化學(xué)微生物學(xué)微生物轉(zhuǎn)化

1、化學(xué)微生物學(xué)微生物轉(zhuǎn)化第1頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二UM-BBD第2頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第一節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化歷史一、轉(zhuǎn)化歷史第3頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二、酶促轉(zhuǎn)化歷史第4頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三、與傳統(tǒng)化學(xué)的比較第5頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二 微生物轉(zhuǎn)化方法 從20世紀(jì)50年代開始，微生物學(xué)家通過有機化學(xué)、物理學(xué)、生物化學(xué)和遺傳基因?qū)W等學(xué)科的幫助，來研究了微生物代謝產(chǎn)物中的化學(xué)組成以及生命活動中酶和酶的化學(xué)反應(yīng)使

2、生物學(xué)科向分子水平發(fā)展；同時也提供了微生物學(xué)向化學(xué)學(xué)科的滲透。微生物學(xué)研究者應(yīng)用現(xiàn)代的生物技術(shù)來幫助生物化學(xué)和有機化學(xué)工作者解決一些復(fù)雜和疑難的微生物代謝產(chǎn)物和化學(xué)合成的反應(yīng)創(chuàng)造出不少人工合成的新化合物，推動了生物化學(xué)和有機化學(xué)的發(fā)展。 第6頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二微生物轉(zhuǎn)化是通過微生物細胞將復(fù)雜的底物進行結(jié)構(gòu)修飾，也就是利用微生物謝過程中產(chǎn)生的某個或某一系列的酶對底物特定部位(基團)進行的催化反應(yīng)。微生物作為一個生命體，其體積雖小，但有一套自身特異性的酶體系。在它的生長過程中有無數(shù)酶的參與，合成酶、水解酶、異構(gòu)酶、氧化酶、還原酶等都可能對加入其中的底物發(fā)生

3、作用，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。正因為微生物有著這獨特的優(yōu)點，微生物轉(zhuǎn)化就具備了生物量積累快、轉(zhuǎn)化時間短、轉(zhuǎn)化酶表達效率高、便于工業(yè)化生產(chǎn)的特點。第7頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二微生物轉(zhuǎn)化歷史悠久，早在2500年前的春秋戰(zhàn)國時期，人們就已經(jīng)知道制醬和醋。在宋代，采用老的曲子進行接種，還根據(jù)酸大米和明礬水在較高溫下培養(yǎng)制造紅曲。不過當(dāng)時人們并沒有認(rèn)識到可以利用微生物來合成化學(xué)物質(zhì)。因此一般認(rèn)為微生物轉(zhuǎn)化研究始于1864年巴斯德利用乙酸桿菌將乙醇氧化為乙酸，但工業(yè)化微生物轉(zhuǎn)化的重要里程碑應(yīng)該是20世紀(jì)50年代美國普強藥廠的Murray和Peterson利用微生物黑根霉(Rh

4、izonpus nigricans)的羥化酶將黃體酮轉(zhuǎn)化為11-羥基黃體酮，即對甾體化合物的結(jié)構(gòu)改造。第8頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二利用微生物的作用來進行某種化學(xué)反應(yīng)稱為微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)(microbial transformation or microbial bioconversion)。準(zhǔn)確地說應(yīng)該是利用微生物代謝過程中某一個酶或者一組酶系對底物進行催化反應(yīng)稱為微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。隨著生物學(xué)科進一步發(fā)展，特別是固定化細胞、誘變和基因重組等重要的生物技術(shù)的發(fā)展，不僅使得生物轉(zhuǎn)化成倍地提高轉(zhuǎn)化率，并且能將幾種不同合成基因構(gòu)建到同一個工程菌中使得一次培養(yǎng)同時進行幾步

5、轉(zhuǎn)化反應(yīng)，使微生物轉(zhuǎn)化在天然藥物修飾中發(fā)揮更重要的作用。第9頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第一節(jié)微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進步，特別是固定化細胞、誘變和基因重組等的發(fā)展，使微生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率成倍提高，也為天然藥物結(jié)構(gòu)修飾帶來了廣大的發(fā)展空間。不同類的微生物都含有不同的酶系。現(xiàn)在將目前應(yīng)用和研究上用得比較多的微生物按化學(xué)反應(yīng)分類。第10頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二1應(yīng)用于氧化反應(yīng)(1)脫氫反應(yīng) 應(yīng)用于脫氫反應(yīng)的主要是細菌第11頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第12頁，共151頁，2022年，5月

6、20日，16點46分，星期二第13頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二(2)羥基化反應(yīng)應(yīng)用于羥基化反應(yīng)的主要是放線菌第14頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二2、應(yīng)用于水解反應(yīng)應(yīng)用于水解反應(yīng)的主要是細菌、酵母菌和霉菌第15頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二3、應(yīng)用于還原反應(yīng)應(yīng)用于還原反應(yīng)的主要是酵母菌和霉菌。第16頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二4、應(yīng)用于?；磻?yīng)應(yīng)用于酰基化反應(yīng)的主要是細菌第17頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二5、應(yīng)用于降解反應(yīng)應(yīng)用于降解反應(yīng)的主

7、要是細菌第18頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二6、應(yīng)用于脫水反應(yīng)應(yīng)用于脫水反應(yīng)的主要是細菌和霉菌第19頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第二節(jié)微生物轉(zhuǎn)化的一般過程微生物轉(zhuǎn)化實驗概要過程如下： 選擇需要的菌株 培養(yǎng)成熟菌絲或孢子 選擇合適的轉(zhuǎn)化方式 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)或轉(zhuǎn)化菌絲及孢子懸浮液轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化液的分離提取 產(chǎn)品純化第20頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二1選擇菌種選擇好的菌種是做好微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的關(guān)鍵；根據(jù)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的類型，選擇哪類微生物含這類反應(yīng)的酶。一般可以向國家或地方保管菌種機構(gòu)去函索取。2. 制備培養(yǎng)基 按微

8、生物轉(zhuǎn)化菌種的培養(yǎng)特征和轉(zhuǎn)化反應(yīng)需要配制培養(yǎng)基；一般要求培養(yǎng)基的成分能使菌絲生長豐滿和富含需要的酶。第21頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二3 加轉(zhuǎn)他底物 加底物時有兩個同等重要的影響因素：選擇合適的菌種生長期加底物；選擇加底物的方法和方式。4 添加刺激劑或抑制劑 添加抑制劑是抑制酶副反應(yīng)或抑制其他反應(yīng)不良酶的生長；添加刺激劑是提高酶活力和增加酶生長量。第22頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二5 控制好轉(zhuǎn)化反應(yīng)培養(yǎng)時間 按有關(guān)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)各種因素，控制好轉(zhuǎn)化反應(yīng)培養(yǎng)終點電，使底物轉(zhuǎn)化達到最大反應(yīng)完全值。6 調(diào)控好影響因素調(diào)控好整個轉(zhuǎn)化過程中

