銀川750021）摘要：采用實(shí)驗(yàn)室提供的兩株酵母菌，活化培養(yǎng)后，經(jīng)基因組DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以ITS1和ITS2為引物構(gòu)成的PCR反應(yīng)體系對(duì)目的DNA片段（ITS1區(qū)）進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至測(cè)序公司測(cè)序，所測(cè)序列經(jīng)Genbank

2、比對(duì)后，兩株菌分別為擲孢酵母屬TY-241菌株（切OFoboZoMyces密）和假絲酵母ST-50菌株（血sp）。關(guān)鍵詞：ITS序列酵母菌PCR菌種鑒定1材料與方法1.1試驗(yàn)材料與試劑實(shí)驗(yàn)室提供的紅色擲孢酵母菌1和白色產(chǎn)香酵母菌。YEPD液體培養(yǎng)基配方：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，蛋白胨20g,配成1L溶液，分裝100/250ml,121C滅菌15min。裂解液：1L裂解液中需加Tris1.2114g,EDTA8.767g,SDS5g,用1M的NaOH調(diào)至8.0,121C滅菌30min備用。醋酸鉀溶液：1L溶液中含醋酸鉀245.35g。氯仿-異戊醇（24：1）：現(xiàn)配現(xiàn)用。70%乙醇：用95%

3、乙醇配制,現(xiàn)配現(xiàn)用。10XTAE溶液：1L溶液中含Tris1.2114g,EDTA29.22g,用HC1調(diào)pH至8.0。1%瓊脂糖凝膠：取1g瓊脂糖溶于100ml1xTAE溶液中，微波爐加熱至沸騰三次。1.2主要儀器與設(shè)備表一實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器儀器名稱型號(hào)產(chǎn)地立式自控高壓蒸汽滅菌器LDZX-40SSI上海申安醫(yī)療器械廠數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4國(guó)華電器有限公司電泳儀DYY-12北京市六一儀器廠制冰機(jī)AF200PSC50RMSA生物安全柜HFsafe1200/C上海力申科學(xué)儀器有限公司電冰箱BCD-219D青島海爾股份有限公司Sigma咼速離心機(jī)3K30Germany電子精密天平HR-200上海精

4、科天平酸度計(jì)DELTA302上海電子可調(diào)電爐101RF-3天津市泰斯特儀器有限公司雙層恒溫振蕩器THZ-9511K太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠紫外分析儀WD-9403C北京市六一儀器廠臺(tái)式常溫咼速離心機(jī)Centrifuge5415DGermany微量移液器多型號(hào)Germany生化培養(yǎng)箱LRH-250上海一恒科技有限公司基因擴(kuò)增儀Palm-CyelerAustralia電泳槽DYCZ-24A北京六一儀器廠1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1酵母菌的活化及培養(yǎng)采用本實(shí)驗(yàn)樓4樓保藏的紅色擲孢酵母菌和白色產(chǎn)香酵母菌4，先將菌株接于斜面中，25C培養(yǎng)24h,再轉(zhuǎn)接入三角瓶中100ml/250ml,25C培養(yǎng)24h,保存于4C冰

5、箱備用習(xí)。1.3.2酵母菌基因組DNA的提取DNA的提取按照Makimura等6(1994)的方法進(jìn)行。用移液器吸取1ml菌液，置于已滅菌的1.5ml的離心管內(nèi)，常溫下12000rpm離心1min,棄上清；加入250卩1裂解液；100C水浴15min；加入250卩12.5M的醋酸鉀后，置于冰上30min至1h；在4C下13000rpm離心5min,上清夜移至一新1.5ml離心管內(nèi)；加入500卩1的氯仿-異戊醇(24：1),劇烈振蕩，13000rpm，離心15min,移取上清夜至另一滅菌的1.5ml的離心管內(nèi)；重復(fù)上一步，直到兩相之間沒(méi)有沉淀，將上清液移至另一滅菌的1.5ml的離心管內(nèi)；加入50

