多重腦震蕩對(duì)大鼠認(rèn)知行為及多巴胺能神經(jīng)元的影響

1、多重腦震蕩對(duì)大鼠認(rèn)知行為及多巴胺能神經(jīng)元的影響【摘要】目的討論多重腦震蕩()大鼠認(rèn)知行為及多巴胺(DA)能神經(jīng)元的變化。方法用金屬單擺打擊裝置復(fù)制大鼠模型，動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和傷后124d6個(gè)損傷組;應(yīng)用rris水迷宮實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，用免疫組化結(jié)合圖像分析方法，研究傷后中腦黑質(zhì)致密區(qū)(SN)、腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)DA能神經(jīng)元變化，并在光鏡下對(duì)酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)展計(jì)數(shù)。結(jié)果在水迷宮測(cè)試中，傷后16d組大鼠逃避尋找平臺(tái)的時(shí)間明顯延長(zhǎng);在無(wú)平臺(tái)探測(cè)實(shí)驗(yàn)中，傷后8、16d組大鼠在原有平臺(tái)第三象限停留時(shí)間明顯減少。在免疫組化實(shí)驗(yàn)中，SNDA能神經(jīng)元表達(dá)在傷后4、8d組明顯升高;V

2、TA在2、4、8、16d組明顯升高(P0.05)。結(jié)論多重腦震蕩大鼠出現(xiàn)較為嚴(yán)重的認(rèn)知行為障礙;傷后大鼠SN、VTADA能神經(jīng)元表達(dá)出現(xiàn)不同程度的增高?！娟P(guān)鍵詞】多重腦震蕩;rris水迷宮;多巴胺;大鼠腦震蕩的發(fā)生率高、后遺癥多1，2。目前，國(guó)內(nèi)、外對(duì)單純腦震蕩動(dòng)物的認(rèn)知行為研究較多，但對(duì)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)界常見(jiàn)的多重腦震蕩及與之相關(guān)的認(rèn)知行為的實(shí)驗(yàn)研究尚缺乏報(bào)道。曾有學(xué)者采用液壓沖擊復(fù)制屢次腦損傷模型3，4，但該方法要求動(dòng)物處于麻醉狀態(tài)而非清醒狀態(tài)，不能確切地用來(lái)研究運(yùn)動(dòng)相關(guān)腦震蕩的損傷特征和損傷機(jī)制。本研究通過(guò)復(fù)制多重腦震蕩大鼠模型，應(yīng)用rris水迷宮測(cè)試，采用免疫組化方法對(duì)傷后中樞DA能神經(jīng)元的病

3、理變化進(jìn)展分析,從而評(píng)價(jià)大鼠多重腦震蕩后的空間學(xué)習(xí)記憶功能，討論多重腦震蕩對(duì)大鼠認(rèn)知行為的影響。1動(dòng)物與方法1.2方法1.2.1多重腦震蕩大鼠模型的建立及標(biāo)準(zhǔn)控制完全清醒的SD大鼠固定在自制鐵質(zhì)單擺式腦損傷復(fù)制儀上，擺錘上舉使初始角達(dá)100110擺錘自由下落，撞擊在大鼠頂枕部，復(fù)制具有一過(guò)性腦功能障礙的腦震蕩大鼠。打擊后，觀(guān)察大鼠恢復(fù)自主呼吸的時(shí)間及各種反射情況，并嚴(yán)格參照單純腦震蕩判斷標(biāo)準(zhǔn)5,每天同一時(shí)間復(fù)制大鼠單純腦震蕩一次，連續(xù)三天重復(fù)上述操作而獲得多重腦震蕩模型。1.2.2分組將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)據(jù)表分組，分為傷后1、2、4、8、16、24d組，共6個(gè)損傷組(每組n=8)。同時(shí)設(shè)一正常

4、對(duì)照組(n=8)。1.2.3大鼠rris水迷宮測(cè)試對(duì)多重腦震蕩組大鼠于傷后第121天連續(xù)進(jìn)展rris水迷宮測(cè)試，包括水下平臺(tái)、水上平臺(tái)試驗(yàn)及無(wú)平臺(tái)探測(cè)實(shí)驗(yàn),詳細(xì)方案參見(jiàn)于建云等5的方法。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)展處理，所有結(jié)果用xs表示,并采用單因素方差分析方法進(jìn)展分析。2結(jié)果2.1rris水迷宮測(cè)試結(jié)果在逃避埋伏期實(shí)驗(yàn)中，傷后8d組(即傷后第17天)和24d組(即傷后第1521天)大鼠rris水迷宮測(cè)試時(shí)間延長(zhǎng)不明顯(P0.05，見(jiàn)表1)。傷后16d組(即傷后第814天)大鼠在水迷宮測(cè)試中逃避尋找平臺(tái)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，尤其在16d組的隱匿平臺(tái)逃避埋伏期的第9、10天

5、和可視平臺(tái)逃避埋伏期的第13、14天更為顯著(P0.05，見(jiàn)表1)。在無(wú)平臺(tái)探測(cè)實(shí)驗(yàn)中，傷后8、16d組大鼠在原有平臺(tái)第三象限停留時(shí)間明顯減少(P0.05)，也即在第7天和第14天的無(wú)平臺(tái)探測(cè)實(shí)驗(yàn)中，大鼠對(duì)空間記憶的保持情況有明顯影響;傷后24d組大鼠在原有平臺(tái)第三象限停留時(shí)間稍減少(P0.05，見(jiàn)表2)。表1各組動(dòng)物隱匿平臺(tái)逃避埋伏期、可視平臺(tái)逃避埋伏期變化表2對(duì)照組與后各組無(wú)平臺(tái)探測(cè)實(shí)驗(yàn)中各象限時(shí)間變化與對(duì)照組比擬：1)P0.05轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2傷后不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)腦區(qū)DA能神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果在SNDA能神經(jīng)纖維內(nèi)酪氨酸羥化酶(TH)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以傷后1d開(kāi)場(chǎng)升高，8d到達(dá)頂峰，與對(duì)