9、各項影響因素。7 控制好轉(zhuǎn)化反應(yīng)終點 當(dāng)取樣分析反映轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物積累不再增加時，立刻采用物理方法將菌絲體及培養(yǎng)物除去來停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。8 分離純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物此時轉(zhuǎn)化產(chǎn)物已與生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)分開，可按化學(xué)方法將產(chǎn)物分離提純第23頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三幾種常用的微生物轉(zhuǎn)化方法 隨著固定化細胞、誘變和基因重組等重要的生物技術(shù)的發(fā)展，不僅使得微生物轉(zhuǎn)化在天然藥物修飾中發(fā)揮更重要的作用，使生物轉(zhuǎn)化成倍地提高轉(zhuǎn)化率，并且使得微生物轉(zhuǎn)化方法更加豐富?，F(xiàn)在將幾種微生物轉(zhuǎn)化方法簡介如下。第24頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二1、分批培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法

10、分批培養(yǎng)(batch culture)轉(zhuǎn)化法是在搖瓶和發(fā)酵罐中待菌體生長到一定階段加入底物進行轉(zhuǎn)化的方法。底物加入時間因菌種和底物不同而各異，一般在對數(shù)生長期，但也有在延遲期和穩(wěn)定期加入的。第25頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二2、利用酶進行生物轉(zhuǎn)化 直接從微生物體內(nèi)或發(fā)酵液中將酶提出在體外對底物進行生物催化。可以經(jīng)過多步處理得到純度較高的酶。也可以是粗酶。現(xiàn)在微生物來源的酶已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工及環(huán)保等行業(yè)第26頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二3、應(yīng)用滲透細胞進行生物轉(zhuǎn)化 應(yīng)用滲透細胞進行生物轉(zhuǎn)化主要是促進底物滲入胞內(nèi)，與酶充分接

11、觸，同時便于轉(zhuǎn)化產(chǎn)物透出胞外，這種方法更適合于胞內(nèi)酶作用的生物轉(zhuǎn)化。增大細胞滲透性或改變細胞膜孔，一般采用表面活性劑或有機溶劑，有時也可利用抗生素來增加細胞膜的滲透性，但用量應(yīng)適當(dāng)控制，以免殺死微生物。第27頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二4、應(yīng)用孢子進行生物轉(zhuǎn)化細菌的孢子一般無活性，而真菌的分生孢子和子囊孢子往往有較高的酶活力，與菌絲體比較具有雜質(zhì)相對少的優(yōu)點。孢子轉(zhuǎn)化需要注意的是不能讓孢子萌芽，否則不能保持穩(wěn)定的生物轉(zhuǎn)化活力。應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化的孢子懸浮液和培養(yǎng)基成分與靜止細胞轉(zhuǎn)化法相似也是采用不完全培養(yǎng)基，僅含有緩沖液及葡萄糖等產(chǎn)生能量的碳源。第28頁，共151頁

12、，2022年，5月20日，16點46分，星期二5、應(yīng)用固定化細胞進行生物轉(zhuǎn)化 固定化細胞在適宜的轉(zhuǎn)化條件下進行生物轉(zhuǎn)化能保持細胞相對活的狀態(tài)，它的最大優(yōu)點是可以長期反復(fù)使用，有的能維持有效催化達數(shù)月之久。另外使用固定化細胞還使得產(chǎn)物提取簡單，便于自動化和大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。目前常用的固定化方法有聚丙烯酰胺聚合法和卡拉膠包埋法。第29頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二6、應(yīng)用干燥細胞進行生物轉(zhuǎn)化干燥細胞轉(zhuǎn)化法實際上是另一種靜息細胞轉(zhuǎn)化法，便于貯備隨時使用。干燥細胞的制備有以下兩種常用方法。冰凍干燥法：將培養(yǎng)好的菌絲液，通過離心或過濾，洗滌后獲得干凈的菌絲體并重新懸浮于稀

13、的緩沖液或純水中，冰凍后抽真空，直接升華除去水分得到蓬松的粉末。這種干燥菌絲體在冰凍保存的條件下可以保持活力達數(shù)年之久，適合于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。第30頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二丙酮干粉制備法：將菌絲體懸浮于一20的丙酮中處理3次，每次獲得泥漿狀的丙酮液，用抽氣過濾進行收集，最后用冷乙醚洗滌，以幫助洗去殘余的丙酮。丙酮干粉劑必須冰凍貯藏，以供隨時使用。第31頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二7 靜息細胞轉(zhuǎn)化法 靜息細胞轉(zhuǎn)化法是指將微生物培養(yǎng)至定階段后分離出菌絲體，將其重新懸浮于不完全培養(yǎng)基(缺少某種營養(yǎng)物質(zhì)，如氮源等)中，使其處于不再

14、生長但仍保持原有各種酶活的狀態(tài)，再加入底物，在適當(dāng)?shù)臏囟取H和振蕩條件下進行轉(zhuǎn)化的方法。它是一種將生長影響減至最小的生物轉(zhuǎn)化方法。第32頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二四 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的特點 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，可以用靜止地按洗滌細胞進行研究也可以用發(fā)酵方式進行轉(zhuǎn)化以及應(yīng)用固定化細胞進行生產(chǎn)等。 它跟酶法轉(zhuǎn)化和有機化學(xué)轉(zhuǎn)化比較有以下特點第33頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 1、反應(yīng)條件溫和、公害少、設(shè)備簡單且反應(yīng)速度快 在微生物轉(zhuǎn)化的反應(yīng)中一般無需高壓、強熱等比較苛刻的條件，只需在常溫和pH為7左右的環(huán)境下進行反應(yīng)即可； 原料除了普通的