6、0卩1的冷的異丙醇，放置在-20C靜置15min；13000rpm離心15min；用1ml70%的乙醇洗滌沉淀；用1ml70%的乙醇再次洗滌沉淀；將沉淀置于室溫下干燥；加入50卩1已滅菌的ddH2O，在室溫下溶解2h；(放于-20C冷藏備用；1.3.3酵母菌基因組DNA的檢測(cè)制備瓊脂糖凝膠：將10XTAE貯存液用蒸餾水稀釋成1XTAE電泳緩沖液，待用，按1%稱取適量瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加入對(duì)應(yīng)量1XTAE稀釋緩沖液，蓋上封口膜，以減少水份蒸發(fā)，放入微波爐里加熱沸騰，取出搖勻，使瓶壁上粘附的瓊脂糖全部溶解，反復(fù)3次，至瓊脂糖全部熔化，放置，待其稍冷卻。膠板的制備：將制膠槽置于水平支持

7、物上，選擇合適厚度和齒數(shù)的樣品梳，插上梳子。向冷卻至50-60C的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液數(shù)滴，搖勻，小心地倒入制膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后，小心撥出梳子，將膠塊取出，置于已加入足量1XTAE電泳緩沖液得電泳槽內(nèi)。加樣：取20glDNA樣品與2gl6x加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中，在第一個(gè)上樣孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入5gl的100bpDNAladder。電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，以5V/cm(約100V)電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。成像：戴上一次性手套，在波長(zhǎng)為254nm的長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下觀察膠塊，DNA存在處顯示

8、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)利用ITS序列鑒定真菌第 頁(yè)共7頁(yè)出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，用凝膠成像系統(tǒng)照相（本實(shí)驗(yàn)中儀器損壞，直接用相機(jī)拍照）。1.3.4ITS片段的PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)1.341PCR反應(yīng)體系見(jiàn)下表，于冰浴下進(jìn)行8。試劑濃度PCR緩沖液（包含TaqDNA聚合酶、Mg2+和dNTP）2.5x10正向引物10卩M0.2反向引物10卩M0.2模板DNA10ng/pl-1pg/pl1.0ddH2O13.6表二核糖體基因反應(yīng)體系的組成（25卩1體系）體積（卩1）1.3.4.2根據(jù)下表的引物和PCR反應(yīng)條件對(duì)目的序列進(jìn)行擴(kuò)。表三核糖體基因PCR反應(yīng)所用引物和反應(yīng)條件擴(kuò)增片段引物（53）PCR擴(kuò)

9、增反應(yīng)條件ITS1區(qū)ITS1:GTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG95C5min；(94C45s,52C1min,ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGC72C30s)x30；72C8min。1.3.4.3PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)，采用瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)檢測(cè)同1.3.3。ITS片段的測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物郵寄至測(cè)序公司，由測(cè)序公司完成測(cè)序。BLAST比對(duì)、鑒定屬、種登錄NCBI主頁(yè)-點(diǎn)擊BLAST-點(diǎn)擊Nucleotide-nucleotideBLAST在Search文本框中粘貼檢測(cè)序列-點(diǎn)擊BLAST-點(diǎn)擊Format-得到resultofBLAST。2結(jié)果與分析2.1基因組

10、DNA電泳圖圖一酵母菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖-asaratrp事IDOOOtrp+SQOObp+5Dcnbp-iSCMbp如上圖所示，標(biāo)號(hào)“1”為紅色擲抱酵母菌的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；標(biāo)號(hào)“2”為白色產(chǎn)香酵母菌的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；C為對(duì)照組，無(wú)任何條帶；標(biāo)號(hào)“M”為Mark,共有15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp等8類DNA片段，根據(jù)原圖對(duì)比，本次實(shí)驗(yàn)只可以檢測(cè)到15000、10000、7500、5000、3000、1500bp等6類DNA片段。酵母菌的基因組DNA破損片段較小，從圖中可以看到，紅色擲抱酵母DNA片段小