6、照組相比4、8d組有顯著性差異(P0.05);與對(duì)照組相比，VTA2、4、8、16d組有顯著性差異(P0.05)，4d組TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)到達(dá)頂峰，24d組根本恢復(fù)(見(jiàn)表3)。2.3傷后不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)腦區(qū)DA能神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)結(jié)果在SN以傷后1d開(kāi)場(chǎng)升高，4、8d組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P0.05)，24天組根本恢復(fù)。與對(duì)照組相比，VTA2、4、8、16d組有顯著性差異(P0.05)，2d組陽(yáng)性反響最強(qiáng)(P0.01)，24d組根本恢復(fù)(見(jiàn)表4)。表3各組中腦SN、VTADA能神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的變化與對(duì)照組比擬：1)P0.01，2)P0.05表4各組中腦SN、VTADA能神經(jīng)細(xì)胞灰度值的變化與對(duì)照組比擬：

7、1)P0.01,2)P0.053討論3.1后不同時(shí)間點(diǎn)的認(rèn)知行為學(xué)測(cè)試及意義rris水迷宮是英國(guó)心理學(xué)家RihardG.rris1981年創(chuàng)造并應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的，此模型被廣泛應(yīng)用于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶研究中。實(shí)驗(yàn)時(shí)，大鼠在特定的水池中，出于求生的本能尋找一立足地。在水面下一固定位置有一個(gè)隱藏的平臺(tái)，大鼠只有找到平臺(tái)才能獲救。在這樣一個(gè)逃避性學(xué)習(xí)過(guò)程中，假如大鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間越長(zhǎng)，說(shuō)明其空間記憶才能越差;大鼠經(jīng)水下和水上平臺(tái)學(xué)習(xí)強(qiáng)化后，在探測(cè)性試驗(yàn)中去掉平臺(tái)，假如大鼠有良好的空間學(xué)習(xí)記憶才能，就會(huì)在原平臺(tái)所在區(qū)域停留較長(zhǎng)的時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)中，后814d大鼠逃避尋找平臺(tái)的時(shí)間明顯延長(zhǎng)，尤

8、其在后水下隱匿平臺(tái)測(cè)試的第9、10天和水上可視平臺(tái)的第13、14天，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性，提示大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損嚴(yán)重。在8d組的無(wú)平臺(tái)探測(cè)試驗(yàn)中(即第7天)和16d組的無(wú)平臺(tái)探測(cè)試驗(yàn)中(即第14天)，在原有平臺(tái)象限(第象限)停留時(shí)間與對(duì)照組相比明顯減少，差異具有顯著性，提示大鼠對(duì)空間記憶的保持情況有嚴(yán)重的影響。因此，水迷宮測(cè)試結(jié)果說(shuō)明，后大鼠出現(xiàn)中期(傷后714d)學(xué)習(xí)記憶功能障礙，而對(duì)早期(傷后16d)無(wú)明顯影響。以上rris水迷宮測(cè)試提示，后大鼠出現(xiàn)中期(傷后714d)學(xué)習(xí)記憶功能障礙，而對(duì)早期(傷后16d)無(wú)明顯影響。大鼠在rris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)為傷后較長(zhǎng)時(shí)間的空間認(rèn)知行為

9、障礙，可以推測(cè)這與其屢次受損導(dǎo)致?lián)p傷累積作用有關(guān)。3.2后不同時(shí)間點(diǎn)相關(guān)區(qū)DA能神經(jīng)元的變化及意義文獻(xiàn)資料顯示，創(chuàng)傷性腦損傷對(duì)TH表達(dá)具有一定的影響。Yan等6，7運(yùn)用控制性皮層沖擊造成TBI模型，用免疫組化和免疫印跡法檢測(cè)傷后28d后TH表達(dá)情況，免疫組化結(jié)果顯示紋狀體的TH表達(dá)升高，免疫印跡結(jié)果顯示前額葉皮質(zhì)的TH表達(dá)明顯升高。吳春云等8運(yùn)用金屬單擺式打擊裝置復(fù)制腦震蕩大鼠模型，應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)前額葉皮質(zhì)的DA能神經(jīng)纖維。發(fā)現(xiàn)傷后TH陽(yáng)性纖維的密度增加、反響增強(qiáng)，傷后4d到達(dá)頂峰，之后逐漸下降，直至傷后24d仍顯著增高。本研究顯示，后腦SNTH陽(yáng)性反響以傷后1d開(kāi)場(chǎng)升高，8d到達(dá)頂峰，與對(duì)照組相比4、8d組有顯著性差異;而VTA2、4、8、16d組有顯著性差異，以4d組TH陽(yáng)性反響到達(dá)頂峰，24d組根本恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)中后陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)急劇升高，可能與后神經(jīng)元的應(yīng)激反響有關(guān)。文獻(xiàn)資料說(shuō)明9，腦損傷時(shí)作用于神經(jīng)系統(tǒng)的瞬間機(jī)械暴力到達(dá)一定程度，導(dǎo)致廣泛的神經(jīng)元過(guò)度興奮，造成a2+處于超載狀態(tài)。在ATP、g2+存在下，神經(jīng)元內(nèi)TH活性可被a2+激活