15、培養(yǎng)基和底物外沒有其他化學(xué)品，一般普遍認(rèn)為公害比較少； 設(shè)備簡單，反應(yīng)條件比較溫和，生產(chǎn)安全。 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是酶催化的反應(yīng)。在最合適條件下，一秒內(nèi)酶能催化底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的分子個數(shù)數(shù)量級是102lO6第34頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二2、可以減少反應(yīng)步驟 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，酶合成基因構(gòu)建的基因工程菌可以把需要幾步催化合成的中間體在一次發(fā)酵中轉(zhuǎn)化完成。將幾步中間體合成的酶通過基因構(gòu)建到同一工程菌中，使在發(fā)酵法轉(zhuǎn)化時需要幾步催化臺成的中間體只要一步就可以轉(zhuǎn)化成功。如維生素c生物合成中基因重組葡萄糖酸氧化桿菌的代謝工程菌，將L-山梨醇脫氫酶基因和L-山梨酮脫

16、氫酶基因，通過基因重組構(gòu)建出一個工程菌株，發(fā)酵過程可以在同一次轉(zhuǎn)化發(fā)酵中將D一山梨醇轉(zhuǎn)化成一酮一L古洛糖酸。第35頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二3、對立體結(jié)構(gòu)合成上具有高度的專一選擇性 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)其實也是一種酶反應(yīng)對底物作用時，具有高度的立體結(jié)構(gòu)選擇性。微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)不僅對結(jié)構(gòu)有化學(xué)選擇性，還有區(qū)域選擇性、面選擇性和對映異構(gòu)選擇性。第36頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二嚴(yán)格的立體結(jié)構(gòu)選擇性對天然藥物微生物轉(zhuǎn)化來說是非常重要的。因為藥物的異構(gòu)不僅無用或者低效，并且會帶來副作用，有時會有相反的藥效和強力的毒性。特別是生理活性很高的激素、

17、抗生素以及心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等藥物的藥效對對映體結(jié)構(gòu)的要求很高，往往具有嚴(yán)格對映體結(jié)構(gòu)要求，這是有機化學(xué)合成等方法根難達到的。第37頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二4、回收率高、成本低 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)是在細胞內(nèi)進行，保持原來整體酶系比較符合生物催化所需環(huán)境和條件。 在氧化一還原等催化反應(yīng)時不需要添加輔酶；輔酶往往很不穩(wěn)定，難以分離提取，從這點來說微生物轉(zhuǎn)化比酶法轉(zhuǎn)化要好多了。 微生物 反應(yīng)可以持續(xù)進行、反應(yīng)量大、回收率高并可以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。從設(shè)備和原料方面來說生產(chǎn)成本低于酶法和化學(xué)合成法第38頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第三節(jié)

18、微生物轉(zhuǎn)化的影響因素利用微生物代謝過程中某一個酶或一組酶系對底物進行催化反應(yīng)，稱為微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)本質(zhì)上是一個酶反應(yīng)，因此，同酶反應(yīng)一樣，在這個催化反應(yīng)過程中涉及一系列的影響因素，其中最為重要的是轉(zhuǎn)化的時間、溫度、底物添加方法、酶的抑制劑、酶的誘導(dǎo)劑以及生長調(diào)節(jié)劑等。上述因素的變化皆會對轉(zhuǎn)化率有一定的影響。下面分別針對上述因素對微生物轉(zhuǎn)化的影響加以具體敘述第39頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二一、轉(zhuǎn)化的時間和溫度 微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)本質(zhì)上是酶反應(yīng)，是單酶或多酶的催化反應(yīng)。 既然是酶反應(yīng)，就存在一個最佳的反應(yīng)時間，時間太短則轉(zhuǎn)化不完全；時間太長，會造成微生物

19、衰亡及酶失活。 最佳反應(yīng)時間的確定可以采用高效液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、薄層掃描(TLCS)、分光光度法等定量分析手段來完成。 不同的反應(yīng)類型、不同的微生物、不同的酶，最佳反應(yīng)時間不同，有的只需幾小時，有的則持續(xù)數(shù)天第40頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 溫度也是影響轉(zhuǎn)化率的一個重要因素。溫度升高，轉(zhuǎn)化率會提高，但超過一定的限度，會使得酶失活速率也加快，所以只有在一個適當(dāng)?shù)臏囟认罗D(zhuǎn)化，才能達到最佳轉(zhuǎn)化率。最佳溫度的選擇也可通過上述分析檢測手段來確定第41頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二、底物添加方法在微生物轉(zhuǎn)化中，根據(jù)能否

20、溶于水來分，可以把底物分為兩大類，即可溶于水和不可溶于水底物。能溶于水的底物添加方法中有許多是與培養(yǎng)基中添加碳源的方法相類似，但是其轉(zhuǎn)化率與其添加方法有很大的影響。第42頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二對于能溶于水的底物來說，將其添加到水的培養(yǎng)基中進行微生物轉(zhuǎn)化是比較容易的，不過要注意加底物量的多少、添加速度和底物是否對微生物有毒性。添加底物的量一般與微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的類型，細胞內(nèi)含酶的多、少、強、弱和底物的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)；第43頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二含酶活力強和含酶量多的微生物進行轉(zhuǎn)化時，添加底物的速度可以快點，底物的量也可以多點

21、。加底物速度和量要與微生物的耐受能力相掛鉤，底物舔加的速度和總量不能超過微生物的耐受范圍，同時產(chǎn)物的積累也會對酶產(chǎn)生抑制，所以必須有一個合適的底物添加量，第44頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二一般來說，非離子化合物的底物最大投料質(zhì)量濃度約為10 ，而離子型的底物為5；不同 的微生物對有毒性的底物的耐受性不一致，一般來說在微生物生長期其耐受有毒底物的能力比較低；還得注意的一點是即使對沒有毒性的底物，當(dāng)轉(zhuǎn)化積累到大量的非毒性底物時，也會產(chǎn)生產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，所以最好用連續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵隨時分離轉(zhuǎn)化得到的產(chǎn)物。第45頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 而對

22、于不能溶于水的底物來說，將其添加到水的培養(yǎng)基中要比添加能溶于水的底物難得多，但是隨著現(xiàn)代化生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)有許多種解決方法了。采用將底物制成細粉末狀的固體直接投料。這種投料方式使得轉(zhuǎn)化細胞和粉末底物之間有最好的接觸表面積，轉(zhuǎn)化率也會提高。在甾體轉(zhuǎn)化中常用此法。第46頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二將不溶于永的底物溶于能溶于水的有機溶劑中來進行添加。這類有機溶劑包括有低級醇(甲醇、乙醇)、丙酮和二甲基亞砜等；但是這類水能 溶的有機溶劑超過一定量對細胞和酶都會有一定的傷害作用每次添加的量要 盡量少第47頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星

