【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)課件

1、【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究天然蛋白質(zhì)剪接全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的從頭設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目的為蛋白質(zhì)工程提供指導(dǎo)性信息探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理 簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)建筑或骨架的從頭設(shè)計(jì)是研究蛋白質(zhì)相互作用的類型及本質(zhì)的很好途徑，為解決蛋白質(zhì)折疊問題尋找定性和定量的規(guī)律蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目的為蛋白質(zhì)工程提供指導(dǎo)性信息簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)建筑或骨蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)存在問題設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)相比缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性極明顯的功能優(yōu)越性設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)有正確的形貌、顯著的二級(jí)結(jié)構(gòu)及合理的熱力

2、學(xué)穩(wěn)定性，但三級(jí)結(jié)構(gòu)的確定性較差蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)存在問題設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)相比缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特按照改造部位的多寡分為三類：第一類為“小改”，可通過定位突變或化學(xué)修飾來實(shí)現(xiàn)；第二類為“中改”，對(duì)來源于不同蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行拼接組裝；第三類為“大改”，即完全從頭設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)（de novo design） 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類按照改造部位的多寡分為三類：蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的分類蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì) 可分為兩個(gè)層次在已知立體結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上所進(jìn)行的直接將立體結(jié)構(gòu)信息與蛋白質(zhì)的功能相關(guān)聯(lián)的高層次的設(shè)計(jì)工作在未知立體結(jié)構(gòu)的情形下借助于一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列信息及生物化學(xué)性質(zhì)所進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)工作 蛋白質(zhì)的分子設(shè)計(jì) 可分為兩個(gè)層

3、次蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)程序蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)程序：各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分子設(shè)計(jì)程序按照蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)的層次分為序列分析、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、同源蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)突變體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、蛋白質(zhì)的性能預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)六個(gè)部分蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)程序蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)程序：各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分 計(jì)算機(jī)模擬 基因構(gòu)建突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品功能分析蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)第一節(jié) 基于天然蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)的分子設(shè)計(jì) 計(jì)算機(jī)模擬 基因構(gòu)建突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品功能分析蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)第蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)流程圖天然蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)晶體學(xué)新蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)幾何優(yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)構(gòu)分析與原先的結(jié)構(gòu)比較蛋白質(zhì)合成定位突變分離、

4、純化及表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)從數(shù)據(jù)庫輸入蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)流程圖天然蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)晶體學(xué)新蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)三維蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)大致涉及的幾個(gè)重要方面蛋白質(zhì)來源：真菌、細(xì)胞、動(dòng)物蛋白質(zhì)和植物蛋白質(zhì)篩選以及純化蛋白質(zhì)需要測(cè)定它們的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)大致涉及的幾個(gè)重要方面蛋白質(zhì)來源：真菌、細(xì)胞、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的判斷 目前PDB(Protein Data Bank)已收集數(shù)以萬計(jì)個(gè)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，但是通常蛋白質(zhì)序列的數(shù)目比蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的數(shù)目大100倍。1、對(duì)于已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)：根據(jù)PDB中三維結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行設(shè)計(jì)2、對(duì)于位置三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)：如果PDB中沒有收錄又未見文獻(xiàn)報(bào)道，我們

5、需要通過蛋白質(zhì)X射線晶體學(xué)及NMR方法測(cè)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，或者通過結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的方法構(gòu)建該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的判斷 計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)中占有重要位置。建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變位點(diǎn)或區(qū)域以及預(yù)測(cè)突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對(duì)蛋白質(zhì)工程是至關(guān)重要的 專一性突變產(chǎn)物是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成敗的關(guān)鍵。一些新技術(shù)，如PCR及自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展使各種類型的基因工程變得快速、容易 【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì) 二、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理 內(nèi)核假設(shè)。所謂內(nèi)核是指蛋白質(zhì)在進(jìn)化中保守的內(nèi)部區(qū)域。在大多數(shù)情況，內(nèi)核由氫鍵連接的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元組成 所有蛋白質(zhì)內(nèi)部都是密堆積(很少有空穴大到可以結(jié)合一個(gè)水分子或惰

6、性氣體)，并且沒有重疊。所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的(主鏈及側(cè)鏈) 二、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原理 內(nèi)核假設(shè)。所謂內(nèi)核是指蛋白質(zhì)在進(jìn)化中 疏水及親水基團(tuán)需要合理地分布在溶劑可及表面及不可及表面 在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何，符合正確的鍵長(zhǎng)、鍵角及整體的幾何 對(duì)于金屬蛋白，大部分配基含有多于一個(gè) 與金屬作用或形成氫鍵的基團(tuán)。其余形成圍繞金屬中心的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，這涉及與蛋白質(zhì)主鏈、側(cè)鏈或水分子的相互作用 最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列 結(jié)構(gòu)及功能的專一性。形成獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，獨(dú)特的分子間相互作用是生物相互作用及反應(yīng)的標(biāo)志 疏水及親水基團(tuán)需要合理地分布在溶劑可及表面及不可及表面蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法 設(shè)