11、于5000bp,集中于3000bp以下；而白色產(chǎn)香酵母的DNA片段有大于15000bp的，集中區(qū)段為5000到1500bp。ITS1片段大小為500bp左右，故這樣大小的DNA片段可以滿足PCR要求。2.2PCR產(chǎn)物電泳圖圖二酵母菌ITS1片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖二l1122CM1500bpIDDDbp9DDbpSOObp7D0bp6DDbp500bp4Q0bp如上圖所示，標(biāo)號(hào)T”為白色產(chǎn)香酵母菌的ITS1片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；標(biāo)號(hào)“2”為紅色擲抱酵母菌的ITS1片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；“C”為對(duì)照組，物任何條帶；標(biāo)號(hào)“M”為Mark，共有1500、1000、900、8

12、00、700、600、500、400、300、200、100bp等11類DNA片段，根據(jù)原圖對(duì)比，本次實(shí)驗(yàn)只可以檢測(cè)到1500、1000、900、800、700、600、500、400bp等8類DNA片段。從圖中可以看到，白色產(chǎn)香酵母菌和紅色擲抱酵母菌的ITS1片段PCR產(chǎn)物大小均位于500-600bp之間，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符，目的條帶前端存在干擾小條帶，可能為引物二聚體所致。2.3菌株序列與鑒定結(jié)果2.3.1紅色酵母菌鑒定結(jié)果紅色酵母菌ITS1序列：共594bp。1tttccgtaggtgaacctgcggaaggateattagtgaatetaggacgttcaatttaacttgaagtcc

13、gaac71tetcactttctaaccctgtgcatttgttttggttagtaggattegtetgaacacctetteatttacaaac141acaaagtetatgaatgtataaagtttataacaaaacaaaaetttcaacaacggatetettggctetcgca211tcgatgaagaacgcagcgaaatgtgataagtaatgtgaattgcagaatteagtgaateatcgaatetttg281aacgcatettgcacteettggtattccgaggagtatgtetgtttgagtgteatgaattettcaaccctet351ct

14、tttcttagtgattggagcggagtttggattetgagtgttgctcctaacccgagcteattegtaatgta421ttagcatccatatttgagtttcggattgacttggcgtaataagactattegetgaggaatetaacttegg491ttagaagccgtgtttgaactaggaagctaetaatetagettaagtctacttttagattagaceteaaate561agataggattacccgctgaaettaaagcatatea與Genbank比對(duì)結(jié)果QuerySbjetQuerySbjetQuerySbjetQuerySb

15、jcttjuerySbjctQuerySbjetQuerySbjetQuerySbjetQuerySbjetQuerySbjet1GAATCTAGGACGTTC/kTTTAACTTGA/kGTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCATliiIliiliiIIIHiliillliiiiIHiIiiillIlil35GAAJCTAGGACGTTCAATTTAACTTGAAGTCCGAACTCTCACTTCTAACC匚TG丁G匚盤1”.61TGTTrrGGTAGTAGGATTCGTCI，GAACACCrrCTTCATTTACAAACACGTCIATGMIIIililllNIlliil

16、iiIIIiiliiililiilIiHi95TGTTTTGGTAGTAGGATTCGTTGMCACCTeTTCxUTTACkUCxCAMGWTATGAA11T.GTATAAAGTTTATAACAAA?lCAAAACT.rrCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAIIII155.TGTATAMGTTATAACAAAACAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGA181215GICJGGTTTGAGrGTCA1IIIIIIITC11rGAC：GCA；lliiiilCT1IGCACllilifCCTIiIGGlIITC1TGAACGCACT1GC

