定量蛋白質組學研究技術

1、定量蛋白質組學研究技術定量蛋白質組學研究技術第1頁細胞工程教研室定量蛋白質組學定量蛋白質組學是指把一個基因組表示全部蛋白質或一個復雜混合體系中目標蛋白質進行準確定量和判定。這一概念提出標志著蛋白質組技術不停改進和完善。蛋白質組學研究已從對蛋白質簡單定性向準確定量方向發(fā)展。定量蛋白質組學研究技術第2頁細胞工程教研室定量蛋白質組學研究技術第3頁細胞工程教研室主要內容 定量技術體系與分類 熒光染料分析法 同位素標識技術 針對性親和標簽技術 同位素標識技術應用定量蛋白質組學研究技術第4頁細胞工程教研室一 定量技術體系和分類 技術體系雙向電泳-質譜技術體系蛋白質芯片分析體系基于同位素標識質譜分析技術體系

2、定量蛋白質組學研究技術第5頁細胞工程教研室2-DE-MS技術體系無標識蛋白質雙向電泳熒光差異凝膠電泳基于同位素標簽和自動化串聯(lián)質譜定量蛋白質組學研究技術第6頁細胞工程教研室定量分析方法定性差異分析和定量差異分析絕對定量和相對定量凝膠差異分析和非凝膠差異分析標識定量法和無標識定量法定量蛋白質組學研究技術第7頁細胞工程教研室二 熒光染料分析法雙向電泳（2-DE）凝膠染料顯示考馬斯亮藍銀染熒光染色熒光標識定量蛋白質組學研究技術第8頁細胞工程教研室 熒光雙向差異凝膠電泳（2D-DIGE）當前，在傳統(tǒng)2-DE技術基礎上發(fā)展出2D-DIGE，采取專有熒光染料（Cy2、Cy3、Cy5）與多重樣本和圖象分析方

3、法，在同一塊膠上可同時分離多個由不一樣熒光標識樣品，并以熒光標識樣品混合物為內標，對每個蛋白質點和每個差異都能夠進行統(tǒng)計學可信度分析，從而含有良好重復性和較高準確率。另外，因為熒光染料使用，使得2D-DIGE含有高靈敏度特征，能夠滿足高通量定量蛋白質組學研究分析要求。定量蛋白質組學研究技術第9頁細胞工程教研室定量蛋白質組學研究技術第10頁細胞工程教研室熒光掃描儀定量蛋白質組學研究技術第11頁細胞工程教研室定量蛋白質組學研究技術第12頁細胞工程教研室三 同位素標識技術原理 多肽和蛋白質質譜響應值受許多難以控制原因影響，尤其是其離子化效率受其它物質和條件影響很大，含有很強體系依賴性，因而不能對來自

4、相同肽段兩次質譜檢測得到信號強度像色譜定量中那樣進行比較定量。定量蛋白質組學研究技術第13頁細胞工程教研室一個肽惟一適合內標準是標識有穩(wěn)定同位素同一個肽。所以，在完整蛋白或消化后多肽中引進穩(wěn)定同位素（如2H、13C、15N、18O）標識小分子，用來識別不一樣品起源肽段，經“輕”質和“重”質同位素標識不一樣多肽相互作為內標，化學性質基礎上是一樣，這么就能夠確保同一次質譜掃描中二者離子化效果是相同，此時肽質譜峰信號成對出現(xiàn)，質譜峰信號強度就能夠作為定量依據。它們相對強度就準確地反應了原樣品中多肽百分比（也就是蛋白百分比）。 定量蛋白質組學研究技術第14頁細胞工程教研室 分類同位素標簽引入方法生物代

5、謝方式化學方式酶解過程引入同位素標識引入法體內標識【代謝標識法（SILAC）】體外標識【化學標識法（ICAT）】定量蛋白質組學研究技術第15頁細胞工程教研室 生物代謝方式引入標識原理 將一定量相同種類但表示水平不一樣兩個（細胞）樣品分別置于正常培養(yǎng)介質和富含某重質同位素（如：15N）相同介質中培養(yǎng)，一定時間后將二者混合酶解，然后選擇性親和分離、色譜分離，并進行質譜分析。定量蛋白質組學研究技術第16頁細胞工程教研室方法15N/14N蛋白質標識技術 分別用富含15N/14N細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)要比較細胞或者簡單生物體，經過生物代謝方式以15N替換氨基酸組成中14N，進而把15N標識引入蛋白質組成中。因為