23、期二采用非毒性表面活性物質(zhì)來分散不溶性底物。通常應(yīng)用聚山梨 酯80(吐溫一80)等非毒性表面活性物質(zhì)來分散不溶性底物使得底物和轉(zhuǎn)化液的接觸面增大，來提高轉(zhuǎn)化率。一般操作方法是先配制好表面活性荊質(zhì)量濃度為3的轉(zhuǎn)化液，然后將不溶水的粉末狀底物滴加分散到轉(zhuǎn)化液中進行轉(zhuǎn)化，必要時可用超聲波促進分散程度。第48頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三、酶的抑制劑 在微生物轉(zhuǎn)化過程中添加酶的抑制劑是為了抑制轉(zhuǎn)化過程中的副反應(yīng)，保證獲得轉(zhuǎn)化的目的產(chǎn)物。如在采用微生物轉(zhuǎn)化降解膽固醇的側(cè)鏈的方法制備甾體激素類藥物重要中間體雄甾二酮的過程中通過添加含二價鐵的螯合劑來抑制開裂甾體母核的副反應(yīng)。

24、第49頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二四、酶的誘導(dǎo)劑 在微生物轉(zhuǎn)化過程中，酶活力的總強度是細胞內(nèi)含酶量乘以細胞總數(shù)。要增加酶活力不僅要增加細胞的投入量，還要誘導(dǎo)細胞內(nèi)酶量的增加。酶的合成在整個細胞生命中是根據(jù)其生理上的需求來進行調(diào)控的。酶可以分為組成酶和誘導(dǎo)酶第50頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二組成酶是指在微生物的生長代謝過程中會自然產(chǎn)生的一些酶.而誘導(dǎo)酶是指在加入一定的誘導(dǎo)物后才會產(chǎn)生或明顯地增加產(chǎn)量的一類酶。對于組成酶來說，微生物轉(zhuǎn)化的酶量主要與微生物的菌體量有關(guān)。第51頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二在

25、微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中許多重要的酶在沒有誘導(dǎo)的情況下是檢測不到其酶活的，這類酶稱為誘導(dǎo)酶。在微生物對數(shù)生長期容易被誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此在對數(shù)生長期加入誘導(dǎo)劑是一個最好的時機。還有一個重要的規(guī)律是通常能被轉(zhuǎn)化的底物都具有該轉(zhuǎn)化酶的誘導(dǎo)作用第52頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二五、生長調(diào)節(jié)劑 生長調(diào)節(jié)劑(生物激素)對生物體代謝調(diào)節(jié)有顯著影響。因此，在微生物轉(zhuǎn)化過程中選擇合適劑量的生長調(diào)節(jié)劑可以有效地提高底物的轉(zhuǎn)化。第53頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第四節(jié) 微生物轉(zhuǎn)化的應(yīng)用隨著科技的迅速發(fā)展，微生物轉(zhuǎn)化得到了不斷發(fā)展，從近年來的研究可以看出，一種

26、微生物可以轉(zhuǎn)化多種在分子結(jié)構(gòu)上完全不同的物質(zhì)；不同種微生物對結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)可以發(fā)生類似的反應(yīng)。所以微生物轉(zhuǎn)化已成為現(xiàn)代生物工程技術(shù)的重要組成部分，廣泛應(yīng)用于有機化合物的合成、藥物前體化合物的轉(zhuǎn)化、活性成分篩選及新藥開發(fā)、藥物代謝模型預(yù)測等諸多領(lǐng)域。第54頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二一在有機合成領(lǐng)域的應(yīng)用 微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)由于其高度立體及區(qū)域選擇性在有機合成領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)取得了顯著的效果,成為有機合成中的一個重要工具。根據(jù)Davis等的統(tǒng)研究，認(rèn)為應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化的酶主要是乙酰轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)酶、環(huán)氧酶、羥基化酶、醛縮酶等。第55頁，共151頁，2022年，5

27、月20日，16點46分，星期二按照1961年國際生化會議的規(guī)定，根據(jù)酶催化的反應(yīng)類型不同，酶可以分為六大類：氧化還原酶類；轉(zhuǎn)移酶類； 水解酶類；裂合酶類；異構(gòu)酶類；合成酶(連接酶)類。在有機合成域主要是利用氧化還原酶類和水解酶類，大約有23的生物轉(zhuǎn)化是蛋白酶、酯酶和脂肪酶起酯基和氨基的水解反應(yīng)。第56頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 微生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用于有機化合物的合成存在著許多優(yōu)點，同時也有一些不足之處。最顯著的優(yōu)點就是高度選擇性，包括化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性，非對映選擇性、對映體選擇性，還有反應(yīng)條件溫和，酶種類多樣酶量充足、轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、對環(huán)境污染少等。缺

28、點是在一些極端的反應(yīng)條件下，如過高或過低的pH、溫度和高鹽的濃度下，酶均易失活微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)就明顯暴露出其不足之處。另外還存在產(chǎn)物和底物的抑制現(xiàn)象，有的底物或產(chǎn)物在一定的濃度下會抑制酶活，從而影響了轉(zhuǎn)化效率。盡管如此，微生物轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為有機合成的一個重要工具第57頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二（一）手性化合物合成與拆分 手性是生物體的基本特征，構(gòu)成生命有機體的分子大都是不對稱的手性分子。 人體內(nèi)在的手性環(huán)境可以識別手性藥物對映體，使對映體在活性、代謝過程和毒性等方面存在顯著差異。 如用于消除孕婦早期妊娠反應(yīng)的鎮(zhèn)靜劑“反應(yīng)?！?thalidomide，沙利度胺)被應(yīng)

29、用不久，就被發(fā)現(xiàn)可以致使嬰兒出現(xiàn)畸形，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)具有鎮(zhèn)靜作用的是其R一對映體而致畸變是由s一對映體引起的。因此必須對不同對映體看成不同的化合物進行研究。 利用微生物轉(zhuǎn)化對手性化合物的合成與拆分與化學(xué)拆分相比，有選擇性高、步驟簡單、成本低、產(chǎn)物回收率高等優(yōu)點。典型的例子就是采用生物法半合成頭孢菌素，通過利用酶的對映體催化專一性，只需兩步就可以替代傳統(tǒng)的化學(xué)生產(chǎn)法。第58頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二當(dāng)前，國際上常認(rèn)為手性化技術(shù)主要有三類：色譜法、化學(xué)不對稱合成與拆分法、生物合成與拆分法。前兩種方法是手性轉(zhuǎn)移方法，需要手性試劑、手性配基等手性源，而且還經(jīng)常用到過渡金屬

