二章菌種選育保藏與復(fù)壯

1、二章菌種選育保藏與復(fù)壯二章菌種選育保藏與復(fù)壯 第二章 菌種選育、保藏與復(fù)壯 第一節(jié) 工業(yè)常用微生物及要求一、常見微生物 （一）細(xì)菌（bacteria）醋酸桿菌屬（Acetobacter）乳桿菌屬（Lactobacillus）芽孢桿菌屬（Bacillus）短桿菌屬（Brevibacterium）棒桿菌屬（Corynebacterium）第2頁，共58頁幻燈片。 第二章 菌種選育、保藏與復(fù)壯第2頁，共58頁幻燈片。（二）放線菌（actinomyces）最大的經(jīng)濟(jì)價值在于產(chǎn)生多種抗生素（antibiotic）鏈霉菌（Streptomyces）小單孢菌屬（Micromonospora）第3頁，共58頁

2、幻燈片。（二）放線菌（actinomyces）第3頁，共58頁幻燈片 （三）霉菌（mould） 1.曲霉屬（Aspergillus） 黑曲霉（A. niger） 米曲霉（A. oryzae） 黃曲霉（A. flavus） 2.青霉屬（Penicillum） 桔青霉（P. citrinum）第4頁，共58頁幻燈片。 （三）霉菌（mould）第4頁，共58頁幻燈片。3. 根霉屬（Rhizopus ） 米根霉（R. oryzae） 華根霉（R. chinensis）4. 紅曲霉屬（Monascus）第5頁，共58頁幻燈片。3. 根霉屬（Rhizopus ）第5頁，共58頁幻燈片。（四）酵母（yeas

3、t）酵母屬（Saccharomyces） 啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）2. 假絲酵母屬（Candida） 產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）3. 畢赤酵母屬（Pichia）第6頁，共58頁幻燈片。（四）酵母（yeast）第6頁，共58頁幻燈片。（五）其它微生物1.擔(dān)子菌（basidiomycetes）即菇類（mushroom）2. 藻類（alga）第7頁，共58頁幻燈片。（五）其它微生物第7頁，共58頁幻燈片。幾種菌落第8頁，共58頁幻燈片。幾種菌落第8頁，共58頁幻燈片。 （六）噬菌體（phage） 危害以細(xì)菌和放線菌為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵工業(yè)。第9頁，共

4、58頁幻燈片。 （六）噬菌體（phage）第9頁，共58頁幻燈片。烈性噬菌體 引起寄主細(xì)胞迅速裂解。 受感染的細(xì)菌稱敏感性細(xì)菌。溫和噬菌體 隨寄主細(xì)胞的繁殖而繁殖。 含溫和噬菌體的細(xì)菌稱溶原性細(xì)菌。第10頁，共58頁幻燈片。烈性噬菌體第10頁，共58頁幻燈片。 二、微生物工業(yè)對菌種的要求1.原料廉價，生長迅速，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高。2.易控制培養(yǎng)條件，發(fā)酵周期較短。3.抗雜菌和噬菌體的能力強(qiáng)。4.不易變異和退化，不產(chǎn)生任何有害物質(zhì)和 毒素。第11頁，共58頁幻燈片。 二、微生物工業(yè)對菌種的要求第11頁，共58頁幻燈片。 第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育一、自然選育 1.采樣 2.增殖培養(yǎng) 方法： （1）

5、控制培養(yǎng)基成分 （2）控制培養(yǎng)條件 （3）抑制不需要的菌類第12頁，共58頁幻燈片。 第二節(jié) 工業(yè)微生物菌種的選育第12頁，共58頁幻燈片。3. 純種分離（1）劃線法：簡單、快捷。 （2）稀釋法：菌落單一均勻。是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)胞用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。有時這種單菌落并非都由單個細(xì)胞繁殖而來的，故必須反復(fù)分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達(dá)到分離目的的。第13頁，共58頁幻燈片。3. 純種分離是指把混雜在