6、氨基酸組成不固定（從甘氨酸1個到精氨酸4個），所以還沒有把此標識用在細胞培養(yǎng)上報道。定量蛋白質組學研究技術第17頁細胞工程教研室細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標簽技術（SILAC） 經過細胞正常代謝，把穩(wěn)定同位素標識氨基酸引入到蛋白質組成中，大大簡化質譜定量分析前人工處理復雜度?？捎迷诩毎囵B(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素有： 2H、13C和15N等。定量蛋白質組學研究技術第18頁細胞工程教研室定量蛋白質組學研究技術第19頁細胞工程教研室 酶解過程引入標識18O/16O水 在兩個要比較蛋白質樣品酶解過程中分別加入18O和16O水，這么可特異性地對酶解肽段C末端進行標識，等量混合后進行質譜分析樣品間蛋白質組差異。混

7、合樣品須快速判定。酶解標識H218O 在H218O溶液中進行蛋白質酶解，可在其C端穩(wěn)定結合1或2個18O原子。定量蛋白質組學研究技術第20頁細胞工程教研室整體內標技術（GIST） 經過用N-acetoxy-2H3-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS)乙酰化處理酶解肽段，把同位素標簽引入樣本分析體系中。NAS可標識必需氨基酸親和肽段N末端。因為肽段乙?；稽c不一，被標識重鏈和輕鏈質量差也不固定，給自動化分析帶來了一定困難。定量蛋白質組學研究技術第21頁細胞工程教研室親和標簽法引入標識原理 同位素標識親和標簽技術（ICAT）由Gygi等于1999年創(chuàng)造。此

8、技術是利用同位素親和標簽試劑，預先選擇性地標識某一類蛋白質，分離純化之后進行MS判定。依據MS圖上不一樣同位素標識親和標簽試劑標識一對肽段離子強度比值定量分析樣品相對豐度。定量蛋白質組學研究技術第22頁細胞工程教研室ICAT試劑組成：反應基團（特異性結合肽鏈中半胱氨酸殘基巰基）連接子（結合穩(wěn)定同位素）親和標簽生物素（可與卵白素結合，選擇性分離標識多肽）定量蛋白質組學研究技術第23頁細胞工程教研室操作流程同位素標識親和標簽輕試劑標識細胞蛋白質1同位素標識親和標簽重試劑標識細胞蛋白質2混合，胰酶水解陽離子交換卵白素親和層析LC分離，MS分析，數據庫檢索定量蛋白質組學研究技術第24頁細胞工程教研室優(yōu)

9、點兼容任何生長條件下組織中蛋白質樣品；烷基化反應高度特異；只分離含有半胱氨酸殘基肽段，降低了體系復雜性；可對膜蛋白進行判定和定量；建立在色譜技術基礎上，任何促進蛋白質溶解試劑都可使用；能直接判定和測量低豐度蛋白質。定量蛋白質組學研究技術第25頁細胞工程教研室缺點無法分析不含半胱氨酸蛋白質；同位素標簽存在影響肽段檢測和增加數據庫搜索復雜性；被標識含有兩個半胱氨酸多肽質量相差16u時與氧化作用極難區(qū)分；樣品成份復雜時，定量誤差會增大標識效率含有時間依賴性，極難到達80%。定量蛋白質組學研究技術第26頁細胞工程教研室應用測定和定量膜蛋白判定和定量低豐度蛋白質定量蛋白質組學研究技術第27頁細胞工程教研