30、配合物作為手性模板，誘導(dǎo)反應(yīng)中手性中心的建立，所以在制藥工業(yè)中的應(yīng)用受到了限制，而且這些方法存在著操作復(fù)雜、試劑昂貴、得到產(chǎn)物光學(xué)純度不高等缺點。生物合成與拆分方法不僅不需要手性源，還能將非手性化合物轉(zhuǎn)化為手性化合物，并且克服了以上兩種方法存在的不足。這三種手性化技術(shù)的優(yōu)缺點如表1 2所示。第59頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二表1-2三種手性化技術(shù)方法的比較第60頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二微生物轉(zhuǎn)化在合成手性化合物領(lǐng)域已經(jīng)廣泛運用。生物合成手性化合物主要是兩類：一類是外消旋體拆分為兩個光活性對映體；另一類是以外消旋或手性前體由底物

31、，通過酶催化得到不對稱的光活性產(chǎn)物。第61頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二Snell等利用細菌Rhodococcus AJ270中的腈水合酶對消旋布洛芬酰胺進行拆分，該酶對s-布洛芬酰胺的選擇性強，水解速度快，可得到s-布洛芬。甾體激素的微生物轉(zhuǎn)化是在手性合成研究中應(yīng)用較早和較成功的例子，通過常規(guī)的化學(xué)方法很難氧化非活潑的碳氫鍵，而微生物氧化卻很容易做到這一點。第62頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二例如黑根霉(Rhizonpus nigricans)的羥化酶能使黃體酮(1一1)轉(zhuǎn)化為11-羥基黃體酮(1-2)圖 手性甾體化合物的微生物轉(zhuǎn)化

32、第63頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 左旋多巴是L-酪氨酸的衍生物3，4二羥基-L-苯丙氨酸，用于治療帕金森病。日本學(xué)者A Yamamoto等通過靜態(tài)細胞生物轉(zhuǎn)化方法，將草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)懸浮于緩沖液，就可以將鄰苯二酚(兒茶酚)、丙酮酸和氨縮合成左旋多巴，該生產(chǎn)工藝已經(jīng)獲得專利(圖1- 8)第64頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二圖1-8 微生物轉(zhuǎn)化法制備左旋多巴第65頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二（二）食品添加劑的合成食品添加劑常是指在加工食品過程中為了保存或改善食品品質(zhì)而添

33、加的物質(zhì)。它們常具有保健、保鮮或改善風(fēng)味等功能。這類化合物對人體發(fā)揮了重要的生物學(xué)作用。因此它們的合成研究備受人們關(guān)注，除了傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法外，現(xiàn)在越來越多人也重視其微生物轉(zhuǎn)化合成法。現(xiàn)就對常見的食品添加劑維生素C和香蘭醛微生物轉(zhuǎn)化合成作個簡要介紹。第66頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二1、維生素C的合成維生素C(Vc)是一種抗氧化劑，可作為食品添加劑，廣泛存在于檸檬、柑橘等水果和新鮮蔬菜中，它能用于壞血病的防治和增強機體對感染的抵抗能力，是一種輔助性治療藥物。眾所周知，Vc生產(chǎn)中的某些合成步驟是由微生物轉(zhuǎn)化完成的。第67頁，共151頁，2022年，5月20日，1

34、6點46分，星期二最早在l 935年，Reichstein就選用弱氧化乙酸桿菌(A . Suboxydans)將D一山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，再經(jīng)多步化學(xué)反應(yīng)就合成得到Vc。但到了20世紀(jì)70年代。我國學(xué)者發(fā)明了“二步發(fā)酵法”生產(chǎn)Vc ，即在上述的乙酸桿菌轉(zhuǎn)化后，再用氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobadter oxydans)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的混合菌使得L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸，見圖19。第68頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第69頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二圖“二步發(fā)酵法”合成維生

35、素c第70頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二這一步微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)較化學(xué)合成反應(yīng)污染減少，合成步驟縮短，合成效率提高了。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，人們運用基因工程法構(gòu)建一種新的工程菌它能直接將葡萄糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸。然后只需一步內(nèi)酯化和烯醇化就制得Vc（代謝工程菌，將L-山梨醇脫氫酶基因和L-山梨醣脫氫酶基因，通過基因重組構(gòu)建出一個工程菌株，發(fā)酵過程可以在同一次轉(zhuǎn)化發(fā)酵中將D一山梨醇轉(zhuǎn)化成一酮一L古洛糖酸。）第71頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二2、 香草醛合成香草醛(vanillin)又稱香蘭素是天然香料中最重要的一種。香料是

36、食品、化妝品和制藥工業(yè)的重要原料，香料占食品添加劑市場總量的25左右。長期以來，人們熱衷于從天然植物中提取香料，但是由于植物資源有限，含量低，提取困難，因而價格很昂貴。第72頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二雖然現(xiàn)在存在有機合成的香料，但是人們更鐘情于天然的產(chǎn)物，因此微生物轉(zhuǎn)化也成為了香料合成的一個重要途徑。通過微生物轉(zhuǎn)化方法合成香草醛就是一個典型的成功例子。它常以阿魏酸為反應(yīng)起始物利用芽孢桿菌、假單胞菌、鏈霉菌等多種微生物進行一氧化產(chǎn)生香草酸，再通過諾卡氏菌(Nocardia sp. NRRL 5646)中的羧基還原酶系選擇性地將香草酸還原成香草醛(圖-10)第73

37、頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二圖1-10 微生物轉(zhuǎn)化法合成香草醛第74頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二在新藥開發(fā)中的應(yīng)用新藥合成主要是依靠化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化兩種途徑。化學(xué)合成途往主要是化學(xué)家們依據(jù)理論、自身經(jīng)驗及文獻報道，主觀地設(shè)計合成路線，因此在仿生性和立體結(jié)構(gòu)選擇性方面存在一定的難度，甚至很難實現(xiàn)；相反生物體經(jīng)長期的演化進化，具有一套自身特異性的酶體系，使得生物轉(zhuǎn)化合成物質(zhì)的途徑處于最佳狀態(tài)。第75頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二生物轉(zhuǎn)化方法通常以天然活性成分為先導(dǎo)化合物利用多種不同催化功能的酶系對其結(jié)