6、一起的微生物或同一微生物群體中的不固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法第14頁，共58頁幻燈片。固體培養(yǎng)基四區(qū)劃法接種法第14頁，共58頁幻燈片。接種針先以火焰滅菌法滅菌 步驟一第15頁，共58頁幻燈片。接種針先以火焰滅菌法滅菌 步驟一第15頁，共58頁幻燈片。輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻 步驟二第16頁，共58頁幻燈片。輕觸營養(yǎng)平板上無菌的瓊脂處冷卻 步驟二第16頁，共58頁幻燈以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。 步驟三第17頁，共58頁幻燈片。以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細(xì)菌。 步驟三第17頁，共5更換一個新的無菌營養(yǎng)平板 步驟四第18頁，共58頁幻燈片。更換一個新的無菌營養(yǎng)平板 步驟四第1

7、8頁，共58頁幻燈片。將接種針上的細(xì)菌劃于一個新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū) 。步驟五第19頁，共58頁幻燈片。將接種針上的細(xì)菌劃于一個新的營養(yǎng)平板上。此為第一菌區(qū) 。步驟重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六第20頁，共58頁幻燈片。重復(fù)第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。步驟七第21頁，共58頁幻燈片。由第五步驟的第一區(qū)中劃出第二區(qū)，如右上圖。步驟七第21頁，共重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區(qū)中劃出第三區(qū)，如右上圖。 步驟八第22頁，共58頁幻燈片。重復(fù)第六以及第七步驟，由第七步驟的步驟八第

8、22頁，共58頁幻重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩下的空間。完成后的營養(yǎng)平板，如右上圖。步驟九第23頁，共58頁幻燈片。重復(fù)第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區(qū)中劃出第四區(qū)，劃滿剩 在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌種學(xué)名以及培養(yǎng)基名稱。步驟十第24頁，共58頁幻燈片。 在營養(yǎng)平板上貼好標(biāo)簽，標(biāo)示好接種日期、操作者姓名、菌固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法第25頁，共58頁幻燈片。固體培養(yǎng)基的稀釋涂抹接種法第25頁，共58頁幻燈片。需要使用的儀器震蕩機(jī) 第26頁，共58頁幻燈片。需要使用的儀器震蕩機(jī) 第26頁，共58頁幻燈片。吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液第27頁

9、，共58頁幻燈片。吸取準(zhǔn)備好欲稀釋的菌液第27頁，共58頁幻燈片。吸取充分均勻后的菌液 第28頁，共58頁幻燈片。吸取充分均勻后的菌液 第28頁，共58頁幻燈片。取含有 9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時試管須做記號為第一次稀釋。第29頁，共58頁幻燈片。取含有 9mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。第29頁，共5將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻 第30頁，共58頁幻燈片。將試管于震蕩機(jī)上，使菌液混合均勻 第30頁，共58頁幻燈片。取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL，加入另一個新的含9mL無菌水的試管中。重復(fù)此步驟直至所需要的稀釋濃度。 第31頁，共58頁幻燈片。取出試管

10、中的第一次十倍稀釋菌液1mL，第31頁，共58頁幻燈從最后稀釋菌液中吸取 0.1mL菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)。第32頁，共58頁幻燈片。從最后稀釋菌液中吸取 0.1mL菌液，置入準(zhǔn)備好的無菌瓊脂內(nèi)將三角玻璃棒浸于酒精中 第33頁，共58頁幻燈片。將三角玻璃棒浸于酒精中 第33頁，共58頁幻燈片。 將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒） 第34頁，共58頁幻燈片。 將三角玻璃棒在火焰上燃燒第34頁，共5 使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中隔天觀察菌落數(shù)目，再依照稀釋倍數(shù)推算出菌液濃度。 第35頁，共58頁幻燈片。 使用玻璃棒將菌液均勻涂布

11、開來，將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱第36頁，共58頁幻燈片。第36頁，共58頁幻燈片。4. 生產(chǎn)性能的測定 一般采用兩步法： 初篩：以量為主 復(fù)篩：以質(zhì)為主第37頁，共58頁幻燈片。4. 生產(chǎn)性能的測定第37頁，共58頁幻燈片。 二、誘變育種 用各種物理、化學(xué)的因素人工誘發(fā)基因突變。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質(zhì)。誘變劑物理：紫外線，快中子化學(xué)：硫酸二乙酯，亞硝基胍第38頁，共58頁幻燈片。 二、誘變育種誘變劑物理：紫外線，快中子化學(xué)：硫酸二 誘變育種的主要環(huán)節(jié)（1）以合適的誘變劑處理細(xì)胞懸浮液 誘變（2）用合適的方法淘汰負(fù)效應(yīng)變異株， 選出性能優(yōu)良的正變異株篩選第39頁，共58頁幻燈片。 誘