10、室 ICAT技術改進用13C/12C代替2H/1H，消除LC同位素效應固相同位素標識親和標簽可剪切同位素標識親和標簽（酸切 割或光切割）可裂解同位素標識親和標簽（cICAT）可視同位素標識親和標簽（VICAT）定量蛋白質組學研究技術第28頁細胞工程教研室固相同位素標識親和標簽其是將ICAT試劑與玻璃珠結合，使之固相化，經過固相捕捉和釋放等化學反應過程，LCMS-MS分析蛋白質肽段。該方法與傳統(tǒng)ICAT方法相比，更簡單，更靈敏，更有效。而最大不一樣是固相ICAT試劑標識蛋白質是在酶解后進行，而ICAT試劑標識蛋白質要求在酶解前。固相同位素標簽試劑由4個別組成，氨丙基包被玻璃珠、含有O-硝基苯光裂

11、解連接子、連接7個氫或7個氘亮氨酸同位素標簽和巰基特異反應碘乙酰胺基團。定量蛋白質組學研究技術第29頁細胞工程教研室可裂解同位素標識親和標簽用13C/12C代替了2H/1H使用了酸裂解連接子不一樣肽段質量相差9u或9u倍數親和標簽試劑由3個別組成半胱氨酸特異性反應基團含9個同位素13C或12C標簽可裂解連接子親和純化生物素定量蛋白質組學研究技術第30頁細胞工程教研室可視同位素標識親和標簽是在cICAT技術基礎上實現(xiàn)絕對定量改進方法。親和標簽試劑由3種不一樣同位素標簽組成。用來標識樣品巰基標識標簽（VICAT）標識內標多肽標簽（14C-VICAT+6）等電聚焦標識標簽（14C-VICAT-28）

12、定量蛋白質組學研究技術第31頁細胞工程教研室定量蛋白質組學研究技術第32頁細胞工程教研室同位素標識相對定量和絕對定量ICAT技術每次試驗只能對兩個樣品進行相對定量。新近出現(xiàn)多重元素標識同位素標識相對和絕對定量技術（iTRAQ）在一定程度上處理了這一問題。它是年由ABI企業(yè)推出一個能夠同時對四組樣品進行定量分析方法，對于試驗設計比較多組樣品給予了有力支持。 定量蛋白質組學研究技術第33頁細胞工程教研室iTRAQ試劑是非多聚體等質量標識試劑，是由四種試劑組成一組試劑，這四種試劑分子量相同。每一個試劑都包含三個別：一個匯報基團（分子量分別為114u、115u、116u和117u）、一個平衡基團（分子

13、量分別為31u、 30u、29u和28u）和一個與肽段反應基團。當咱們需要同時比較四組不一樣品時，樣品分別跟四種iTRAQ試劑結合，然后混合在一起做質譜判定。定量蛋白質組學研究技術第34頁細胞工程教研室定量蛋白質組學研究技術第35頁細胞工程教研室與ICAT試劑相比優(yōu)點是通量大。iTRAQ試劑對氨基標識是一個普遍標識模式，它幾乎全部肽段都能被標識。不過，假如用這種普遍標識方法來大規(guī)模判定和定量蛋白質(理論上說，每個蛋白質只要有一條肽段就能夠對其進行判定和定量)，則是一件費時費勁事情。另外，在iTRAQ試劑標識需要反應體系有機相體積高達60以上，蛋白質樣品很輕易發(fā)生沉淀而損失，這也是該試劑一個弱點

14、。定量蛋白質組學研究技術第36頁細胞工程教研室四 針對性親和標簽技術 磷酸化蛋白質同位素標識親和標簽PHIAT技術是建立在ICAT技術基礎上研究和判定磷酸化蛋白質磷酸化位點新方法，且對低豐度蛋白質判定有效。PHIAT試劑含有親核巰基和同位素標簽及其共價結合生物素基團。利用此方法已成功判定了酪蛋白和酵母提取物磷酸化位點。定量蛋白質組學研究技術第37頁細胞工程教研室選擇性標識特異性氨基酸同位素化學探針標識半胱氨酸標識色氨酸標識氨基酸N末端標識羧基標識定量蛋白質組學研究技術第38頁細胞工程教研室非同位素化學探針標識 （Label-free LC MS/MS ）賴氨酸標識 質量豐度編碼標簽（MCAT）是一個色譜標識定量法。組氨酸標識 利用了固相金屬親和色譜可富集