38、構(gòu)進行修飾，從而得到更多結(jié)構(gòu)新穎的化合物，再通過活性篩選，可以尋找新的高效低毒的先導(dǎo)化合物或通過對活性組分中不同成分結(jié)構(gòu)變化與活性強度消長關(guān)系的分析發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵活性成分。而我國天然藥物資源比較豐富用天然活性成分作為先導(dǎo)化合物尋找創(chuàng)新藥物是一個非?？扇〉耐据p第76頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二余伯陽等利用26種工業(yè)微生物對阿片類生物堿dihydrothevinone進行微生物轉(zhuǎn)化，經(jīng)制備性實驗分離純化得到兩種主要產(chǎn)物，并鑒定為3-O-Demethyldihydrothevinone和nordihydrothebinone。通過轉(zhuǎn)化反應(yīng)動力學(xué)分析表明去氧甲基化和去氮甲基化

39、幾乎是同時進行的第77頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二最后將P450酶抑制劑octylamin入反應(yīng)體系，結(jié)果去氮甲基化反應(yīng)被選擇性抑制，因此說明這兩個反應(yīng)被不同酶催化從而可選擇性地制備單一產(chǎn)物nordihydrothebione，其nordihydrothebinone為阿片受體抑制劑的前體。微生物轉(zhuǎn)化規(guī)律還可以指導(dǎo)新藥的結(jié)構(gòu)修飾，并獲得高效長效的新一代藥物，例如從硝苯地平轉(zhuǎn)化為氨氯地平， prontosil(偶氯磺胺)發(fā)展成為磺胺藥，這些可以說明微生物轉(zhuǎn)化對新藥開發(fā)的重要性。第78頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三 作為體外模型預(yù)測代

40、謝 藥物代謝(drug metabolish)是研究藥物分子在體內(nèi)以不同的規(guī)模發(fā)生的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化。藥物經(jīng)代謝后通常發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而引起相應(yīng)的藥理活性及毒性改變，例如代謝失活、代謝活化，它是直接影響藥物發(fā)揮療效的關(guān)鍵因素之一。大部分藥物都是有機體的外源性物質(zhì)，為了保證用藥安全，必須充分了解藥物在體內(nèi)的吸收、分布、排泄以及生物轉(zhuǎn)化等過程第79頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二藥物代謝反應(yīng)從化學(xué)本質(zhì)上可以分相(phase )代謝反應(yīng)和相(phase)代謝反應(yīng)兩種類型。相代謝反應(yīng)主要是官能團化(functionalization)，包括氧化、還原、水解等反應(yīng)。藥物經(jīng)過相代謝

41、反應(yīng)后，極性基團引人藥物分子，即在藥物分子上形成羧基、羥基、氨基等基團從而使藥物分子水溶性增強，便于排泄，同時也改變了原有的官能團，使得藥物解毒或活化。第80頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二相代謝反應(yīng)主要是結(jié)合反(conjugation)，包括葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合、谷胱甘肽結(jié)合等，藥物極性進一步加大，有利于排出體外。第81頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 傳統(tǒng)的藥物代謝研究方法往往是通過收集給藥動物的體液(血漿、尿、膽汁)或采用體外離體器官灌流，組織或細胞體外培養(yǎng)、肝微粒體體外溫孵等。這些方法一方面由于生物樣品常受到內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，

42、不易得到純代謝產(chǎn)物，就算得到其產(chǎn)物量也是極其少的，難以滿足結(jié)構(gòu)鑒定和藥理活性篩選的需要；另一方面技術(shù)要求較高，操作復(fù)雜井且消耗大量的實驗動物。第82頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二體內(nèi)代謝主要是在酶的參與下進行的，其代謝產(chǎn)物在體外很難通過化學(xué)方法合成，而微生物轉(zhuǎn)化就是利用生物體內(nèi)的酶系對外源性物質(zhì)進行催化，形成其代謝產(chǎn)物，因此微生物轉(zhuǎn)化已成為研究體內(nèi)代謝的一種重要的輔助工具。第83頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 Simth和Rosazza在研究芳香化合物的微生物羥基化時，注意到微生物代謝物和哺乳動物代謝物有相似性，并于1974年最先提出

43、了“哺乳動物代謝的微生物模型”(microbial models of mammalian metabolism)的概念。其核心理論是：真菌和哺乳動物都是真核細胞生物，因此在主要的生理功能中含有類似的酶作用機制，所以兩者在外源性化合物的代謝過程中就有相似的代謝系統(tǒng)和過程因此，微生物轉(zhuǎn)化在模擬哺乳動物藥物代謝途徑具有一定的預(yù)見性。第84頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二基于這一理論Foster等研究發(fā)現(xiàn)Cunninghamella bainieri對普羅帕酮以及甲氧那明的生物轉(zhuǎn)化，與人體內(nèi)的代謝過程十分類似，提示該菌具有與人體類似的藥物代謝酶，并且可以用于藥物間相互作用

44、的研究。近幾年，隨著人們研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多微生物體系具有和哺乳動物藥物代謝功能非常相似的細胞色素P450同功酶和葡萄糖苷羧酶等，可以進行某些與哺乳動物相同的羥基化、?；?、N一脫烷基化、O-脫烷基化以及葡萄糖醛酸結(jié)合等代謝反應(yīng)。第85頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二利用微生物作為體外代謝模型研究哺乳動物代謝有以下優(yōu)點：微生物來源廣泛種類繁多，可提供大量的篩選模型；建立微生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成本較低，操作簡單，易于控制；可以通過調(diào)節(jié)優(yōu)化條件，顯著提高代謝產(chǎn)物的收率，經(jīng)過分離純化后，可以作為代謝產(chǎn)物的對照品進行藥理和毒理研究； 可以減少實驗動物用量第86頁，共151頁，202

45、2年，5月20日，16點46分，星期二例1(一)-eburnamonine是一種重要的-咔啉生物堿，臨床用于改善大腦循環(huán)和代謝。該化合物在人體內(nèi)一個活性代謝物為(6R)-6-hydroxyeburnamonine(1-3)，但卻一直沒有結(jié)構(gòu)鑒定方面的數(shù)據(jù)。Adachi等利用卷枝毛霉(Mucor circinelloides f. griseo-cyanus IFO 4563)和呈紫色鏈霉菌(Striptomyces violens IFO 13486)對底物進行微生物轉(zhuǎn)化。卷枝毛霉經(jīng)過72h反應(yīng)得到三個羥基化產(chǎn)物1-3、1-4和1-5；而呈紫色鏈霉菌經(jīng)48h反應(yīng), 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物1-3和1-4