12、變育種的主要環(huán)節(jié)第39頁，共58頁幻燈片。 第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的改良 一、原生質(zhì)體融合（protoplast fusion） 1.標(biāo)記菌株的篩選 2.原生質(zhì)體的制備 3.原生質(zhì)體的融合與再生 聚乙二醇（PEG）脫水劑 助融劑 Ca2+提高融合頻率 4.融合子的選擇原生質(zhì)體，它是細(xì)胞進(jìn)行各類代謝的主要場所，是細(xì)胞中重要的部分。原生質(zhì)體可分為質(zhì)膜、細(xì)胞器、胞基質(zhì)三部分第40頁，共58頁幻燈片。 第三節(jié) 生產(chǎn)菌種的改良原生質(zhì)體，它是細(xì)胞進(jìn)行各第41頁，共58頁幻燈片。第41頁，共58頁幻燈片。 二、DNA重組技術(shù)（DNA recombination technology）目標(biāo)DNA片斷的獲得與載體DN

13、A分子的連接重組DNA分子引入宿主細(xì)胞從中選出所需重組DNA分子的宿主細(xì)胞第42頁，共58頁幻燈片。 二、DNA重組技術(shù)第42頁，共58頁幻燈片。 第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏一、菌種的衰退 衰退的原因：1.菌種保藏不當(dāng)2.菌種生長條件沒有得到滿足第43頁，共58頁幻燈片。 第四節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯與保藏第43頁，共58頁幻燈片。二、 菌種的復(fù)壯 1. 純種分離 2. 通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯 3. 淘汰已衰退的個體第44頁，共58頁幻燈片。二、 菌種的復(fù)壯第44頁，共58頁幻燈片。三、菌種保藏 1.原理 低溫、干燥、缺氧、缺營養(yǎng)物質(zhì) 2. 方法 （1）斜面保藏法 （2）干燥保藏法 （3）懸液保藏

14、法 （4）冷凍干燥保藏法 （5）低溫保藏法第45頁，共58頁幻燈片。三、菌種保藏第45頁，共58頁幻燈片。 第五節(jié) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)一、微生物的培養(yǎng)方法 1.表面培養(yǎng) 2.固體培養(yǎng) 3.液體深層培養(yǎng)第46頁，共58頁幻燈片。 第五節(jié) 種子的擴(kuò)大培養(yǎng)第46頁，共58頁幻燈片。第47頁，共58頁幻燈片。第47頁，共58頁幻燈片。二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng) 菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的： 為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子。 第48頁，共58頁幻燈片。二、菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)第48頁，共58頁幻燈片。 （一）種子制備的工藝流程 搖瓶保藏菌種 試管斜面活化 茄瓶斜面 種子罐 固體培養(yǎng)基第49頁，共58頁幻燈片。 （

15、一）種子制備的工藝流程第49頁，共58頁幻燈片。第50頁，共58頁幻燈片。第50頁，共58頁幻燈片。第51頁，共58頁幻燈片。第51頁，共58頁幻燈片。搖瓶種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)第52頁，共58頁幻燈片。搖瓶種子培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)第52頁，共58頁幻燈片。第53頁，共58頁幻燈片。第53頁，共58頁幻燈片。第54頁，共58頁幻燈片。第54頁，共58頁幻燈片。（二） 斜面菌種的培養(yǎng) 1.不宜多次移種。 2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。 培養(yǎng)基特點：原料較精細(xì)。第55頁，共58頁幻燈片。（二） 斜面菌種的培養(yǎng)第55頁，共58頁幻燈片。（三）一級種子培養(yǎng)（搖瓶）培養(yǎng)基特點： 使用的原料基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基。第56頁，共58頁幻燈片。（三）一級種子培養(yǎng)