7、計(jì)目標(biāo)解決辦法熱穩(wěn)定性對(duì)氧化的穩(wěn)定性對(duì)重金屬的穩(wěn)定性pH穩(wěn)定性提高酶學(xué)性質(zhì)引入二硫橋，增加內(nèi)氫鍵數(shù)目，改善內(nèi)疏水堆積，增加表面鹽橋把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu，把Trp轉(zhuǎn)換為Phe或Tyr把Cys轉(zhuǎn)換為Ala或Ser，把Met轉(zhuǎn)換為Gln、Val、Ile或Leu替代表面羧基替換表面荷電基團(tuán)His、Cys以及Tyr的置換，內(nèi)離子對(duì)的置換專一性的改變，增加逆轉(zhuǎn)數(shù)(turnover number)，改變酸堿度蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)及解決辦法 設(shè)計(jì)目標(biāo)解決辦法熱穩(wěn)定性引入二硫蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)步驟1）以蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定突變位點(diǎn)及替換的

8、氨基酸2）利用能量?jī)?yōu)化及蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)方法預(yù)測(cè)修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3）預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能或功能-穩(wěn)定性相關(guān)知識(shí)及理論計(jì)算預(yù)測(cè)新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)蛋白質(zhì)突變體設(shè)計(jì)步驟1）以蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，利用計(jì)算機(jī)注意問題A 應(yīng)確定蛋白質(zhì)折疊敏感的區(qū)域，包括帶有特殊扭角的氨基酸、鹽橋、密堆積區(qū)等B 應(yīng)確定對(duì)功能非常重要的位置C 考察剩余位置對(duì)所希望改變的影響D 當(dāng)進(jìn)行互換或插入/刪除殘基是應(yīng)考慮他們對(duì)結(jié)構(gòu)特征的影響，如疏水堆積、側(cè)鏈取向、氫鍵、鹽橋等注意問題三、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究定位突變?cè)诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中的作用突變蛋白質(zhì)構(gòu)象的探測(cè)三、蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)中的

9、結(jié)構(gòu)功能關(guān)系研究定位突變種類插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基替換或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基最大量的定位突變是在體外利用重 組DNA技術(shù)或PCR方法定位突變種類插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的評(píng)估溶解性熱力學(xué)分析射線晶體學(xué)及譜園二色散方法單克隆抗體探測(cè)構(gòu)象變化突變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的評(píng)估溶解性蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定1根據(jù)已知結(jié)構(gòu)信息確定功能殘基2突變實(shí)驗(yàn)方法鑒定功能殘基 隨機(jī)突變和刪除分析及連接片斷掃描突變3利用蛋白質(zhì)同源性鑒定功能殘基蛋白質(zhì)中功能殘基的鑒定1根據(jù)已知結(jié)構(gòu)信息確定功能殘基天然蛋白質(zhì)的剪裁分子剪裁：指在對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造中替換1個(gè)肽段或1個(gè)結(jié)構(gòu)域應(yīng)用：抗體分子的改造

10、；Rop天然蛋白質(zhì)的剪裁分子剪裁：指在對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造中替換1個(gè)肽【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)【生物】第三章蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)與功能的容忍度 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能對(duì)殘基的替換有一定的容忍度，即結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系有一定的穩(wěn)健度Fersht等替換了Barnase的所有內(nèi)核殘基。結(jié)果表明23的突變體保留了酶的活性Mathews及其合作者在溶菌酶內(nèi)核中替換多至10個(gè)殘基。實(shí)驗(yàn)證明多重取代的蛋白仍具有活性以及協(xié)同折疊這些結(jié)果說明不同的氨基序列具

11、有相近的設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)與功能的容忍度 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能對(duì)殘基的替換有一定的容忍第二節(jié) 全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)特征： 全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是另一類蛋白質(zhì)工程，合成具有特異結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì)。根據(jù)所希望的結(jié)構(gòu)及功能設(shè)計(jì)蛋白 質(zhì)或多肽的氨基酸序列第二節(jié) 全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)特征：蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)功能的從頭設(shè)計(jì)取得的進(jìn)展：血紅素結(jié)合蛋白、 氧化還原活性蛋白質(zhì)、 DNA結(jié)合蛋白 基于蛋白質(zhì)的高分子材料蛋白質(zhì)的全新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)中心問題：設(shè)計(jì)一個(gè)具有穩(wěn)定及獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu) 的序列 克服的障礙：線性聚合鏈的構(gòu)象熵采取的策略： 1）使相互作用的強(qiáng)度與數(shù)目達(dá)到 最大（理論基礎(chǔ)：分析已知結(jié)構(gòu) 的天

