淺析葛根素對(duì)大鼠局灶性缺血腦組織內(nèi)海馬神經(jīng)元型一氧化氮合酶表

1、淺析葛根素對(duì)大鼠局灶性缺血腦構(gòu)造內(nèi)海馬神經(jīng)元型一氧化氮合酶表【摘要】目的不雅察葛根素對(duì)大鼠局灶性腦缺血海馬神經(jīng)元神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNS)表達(dá)的影響。要領(lǐng)局灶性腦缺血模子由線栓法壅閉大鼠大腦中動(dòng)脈制成，葛根素腹腔注射干預(yù)治療，接納氯化三苯基四氮唑染色要領(lǐng)測(cè)定腦梗死體積，免疫構(gòu)造化學(xué)要領(lǐng)測(cè)定大鼠腦缺血后差異時(shí)間點(diǎn)前后海馬區(qū)nNS陽性神經(jīng)元表達(dá)的變革。效果2h和12h干預(yù)組腦梗死體積顯著小于比擬組(P0.05)，24h干預(yù)組與比擬組比力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。缺血2h組海馬nNS陽性細(xì)胞開始增長，12h組最高，24h組較前有所落落;干預(yù)組大鼠海馬nNS陽性細(xì)胞數(shù)與比擬組比力低落顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)

2、差異(P0.01)。結(jié)論nNS到場(chǎng)早期腦缺血損傷，葛根素通過按捺nNS表達(dá)對(duì)大鼠腦神經(jīng)元損傷起庇護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】大鼠;葛根素;腦缺血損傷;神經(jīng)型一氧化氮合酶;海馬KEYRDS:rat;Puerarin;erebralisheiinjury;nitrixidesynthase;hippapus神經(jīng)型一氧化氮合酶(neurnalnitrixidesynthase,nNS)重要存在于神經(jīng)細(xì)胞，生理狀態(tài)下活性很低，一旦被激活，那么可一連產(chǎn)生大量一氧化氮(nitrixide,N)，到場(chǎng)腦缺血的病理損傷歷程1。葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮類化合物，具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和腦血管，改進(jìn)微循環(huán)，抗氧化、掃除自

3、由基和對(duì)缺血損傷庇護(hù)等作用2。已有研究創(chuàng)造葛根素對(duì)中樞神經(jīng)元的缺血損傷有庇護(hù)作用。但是，其腦庇護(hù)作用機(jī)制是否有nNS的到場(chǎng)尚不明白。本實(shí)行在創(chuàng)立大鼠大腦中動(dòng)脈梗死局灶性腦缺血模子的底子上，接納免疫組化要領(lǐng)測(cè)定缺血后海馬區(qū)差異時(shí)間段nNS表達(dá)的變革，并闡發(fā)葛根素是否對(duì)nNS有按捺作用，以進(jìn)一步探究其腦庇護(hù)機(jī)制。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1重要試劑和儀器葛根素購自陜西安康正大制藥廠。兔抗大鼠nNS多克隆抗體購自武漢博士德，SAB試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中山生物技能。應(yīng)用LEiu-2045德國產(chǎn)白臘切片機(jī)，應(yīng)用德國Leia圖像信號(hào)網(wǎng)羅與闡發(fā)體系。1.2實(shí)行動(dòng)物與分組干凈級(jí)康健雄性SD大鼠105只，鼠齡

4、23月，體重250300g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)行動(dòng)物中央。隨機(jī)分為3組：模子干預(yù)組(n=45)、模子比擬組(n=45)和假手術(shù)組(n=15)。模子干預(yù)組及比擬組按照干預(yù)時(shí)間差異又分為2h組、12h組、24h組，每組15只。各模子干預(yù)組別離于分組對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)賜與一次性葛根素注射液(100g/kg)腹腔注射，各模子比擬組及假手術(shù)組賜與等量生理鹽水腹腔注射。1.3腦缺血模子的制備參照ZEA-LNGAR3和KIZUI4的插線要領(lǐng)，略加改進(jìn)。應(yīng)用100L/L的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，線栓的制作選市售尺度尼龍漁線，直徑規(guī)格為0.240.26，頭部沾上清漆約0.5，使其頭部略粗且平滑，晾干后酒精干凈

5、，臨用前置肝素中浸泡10in。從左側(cè)頸總動(dòng)脈插入，進(jìn)入長度約為1820，略感阻力即制止進(jìn)線，從而制造左側(cè)大腦中動(dòng)脈供血區(qū)完全性局灶性腦缺血模子。記載線栓時(shí)間，均為一連栓塞。模子樂成尺度：右側(cè)肢體疼痛回縮癡鈍或消散;提尾倒懸時(shí)右上肢向胸前屈曲;行走時(shí)右側(cè)傾倒或向右轉(zhuǎn)圈。模子干預(yù)組及比擬組均建成模子，假手術(shù)組除不插入線栓外，別的操縱同上。1.4氯化三苯基四氮唑標(biāo)本的制備與闡發(fā)給藥5h后，將大鼠麻醉敏捷斷頭，剝離大腦。生理鹽水沖洗半晌，-20速凍5in，然后棄去小腦和延髓，將腦從額極向后一連冠狀切面，每2一張。放入10g/L氯化三苯基四氮唑(tripheyetetrazliuhlride,TT)中，

