柱子的清潔和再生

1、反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析 極大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。大多數(shù)用于反相色譜 的固定相都是天然的疏水物質(zhì)，因此，分析物是按照它們與固定相的疏水相互作 用的大小來分離的，含有疏水的機(jī)制也能以同樣的保留方式分離。固定相上還有少數(shù)物質(zhì)，如混合相（例如苯基-己基）、末端封閉和非末端 封閉種類和極性嵌入相-也存在于這些鍵合硅膠上。還有很多填料用于反相色 譜，包括聚合物，聚合物表面涂上硅膠和氧化鋁，無機(jī)-有機(jī)混合物，涂層氧化 鋯，和石墨化碳。不同種類的固定相有他們自己的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。反相色譜柱利用各種流動(dòng)相和添加物可以有很多的應(yīng)用。一些技術(shù)利

2、用添加 物可以改變或修飾填料的表面。有時(shí)候這些添加物有可能會(huì)污染鍵合相表面。硅膠表面因?yàn)橛兄杷I合相而有一些別的化學(xué)性質(zhì)。殘留的硅烷醇存在于 所有的硅膠鍵合填料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質(zhì) 成分，特別是堿性成分。因?yàn)楣柰榇嫉膒Ka值大約是4.5 ,離子化能在中性pH 條件下發(fā)生因此與陽離子產(chǎn)生靜電相互作用就有可能發(fā)生。較老的A型硅膠能 容納高濃度金屬離子（有時(shí)候100ppm或更多），而這能使硅膠表面的酸性更大 甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合 短鏈鍵合相如C2或C4上更讓人煩惱。使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質(zhì)和可能的分

3、析物-固定相表 面的相互作用，這樣當(dāng)他們使用反相方法時(shí)才能考慮到可能的基質(zhì)相互作用。例 如，非常疏水的樣品基質(zhì)如玉米油，高芳香物質(zhì)，和蠟?zāi)苷匙」潭ㄏ嘌b填表面并 且改變他們的性質(zhì)。含有蛋白質(zhì)物質(zhì)的生物流體也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努力來保護(hù)HPLC柱子，某些分析物-基質(zhì)污染能使固定相受到有害 的影響。當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會(huì)有些不同。被污染的柱子 能產(chǎn)生反壓問題。被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復(fù)原來的操作條件。 這部分的柱子觀察將討論可行的方法使柱子回復(fù)原來的或差不多原來的狀態(tài)。 因?yàn)殒I合硅膠柱子是最受歡迎的，我重點(diǎn)講述這種柱子。最后，我將討論別的反 相柱子

4、的清潔步驟。什么導(dǎo)致反相柱子污染產(chǎn)生？通常，樣品中含有一些對(duì)分析者來說不感興趣 的東西。鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)是一些 可能在使用時(shí)與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。這些物質(zhì)有比分析者的目標(biāo)物或 少或大的保留值。那些保留值較小的物質(zhì)如鹽類一般來說在空體積時(shí)就被沖出色 譜柱。這些非目標(biāo)產(chǎn)物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線 上移或者是負(fù)峰。如果樣品成分在柱子中有很強(qiáng)的保留而且流動(dòng)相溶液成分不足 以把這些物質(zhì)洗脫下來，多次上樣后，這些吸附在柱子表面的物質(zhì)通常就會(huì)積累 在柱頭。這些行為通常只有通過平行實(shí)驗(yàn)才能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被 緩慢洗出而且表

5、現(xiàn)為寬峰，基線擾動(dòng)，或者基線漂移。有時(shí)候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開始形成新的固定 相。分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機(jī)理。保留時(shí)間會(huì)波動(dòng)，拖尾會(huì)出 現(xiàn)。如果足夠的污染產(chǎn)生，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，使柱子無 法工作以及在堵塞處產(chǎn)生空體積。清洗硅膠鍵合柱子再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣?去除。如果污染是因?yàn)橹貜?fù)進(jìn)樣時(shí)強(qiáng)保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡單的步驟來 除去這些污染物往往能恢復(fù)其色譜行為。有時(shí)候，經(jīng)過多次操作以后的色譜柱用 90 100%的溶劑8（雙溶劑反相系統(tǒng)中較強(qiáng)的溶劑）沖洗20個(gè)體積可以清除污 染物。（表2列舉