12、然蛋白質(zhì)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元） 2）通過共價(jià)交叉連接減小折疊的構(gòu)象熵一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從頭設(shè)計(jì)中心問題：設(shè)計(jì)一個(gè)具有穩(wěn)定及獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的從二級(jí)結(jié)構(gòu)模塊單元的自組裝：優(yōu)點(diǎn)：設(shè)計(jì)或合成都比較簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（熵較大，依賴濃度） 結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單重復(fù)螺旋設(shè)計(jì)使用的策略（p67）：1）使用大的形成螺旋傾向性的殘基，如亮氨酸、谷氨酸或賴氨酸等2）使用合適的集團(tuán)去除端基電荷，防止與螺旋偶極不合適的電荷相互作用3）使用極化或荷電氨基酸引入穩(wěn)定的氫鍵或在螺旋中相隔一圈殘基間的離子相互作用4）使用在螺旋中相隔一圈的殘基間疏水的范德華相互作用5）使用芳香-荷電-疏的相互作用蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)的手段二級(jí)結(jié)構(gòu)

13、模塊單元的自組裝：蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)的手段配體誘導(dǎo)組裝 配位結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)在結(jié)構(gòu)中有幾個(gè)相互作用片斷的界面處。如果這個(gè)位點(diǎn)對(duì)配體有很高的親和力，則結(jié)合配體的合適的自由能將充分克服熵消耗并且驅(qū)動(dòng)肽自組裝配體誘導(dǎo)組裝通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝設(shè)計(jì)全新蛋白的主要障礙是肽鏈的構(gòu)象熵。當(dāng)幾個(gè)沒有連接的肽鏈進(jìn)行自助裝時(shí)，熵勢(shì)壘比較難以克服。通過共價(jià)交叉連接可以減少構(gòu)象熵。自然界唯一用于交叉連接的方法是二硫鍵。蛋白設(shè)計(jì)時(shí)用DAB通過共價(jià)交叉連接實(shí)現(xiàn)肽的自組裝設(shè)計(jì)全新蛋白的主要障礙是肽在合成模板上肽的組裝在模板上組裝合成蛋白的方法特點(diǎn)：使用人工合成的模板代替天然蛋白中的連接二級(jí)結(jié)構(gòu)的單元模板：寡肽，可形成兩個(gè)反

14、平行折疊鏈，設(shè)計(jì)一個(gè)Pro-Gly的轉(zhuǎn)折。在鏈的兩端設(shè)計(jì)一個(gè)二硫鍵，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在合成模板上肽的組裝在模板上組裝合成蛋白的方法線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)不用模板或交叉連接而通過線性多肽折疊成球形的確定的三維結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)追求的目標(biāo)之一主要障礙：構(gòu)象熵實(shí)例:-螺旋 根據(jù)-螺旋的兩親性。形成的-螺旋顯著穩(wěn)定性是因?yàn)樾纬擅黠@的疏水核，還有Glu 和Lys形成的鹽橋，螺旋偶極的電荷中和，增加了在螺旋/轉(zhuǎn)折連接處的柔性線性多肽折疊為球狀結(jié)構(gòu)不用模板或交叉連接而通過線性多肽折基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)核心問題：埋藏疏水部分常用方法：二元模式 理論基礎(chǔ)：極性（P）和非極性（N）氨基酸的特性含義：一方面要

15、有利于形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，另一方面又要埋藏疏水殘基應(yīng)用：二級(jí)結(jié)構(gòu)兩親片斷的構(gòu)建基于組合庫的全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)核心問題：埋藏疏水部分P-N-P-N-P-NP-N-P-N-P-NP-N-P-P-N-N-P-P-NPNPPPNNPP-N-P-P-N-N-P-P-NPNPPPNNP非極性殘基由DNA密碼子NTN編碼 N：任何堿基極性殘基由DNA密碼子VAN編碼 V：C、A、G的混合非極性殘基由DNA密碼子NTN編碼 N：任何堿基 二、蛋白質(zhì)功能的全新設(shè)計(jì) 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)是產(chǎn)生既能折疊為預(yù)想的結(jié)構(gòu)又具有有趣和有用的功能。功能設(shè)計(jì)主要涉及鍵合及催化為達(dá)到這些目的可以采用兩條不同的途徑：反向?qū)崿F(xiàn)蛋白質(zhì)與工程底物的契合，改變功能；從頭設(shè)計(jì)功能蛋白質(zhì) 二、蛋白質(zhì)功能的全新設(shè)計(jì) 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目標(biāo)是產(chǎn)生既能折疊為蛋白質(zhì)的功能設(shè)計(jì)通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)新的功能鍵合及