6、37搖擺恒溫孵育30in，0.1l/L磷酸鹽酸緩沖溶液沖洗23次。然后用40g/L多聚甲醛溶液結(jié)實(shí)24h。將結(jié)實(shí)的腦片按切片挨次擺列，照相后掃描輸入盤算機(jī)。用圖像處置懲罰軟件盤算每一腦片白色地區(qū)的面積及赤色地區(qū)的面積，乘以厚度(2)并將所得數(shù)值相加得相應(yīng)的體積。1.5取材與制片給藥5h后，以100L/L水合氯醛3L/kg腹腔注射麻醉大鼠，舉行心內(nèi)穿刺灌注結(jié)實(shí)，先用約250L室溫肝素鹽水快速灌注，繼之以440g/L多聚甲醛300L遲鈍灌注結(jié)實(shí)1h。立即斷頭取腦，沿視交織冠狀位切取大腦構(gòu)造并分散小腦構(gòu)造，將其置于40g/L多聚甲醛緩沖結(jié)實(shí)液12h，結(jié)實(shí)，隨后梯度酒精脫水、白臘包埋，制作白臘切片(片

7、厚7)。白臘切片經(jīng)水浴燙片，貼在預(yù)先以多聚賴氨酸處置懲罰的載玻片上，601h，37烘箱留宿。別離行HE染色、免疫組化染色。1.6免疫構(gòu)造化學(xué)檢測(cè)nNS陽性細(xì)胞白臘切片通例脫蠟，30L/LH22室溫孵育40in阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，熱抗原修復(fù)10in，室溫冷卻2h，正常山羊血清關(guān)閉20in，滴加一抗兔抗大鼠nNS多克隆抗體(事情濃度為1100)，4冰箱留宿，生物素化二抗室溫孵育40in，滴加磷酸鹽酸緩沖溶液事情液，37孵育20in，DAB顯色5in，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片、磷酸鹽酸緩沖液別離取代一抗經(jīng)上述步調(diào)染色作空缺比擬。1.7nNS陽性細(xì)胞的圖像闡發(fā)光學(xué)顯微鏡下不雅察大鼠海馬A1區(qū)全部

8、nNS陽性神經(jīng)元，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，每張切片高倍鏡(1040)下隨機(jī)選擇5個(gè)差異的視野，圖像信號(hào)網(wǎng)羅與闡發(fā)體系照相，接納自帶圖像闡發(fā)軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽性細(xì)胞數(shù)，取其均勻值。2效果2.1腦梗死體積的比力干預(yù)組和比擬組正常構(gòu)造被染成赤色，梗死灶呈慘白色，從而確定腦梗死范疇并得到其梗死體積;假手術(shù)組腦構(gòu)造被染成赤色，無慘白色的梗死灶。2h干預(yù)組和12h干預(yù)組腦梗死體積顯著小于比擬組(P0.05)，24h干預(yù)組與比擬組比力，梗死體積的變革沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05，表1)。表1各組大鼠腦梗死體積的比力2.2各組HE染色的病理特點(diǎn)光鏡下不雅察假手術(shù)組海馬A1區(qū)神經(jīng)元擺列整潔，核膜明晰，

9、核仁顯著，未見神經(jīng)變性、壞死等病理改變。比擬組海馬A1區(qū)神經(jīng)元漫衍不均，可見胞體皺縮，胞質(zhì)濃縮，核固縮深染。干預(yù)組海馬A1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)介于上述兩組之間(圖1)。2.3各組海馬A1區(qū)nNS陽性細(xì)胞數(shù)的比力鏡下不雅察見假手術(shù)組海馬錐體細(xì)胞層有散在漫衍的nNS陽性細(xì)胞，以胞質(zhì)染色為主。比擬組及干預(yù)組均見散在漫衍的nNS陽性細(xì)胞(圖2)，且陽性細(xì)胞數(shù)均增長，12h組表達(dá)最高，24h組較12h組有所落落，各組與假手術(shù)組比力有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。干預(yù)組海馬A1區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)與比擬組比力均顯著落落，與比擬組比力有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01，表2)。表2各組大鼠海馬A1區(qū)nNS陽性細(xì)胞數(shù)的比力與比擬組各相應(yīng)時(shí)