46、并測出了三種產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式(圖1-11)。第87頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二圖1-11 (一)-eburnamonine及其微生物代謝產(chǎn)物第88頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二例2 藥物維拉帕米在人體內(nèi)代謝廣泛，主要產(chǎn)生C- N鍵和C一0鍵斷裂的多種氧化代謝產(chǎn)物代謝過程主要涉及CYP3A4、CYPlA2和CYP2C8等酶系。 劉磊等利用短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)對維拉帕米進行微生物轉(zhuǎn)化研究。在轉(zhuǎn)化液中檢測到維拉帕米主要形成C- N鍵和C- O鍵斷裂的10種氧化代謝產(chǎn)物，其中N

47、-去短鏈烷基維拉帕米為主要產(chǎn)物，產(chǎn)率大于65，其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率均小于15%。對健康受試者口服維拉帕米后的尿液分析，結(jié)果表明N-去短鏈烷基維拉帕米比例為42%是最主要的產(chǎn)物，其他比例均小于10%，而且代謝反應(yīng)類型也是C-N鍵和C-N鍵斷裂。第89頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 由此可見，無論從藥物代謝的氧化反應(yīng)類型還是從主要代謝產(chǎn)物的種類和比例等方面對比，短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)與人體藥 物代謝的結(jié)果都比較一致，是研究藥物C-N鍵和C-O鍵斷裂較理想的體外 模型，還可以進行相關(guān)的代謝產(chǎn)物的藥理活性實驗

48、。第90頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二例3 磷酸苯丙哌林(benproperine phosphate)為兼具外周和中樞作用的非成癮性鎮(zhèn)咳藥，該藥毒性小、不抑制呼吸、不良反應(yīng)少而輕。黃海華等利用短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.153)對苯丙哌林微生物轉(zhuǎn)化進行研究。根據(jù)液相色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)推測，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別為苯丙哌林單羥基化物(約65)、苯丙哌啉雙羥基化物和苯丙哌林單羥基化物的硫酸酯結(jié)合物。這些轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與其在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物基本相同，其區(qū)別在于微生物轉(zhuǎn)化不能生成苯丙哌林單羥基葡萄糖苷酸結(jié)合物(圖1-12)。因此，通過對苯丙

49、哌林的轉(zhuǎn)化研究，優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件有可能獲得人體內(nèi)苯丙哌林羥基化代謝產(chǎn)物的對照品, 確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，輔助推測苯丙哌林在生物體(包括人體)中的部分代謝途徑。第91頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第92頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 從以上的實例可以進一步看出微生物轉(zhuǎn)化可以作為研究藥物體內(nèi)代謝的一個重要工具。通過篩選出能產(chǎn)生動物體內(nèi)藥物代謝產(chǎn)物的生物體系，調(diào)節(jié)優(yōu)化條件，不僅可以預(yù)測藥物在人體的代謝過程，還可以為體內(nèi)代謝提供充足的對照品或產(chǎn)物以供結(jié)構(gòu)鑒定和活性篩選。第93頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二第五節(jié) 新技術(shù)在微

50、生物轉(zhuǎn)化的中應(yīng)用 隨著現(xiàn)代生物科學(xué)和生物技術(shù)的迅速發(fā)展，以及一些分析測試技術(shù)的應(yīng)用，微生物轉(zhuǎn)化也得到了進一步的發(fā)展。基因工程技術(shù)、固定化細胞轉(zhuǎn)化技術(shù)、雙水相轉(zhuǎn)化技術(shù)、超聲波技術(shù)、有機介質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化以及生物反應(yīng)器等綜合應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系，不僅可使轉(zhuǎn)化的效率成倍增長，而且還有可能使整個反應(yīng)過程連續(xù)、自動化。同時，一些分析測試技術(shù)如核磁共振、質(zhì)譜等已經(jīng)應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化的在線檢測。第94頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二一、基因工程技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用隨著近年來分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對基因工程的認(rèn)識也逐步加深，這為微生物轉(zhuǎn)化提供了新的思路?；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展和實用化

51、為此開辟了有效途徑。只要生物細胞中存在有催化某一生化反應(yīng)的酶，即使其量微不足道，應(yīng)用基因重組技術(shù)，通過基因擴增與增強表達，人們就可能建立高效表達特定酶制劑的基因工程菌或基因工程細胞，從而進一步構(gòu)建成新一代的催化劑固定化工程菌或固定化工程細胞。第95頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二如，應(yīng)用DNA重組技術(shù)建立了絲氨酸和色氨酸合成酶工程菌，這種工程菌組裝的生物反應(yīng)器可以用甘氨酸和甲醛為原料制造絲氨酸，反應(yīng)液含絲氨酸超過400gL，再從絲氨酸與吲哚轉(zhuǎn)化生成色氨酸，反應(yīng)液中色氨酸濃度達到200gL。此外利用基因工程還可以將能進行生物轉(zhuǎn)化的相關(guān)酶從微生物、植物甚至動物細胞中克隆

52、出來再導(dǎo)入一個微生物中進行表達，從而產(chǎn)生能對底物進行轉(zhuǎn)化的一系列酶，將原來復(fù)雜的幾種轉(zhuǎn)化過程縮短為一個轉(zhuǎn)化反應(yīng)。目前在這方面的研究也是微生物轉(zhuǎn)化的一個趨勢，并且具有廣闊前景。第96頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二二、固定化細胞轉(zhuǎn)化技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用固定化細胞轉(zhuǎn)化技術(shù)自20世紀(jì)70年代問世以來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境保護、能源開發(fā)以及理論研究等方面，并取得了豐碩成果。利用固定化細胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，省去了破碎細胞提取胞內(nèi)酶的過程，完整細胞得到固定后，酶活損失較少，活性回收率高，并且保持了細胞內(nèi)原有的多酶體系，對于一些需要多步催化的反應(yīng)過程，一步即可完成。被固

53、定的微生物細胞可以是處于生長狀態(tài)或體眠狀態(tài)的活細胞也可以是死亡的細胞(但胞內(nèi)酶的活力仍 存在)第97頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 在微生物轉(zhuǎn)化過程研究最多的是固定化活細胞包埋技術(shù)。常用的包埋材料有聚丙烯酰胺(PAA)、聚氨基甲酸乙酯(PU)、海藻酸鹽凝膠、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝膠、聚乙烯醇(PVA)等。 以海藻酸鈣凝膠為例，其制備過程如下：在室溫條件下，將一定濃度的海藻酸鈉溶液與微生物細胞混合均勻后，滴加到氧化鈣溶液中，形成球珠。第98頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二Kaul等采用了海藻酸鹽固定化生物催化劑(簡單節(jié)桿菌)和底物(氧化可

