化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) (3)講稿

1、關(guān)于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) (3)第一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來(lái)的一種新的檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。 第二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 概 述第三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過(guò)程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來(lái)源不同可分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。 第四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 光照發(fā)光（photoluminescence）是指發(fā)光劑（熒光素）

2、經(jīng)短波長(zhǎng)的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光（熒光）。 生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲(chóng)的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲(chóng)熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來(lái)。第五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)

3、，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光。一、化學(xué)發(fā)光第六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過(guò)程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過(guò)程可簡(jiǎn)單地描述如下： A十B C* C* C h其中為光子，C*表示C處于單線激發(fā)態(tài)。 第七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月若激發(fā)能傳遞到另一個(gè)未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過(guò)程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過(guò)程可表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h第八張，PPT共四十三

4、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 化學(xué)發(fā)光效率決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率（CE）和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率（EM）?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決定，每一個(gè)發(fā)光反應(yīng)都具有其特征性的化學(xué)發(fā)光光譜和不同的化學(xué)發(fā)光效率。二、化學(xué)發(fā)光效率第九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)第十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱(chēng)為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。 一、化學(xué)發(fā)光劑第十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高；

5、它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的 物質(zhì)相匹配；能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物； 其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果；在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒(méi)有毒性。第十二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 直接化學(xué)發(fā)光劑 直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過(guò)程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。 第十三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1. 吖啶酯 在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。 第十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2三

6、聯(lián)吡啶釕 三聯(lián)吡啶釕 RU(bpy)32+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。 三聯(lián)吡啶釕第十五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理 第十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 酶促反應(yīng)發(fā)光劑： 是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底 物）發(fā)光，這一類(lèi)需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑 稱(chēng)為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。 1魯米諾及其衍生物 2AMPPD第十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1魯米諾魯米諾發(fā)光原理第十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理 第十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年

7、6月2AMPPD3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷第二十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 碳二亞胺（EDC）縮合法 二、發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)第二十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 過(guò)碘酸鈉氧化法 第二十二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3重氮鹽偶聯(lián)法 第二十三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. N-羥基琥珀酰亞胺活化法 第二十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1發(fā)光劑的選擇 2被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì) 3標(biāo)記方法的選擇 4原料比 5標(biāo)記率 6溫度 7純化與保存 影響標(biāo)記的因素第二十五張，PPT

8、共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類(lèi)型 第二十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析第二十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)光YYY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYY

9、YYYYYYY沖洗后- 夾心法（1）加入H2O2（pH10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理第二十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點(diǎn)抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)第二十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來(lái)標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體

10、復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析第三十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月該分析系統(tǒng)采用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析第三十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意

11、圖 第三十二張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析第三十三張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 第三十四張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分析步驟分配樣品,磁顆粒和試劑孵育使反應(yīng)物結(jié)合在磁場(chǎng)中清洗去除未結(jié)合物質(zhì)加入底物產(chǎn)生信號(hào)孵育,促使信號(hào)的產(chǎn)生信號(hào)檢測(cè)第三十五張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6

12、月電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記 抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體， 在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光 反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過(guò)程。 三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析第三十六張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 (抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人TPA緩沖液。

13、當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。第三十七張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖第三十八張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖第三十九張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)記磁顆粒在電場(chǎng)中發(fā)光工作示意圖第四十張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1.甲狀腺激素 2生殖激素 3垂體激素和皮質(zhì)激素 4貧血因子 5腫瘤標(biāo)志物 6感染性疾病 7糖尿病 胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等。 8心臟標(biāo)志物 9病毒標(biāo)記物 10過(guò)敏性疾病 11治療藥物監(jiān)測(cè) 四、臨床應(yīng)用第四十一張，PPT共四十三頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1什么是發(fā)光免疫分析？什么是化學(xué)發(fā)光免疫分析？2化學(xué)發(fā)光與熒光的區(qū)別？化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件？3什么叫化學(xué)發(fā)光劑？化學(xué)發(fā)光劑必須具備那些