17、ACIreelPIGGTTGAAGAACGCAGCGAATGTGATAGTATGIIIliiilllliiiiI：IiiliiiTGAGA/kCGCAGCGAA/kTGTGATAAGTAATG241275ATTCCGAGGAGTA1iliillhlilllATTOCGAGGAGrATGrCTGTrGAGrGTCATG301MTTCTTCAACCCTCTCTTTTCTTAGT!CATTG(3AGCGGAGTTTGGATTCTGAGTGTT.GCTiiIIliillIIIilIIliilii.IIiiiIill.ii335mttcttcaaccctctcttttcttaggattggagcggag

18、tttggattctgagtgttgct60941201541802142402743003343603944204544S0514361CC1AACCCGAGCTCATTCG：7TAGCA1-ccaiATTTGAG1T1TCGGA7TGA0TTGGIillllllilIIliH1iiiillil1Iiilili11II395CC1AACCCGAGC1TATTCG1KTTAGCA1TCAlTGAG1T1TCGGATTGACTTGG421CGTA/TA/kGACTATTCGCTGAGGAATCTA/kCTTCGGTTAGA/lGCCGTGTTTGAACTAGGAIiiiliiiiiHiHliii

19、IiiililiiiiiiliIliiilili455CGTAATAAGACTAiTCGCTGAGGAAT匚TAACT匚GGTJ盤GAAG匚匚GTG1TTGAACTAGGA481xGCTACTMCTAGCrTMGTCACTTTACAr-rACACC-TCmTCAGAlWGCAT-rACCC540illiiiiIilliilIiiiiiiliUIliiIlllillliiii515AGCTACTAACTAGCTTAAGTCTACTTTTAGArTAGACCTCAAjTCAGATAGGATTACCC-574541GCTGAACTTaAAGCATATCA560IIIIIilllllIII57&.GG

20、TGMCTTaMGCATATCA594鑒定結(jié)果紅色擲抱酵母屬于Sporobolomycessp,TY-241菌株。其分類學(xué)地位如下:Eukaryota;Fungi;Dikarya;Baidiomycota;Pucciniomycotina;Agaricostilbomycetes;Agaricostilbomycetesincertaesedis;mitosporicAgaricostilbomycetidae;Sporobolomyces.真核生物；真菌界；雙核亞界；擔(dān)子菌門；柄銹菌亞門；冬抱菌綱；黑粉菌目；擲抱酵母科；擲抱酵母屬。2.3.2白色酵母菌鑒定結(jié)果白色酵母菌ITS1序列：共551

21、bp。1aaaccaacagggattgcctcagtaacggcgagtgaagcggcaaaagcteaaatttgaaagccteggeatt71gtaatttcaaggcggcagaccacaccgaccacaagtccattggaacatggcgccacagagggtgacagcc141ccgtaggtegcagcgcgtgtettccgccaaagagtegagttgtttgggaatgcagctetaacggtggtaa211attccateaaaagctaaataccggcgagagaccgatagegaacaagtaeagtgatggaaagatgaaaagc281aettt

22、gaaaagagagtgaaacagtaegtgaaattgttggaagggaagggtttgggagcagacacggtteg351gccgggccageatcaattaegcgcgcgccacaaaacgcccgagaacgtaagccgteteggtggttatage421tcggcgccatagcgcgcgcgtgattgaggacagcatatteaggatgetggegtaatgettccaaaccgcc491egtettgaaacacggaccaaggagtetaacgtccatgeaagtgtttgggtgcaaaacccca與Genbank比對(duì)結(jié)果QuerySbjctQue

23、rySbjctQuerySb.ictQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjct6.MUCAACAGGGArTGCCTCAGTMCGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAAGIllillllllllIIIIIIlllllllillllllllllllllIlliHilliamcCaacagggattgcctcagtmcggcgagtgaagcggcaaaagcTcaaatttgaaag66CCTCGGCATTGTMTTTCAAGGCGGCAGACCACACCGACCACGTC