54、的松)進行碳一位和二位脫氫反應(yīng)研究。每個凝膠珠都可以看成是一個小的生物反應(yīng)器，由于縮短了擴散距離，轉(zhuǎn)化率明顯提高，反應(yīng)結(jié)束后細胞還可以回收并重復(fù)使用第99頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二三、雙水相轉(zhuǎn)化技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用雙水相轉(zhuǎn)化技術(shù)早期主要用于生物分子和細胞的分離與純化。這是由于生物產(chǎn)品如蛋白質(zhì)和酶往往是胞內(nèi)產(chǎn)品，需要經(jīng)細胞破碎后才能提取、純化，細胞顆粒尺寸的變化給固一液分離帶來了困難，另外這些產(chǎn)品的活性和功能對pH值、溫度和離子強度等環(huán)境特別敏感為了克服這些缺點出現(xiàn)了雙水相技術(shù)。近年來，該技術(shù)開始應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化過程為生物催化過程引入了一種全新的反應(yīng)體系第1

55、00頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 雙水相技術(shù)的核心是成相介質(zhì)的選擇以及介質(zhì)濃度的控制，它直接影響到底物和產(chǎn)物在兩相中的分配。雙水相體系基本上可以分為兩大婁：高聚物-高聚物體系和高聚物-低分子物質(zhì)體系。第101頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二高聚物一高聚物體系是較常用的，典型的例子如在水溶液中的聚乙二醇(PEG)和葡聚糖，當(dāng)它們濃度達到一定時溶液變渾濁，靜止后形成兩個液層，上層富集了PEG，下層則是葡聚糖。Flygare等以聚乙二醇、葡聚糖及Brij35組成的雙水相體系，利用分支桿菌(Mycobacterium sp.)進行膽固醇側(cè)鏈降

56、解制備雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)研究，上層聚乙二醇富集了菌體，使得菌體具有較高的轉(zhuǎn)化活力，轉(zhuǎn)化速率可達到1.0mg(gh)。第102頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二四、超聲波技術(shù)在微生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用 超聲波是指頻率高于2104Hz的機械波。 與其他聲波一樣，超聲波可以在彈性介質(zhì)中傳播。因為超聲波的波長很短，所以具有很強的定向傳播能力。同時由于超聲波在液體和固體中傳播時吸收衰減很小，因此具有很強的穿透力。根據(jù)超聲波的使用范圍，?？梢詫⑵浞譃閮深悾阂活愂歉哳l超聲，頻率范圍為I10MHz，這一類主要用于醫(yī)學(xué)成像和化合

57、物結(jié)構(gòu)的分析；另一類是功率超聲，頻率范圍為1560kHz，主要用于過程強化反應(yīng)。第103頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二應(yīng)用超聲波技術(shù)，首先受到機械力的作用，而機械能又可以轉(zhuǎn)化為熱能。此外，當(dāng)聲強足夠大時，又能產(chǎn)生空化效應(yīng)。超聲波的機械效應(yīng)包括振動效應(yīng)和聲流效應(yīng)，指超聲在媒介中傳播時引起質(zhì)點振動以及聲流對質(zhì)點的剪切力；超聲波的熱效應(yīng)指超聲波在媒介中傳播的過程中被傳播介質(zhì)吸收轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮埽怀暡ǖ目栈?yīng)指超聲波激活氣泡各種動力學(xué)的表現(xiàn)形式。第104頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 超聲波技術(shù)應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化過程，主要是涉及固液傳質(zhì)的生物體系

58、。超聲波可以產(chǎn)生上述的效應(yīng)，較常規(guī)方法更有效地細化顆粒、增大傳質(zhì)表面。這一過程主要發(fā)生于固液兩相界面及細胞壁、細胞膜附近的區(qū)域。在超聲場中，進行微生物轉(zhuǎn)化的環(huán)境和菌體均處于不斷的振動中。第105頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二對于環(huán)境而言，可加強分子的擴散效應(yīng)，加速體系的混勻過程，減少各種代謝在液相中的梯度；對于菌體而言，可降低其細胞內(nèi)胞液的黏度，提高膜的通透性。陽葵等等報道了采用超聲強度，超聲方式和時間對綠僵菌(Metarhizium sp)氧化16,17-環(huán)氧黃體酮的影響，并對微生物轉(zhuǎn)化體系中的超聲效應(yīng)進行分析，第106頁，共151頁，2022年，5月20日，1

59、6點46分，星期二認(rèn)為超聲使得反應(yīng)物顆粒細化、增大了固液界面、加速了底物溶解和底物分子的傳遞；空化效應(yīng)產(chǎn)生的沖擊力對細胞膜通透性發(fā)生變化，促進胞內(nèi)酶的釋放及反應(yīng)物向胞內(nèi)的擴散。第107頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二五、有機介質(zhì)中的微生物轉(zhuǎn)化 自從Buckland第一次利用有機溶劑四氯化碳(CCl4)為介質(zhì)，采用諾卡菌(Nocardia sp.)將膽甾醇轉(zhuǎn)化為膽甾烯酮以來，在有機介質(zhì)中進行微生物轉(zhuǎn)化成為了近幾年在該領(lǐng)域的研究熱點。因為在有機體系中可以有效地將產(chǎn)物及時分離出來，底物相應(yīng)得到補充，從而消除底物和產(chǎn)物的抑制作用，提高轉(zhuǎn)化率。此外，由于一些底物或前體在水相中

60、的溶解度很小，通過用有機相作為介質(zhì)可以大大提供其溶解度，即增加了底物或前體的加入濃度，在一定程度上也提高了轉(zhuǎn)化率。第108頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二 一般來說，在有機介質(zhì)中進行微生物轉(zhuǎn)化的過程中，有機溶劑與水形成兩相體系。包括有機介質(zhì)(水不溶性)-發(fā)酵液和有機介質(zhì)(水不溶性)-緩沖液兩種類型。Boren等在辛烷發(fā)酵液(1：1)組成的兩相體系中，將醋酸雄烯通過脫氫黃桿菌(Flavobacterium dehydrogenans)轉(zhuǎn)化為4-雄烯-3,17-二酮，第109頁，共151頁，2022年，5月20日，16點46分，星期二結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用發(fā)酵液作為第二相有利于微