10、間點(diǎn)比擬，*P0.01;與假手術(shù)組比擬，P0.01。圖1差異組海馬A1區(qū)HE染色的病理改變Fig.1HistpathlgialhangesfA1hippapalneurnsindifferentgrups(HE,400)A：假手術(shù)組;B：2h比擬組;：2h干預(yù)組。2A：假手術(shù)組;B：2h比擬組;：12h比擬組;D：24h比擬組;E：2h干預(yù)組;F：12h干預(yù)組;G：24h干預(yù)組。圖2海馬A1區(qū)的nNS陽性細(xì)胞的免疫組化染色Fig.2ThenNS-psitiveellsinthehippapusA1(400)3討論N以L-精氨酸為底物，在NS催化作用下天生，是一種緊張的信使分子，到場(chǎng)多種疾病的病

11、理生理歷程。N在中樞神經(jīng)體系中具有兩重作用5：一方面具有神經(jīng)介質(zhì)通報(bào)信息的作用和血管擴(kuò)張作用，另一方面具有神經(jīng)毒性作用。nNS重要存在于神經(jīng)細(xì)胞，尤其是小腦神經(jīng)元中，腦缺血后過分表達(dá)的nNS在神經(jīng)細(xì)胞早期損傷中起關(guān)鍵作用6，其損傷機(jī)制大概是nNS表達(dá)上調(diào)，產(chǎn)生大量N，進(jìn)而產(chǎn)生大量自由基，損傷線粒體及DNA，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用6。因此，nNS及N在腦缺血中的作用越來越受到存眷。本實(shí)行選擇對(duì)腦缺血相對(duì)較敏感的海馬區(qū)，不雅察腦缺血后海馬A1區(qū)nNS表達(dá)的變革，創(chuàng)造缺血2h組nNS表達(dá)升高，12h組進(jìn)一步升高，24h組較前落落，與假手術(shù)組比擬有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)，提示nNS介導(dǎo)腦缺血

12、早期的損傷，并表示為先升高、后有所落落的趨勢(shì)。楊衛(wèi)忠等7研究表現(xiàn)nNSRNA在缺血0.56h呈高表達(dá)，nNS基因在腦缺血早期表達(dá)，nNS重要在神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，腦缺血產(chǎn)生后即有短暫的N增高，重要由神經(jīng)元的nNS及血管內(nèi)皮的nNS介導(dǎo)。外洋學(xué)者用免疫組化的要領(lǐng)查抄大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模子缺血部位見nNS的神經(jīng)元數(shù)目在4h增至岑嶺，24h開始減退，約7d后回到缺血前程度8。而在長時(shí)間的腦缺血模子中，也可檢測(cè)到nNSRNA表達(dá)的增長9。腦缺血后期nNS活性的落落與快速升高的N有關(guān)。N可以使nNS中巰基亞硝基化，導(dǎo)致nNS活性落落。葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮類化合物，對(duì)腦缺血性損傷具有較好

13、的腦庇護(hù)作用。我們先前的實(shí)行亦證實(shí)葛根素可進(jìn)步缺血腦構(gòu)造細(xì)胞內(nèi)氧濃度到達(dá)腦庇護(hù)作用10。本實(shí)行效果表白，12h內(nèi)賜與葛根素干預(yù)可以或許顯著減小腦梗死體積，24h后葛根素干預(yù)腦梗死體積雖有所減校但是，與模子比擬組比擬無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。神經(jīng)庇護(hù)的重要目的是拯救缺血半暗帶，假設(shè)半暗帶地區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞得到救治，梗死地區(qū)將不會(huì)擴(kuò)大。由此我們可以推測(cè)腦梗死后早期應(yīng)用葛根素可以或許拯救缺血半暗帶內(nèi)的細(xì)胞，從而顯著地淘汰梗死體積，起到神經(jīng)庇護(hù)作用。本實(shí)行效果表白，應(yīng)用葛根素后海馬A1區(qū)nNS表達(dá)淘汰，提示葛根素大概通過按捺海馬nNS的表達(dá)，對(duì)腦構(gòu)造起庇護(hù)作用。nNS的顛簸將引起細(xì)胞內(nèi)N的顛簸;而王姿穎等11和譚軍等

14、12均報(bào)道在大鼠模子中可見葛根素通過低落缺血再灌注區(qū)腦構(gòu)造N的含量而對(duì)缺血再灌注腦損傷發(fā)揮庇護(hù)作用。因此，葛根素干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)nNS表達(dá)的按捺應(yīng)是其腦庇護(hù)的一緊張機(jī)制。但是，它畢竟是通過何種途徑淘汰nNS的表達(dá)，從而拮抗N的毒性作用，尚需進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】1ESPLUGUESJV.NasasignalingleuleinthenervussysteJ.BrJPhara,2002,135(5):1079-1095.2潘洪平.葛根總黃酮和葛根素的藥理研究希望J.廣西醫(yī)學(xué),2022,25(10):1941-1942.3LNGAEZ,EiNSTEINPR,ARLSNS,etal.Reversibl

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