24、CATTGGAACATGGIIHillIIIllllllllllllllllllllllllllllIIIllllllII61U.CTtGCATTGTMTTTCAAGGCGGCAGACCACACGGACCACMGTCCATTGGAACATGG12.6:CGCCACAGAGGGTGACAGCCC0GTAGGTCGCAGCGCGTG7CTTCCGCCjkAAGAGTCGAC，llll：lllllllllllllllllIIIlllllllilIIlllllllllllIlli121CGCCACAGAGGGTGACAGCCC0GTAGGTCGCAGCGCGTG7CTTCCGCC.MGAGTCGAG1

25、8611TGGGAA1HillGCAGCIHill1“AAOGHillrGGlIIAAATIIITCCAlIIICAaAAGCIlllllllAAAlIIIACCGGCG/iGAGlllllllllll1S11G7GGGAA1GCAGC1ClAACGG1rcGirw.TTCCAqVAaAAGCIAAAACCGGCGAGAG245ACCGATAGCGMCJAGTACAGTGATGGAAAATGAAAAGCACT11GAA.AGAGAGTGMAHIPllllllllllIlliIIlllllllllllllillllllllllllIlli241ACCGATAGCGMCAAGTACAGTGATGG

26、AAAGATGAAMGCACTTTGAA.ViGAGAGTGmFO6CAGTACGTGAAATTGTTGGAAGGGAAGGGnTGGGAGCAGACACGGTTCGGCCGGGOCAGIIIMlIlliIllllllllllllllllllllllllllllllllllllll301CAGTACGTGAAATTGTTGGMGGGAAGGGT7TGGGAGCAGACACGGTTCGGCCGGG0CAG36S：CATCUTTACGCGCGCGCCACJ.CGCCCGAGMCGTAAGCCGTCTCfJGTGGTTATAGCIIIIIlllllllllllllllllllllllllllllHl

27、lllIIIIIIIIII3&1CAlCAAirACGCGCGCGCCAUAAAACGCCCGAGMCGTAAGCCGTCTCGGTGGlrAlAGC426TCGGCGCCATAGCGCGCGCGTGTTGAGGACAGCATATTCAGGATGCTGGCGTAATGCllllllllllllllllIIllllllllllIMillIIIlliIIII拒1tcggcgccatagcgcgcgcgtgttgaggacagcatattaggatgctggcgtaatgc48&犯1546541CCAAACCGCCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCTAACGTCCATGCGTGTT

28、TGGGTiiimiiiiiiIllllllllIIIIIIIlliIINIIIIHillIIIICCAAACCGCCCGTCTTGW.CACGGACCAAGGAGTCTAACGTCCATGCUGTGTTTGGGTGCAAAACCCCAGCAAAACCCCA556551656社1251.20185ISO24524030530036536d醴54204854SO545540.鑒定結(jié)果白色產(chǎn)香酵母菌屬于Candidasp,ST-50菌株。其分類學(xué)地位如下：Eukaryota;Fungi;Dikarya;Ascomycota;Saccharomycotina;Saccharomycetes;Sacc

29、haromycetales;mitosporicSaccharomycetales;Candida.真核生物；真菌界；雙核亞界；子囊菌門；酵母亞門；酵母綱；酵母目；隱球酵母科;假絲酵母屬。圖四Candidasp,ST-50圖三Sporobolomycessp,TY-241分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)利用ITS序列鑒定真菌第7頁(yè)共 頁(yè)3討論酵母菌基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果由圖一可知，所提取出來(lái)的基因組DNA片段比較小，只有5000bp以下，與酵母菌單染色體大小107bp相差較大。具體原因可能如下：在DNA提取步驟中，加完裂解液后要100C水浴10min，時(shí)間可能過(guò)長(zhǎng)，是DNA斷裂較為厲害；在用氯仿異戊醇抽提蛋白質(zhì)時(shí)，要?jiǎng)×覔u動(dòng)10min,這樣的步驟