6、了不同規(guī)格的HPLC柱子的空體積，因此讀者能方便地確定相 應(yīng)柱子沖洗的體積。）例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、 四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強(qiáng)溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高 濃度有機(jī)溶劑可能會(huì)使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會(huì)導(dǎo)致更大的問題 如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖 流動(dòng)相（即把緩沖液換成水）。沖洗510個(gè)體積以后才更換強(qiáng)溶劑。有時(shí)候，強(qiáng)溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強(qiáng)的溶劑或 者是一系列溶劑就有必要用來清洗柱子樂，如果污染物是非生物物質(zhì)，使用者可 以跳過一個(gè)或多個(gè)另外的有機(jī)溶劑去除污染物。溶劑與溶

7、劑之間的組合有很多。 到柱子廠家的網(wǎng)頁上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。般來說，所有的清洗方法都有類似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強(qiáng)度增 加，經(jīng)常最后一個(gè)溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來溶解非 極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類。我們必須保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑 互混。清洗過程要結(jié)束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強(qiáng)度能互混的溶劑而回到原始溶劑 系統(tǒng)。例如，異丙醇是一個(gè)非常好的作為中間步驟的溶劑，因?yàn)樗芘c正己烷或 二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流 速以免使泵壓過高。當(dāng)然，如果使用紫外檢測器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸 收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線

8、平穩(wěn)。對(duì)于典型的硅膠鍵合柱來說如果沒有緩沖溶液的話推薦使用以下溶劑系列：100%甲醇100%乙晴75%乙晴-25%異丙醇100%異丙醇100%二氯甲烷100%正己烷用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用 原來的水相溶劑。每種溶劑至少?zèng)_洗10個(gè)柱體積。如250mmx4.6mmHPLC分析 柱，分析者可以用1 2ml/min的流速來沖洗，要回復(fù)原來的溶劑體系，不需要 每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。中間步驟推薦使用異丙醇，然后用沒有緩沖 的流動(dòng)相，最后回復(fù)起始流動(dòng)相配置。四氫呋喃是另外一種比較受歡迎的去除污 染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴(yán)重污染，可以二甲基亞砜（DMS

9、O ）或者二 甲基甲酰銨和水按50 : 50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流過色譜柱。成 功再生反相柱子是一個(gè)非常耗時(shí)間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操 作。還有一個(gè)問題是清洗過程中是否可以把HPLC柱子反過來。因?yàn)榇蠖鄶?shù)強(qiáng)保留的 污染物都會(huì)累積在柱頭，把柱子反過來可以縮短污染物被沖出柱子的移動(dòng)距離。 考慮到裝填柱子的穩(wěn)定性，現(xiàn)在大多數(shù)HPLC柱子都是比普通操作壓力大很多的 高壓裝填的，因此他們的柱床應(yīng)該不會(huì)受到反方向流速的影響。但是，如果頭上 的燒結(jié)比尾部的燒結(jié)孔徑大的話。例如尾部燒結(jié)的孔徑是2pm，他通常能夠留住平均5pm孔徑里的填料。有時(shí)侯廠家會(huì)讓頭部孔徑較大以避免樣品或

10、流動(dòng)相顆粒堵塞。如果這種孔徑大于裝填顆粒尺寸分布曲線的最小粒徑時(shí)，有些填料能穿 過這些縫隙而流出色譜柱，這樣會(huì)導(dǎo)致空白出現(xiàn)。如果柱子有箭頭標(biāo)志建議的流 動(dòng)方向，我建議通過操作手冊和說明書，廠家主頁或者技術(shù)支持部門等確認(rèn)是否 可以把柱子反過來沖。無論你是否把柱子反方向，最好不要讓溶劑通過檢測器避 免污染物和穿透縫隙的顆粒進(jìn)入檢測池，否則有可能引起污染。清洗柱子頻率主要看有多少強(qiáng)保留物質(zhì)被打入色譜柱。因?yàn)榉聪嘀袝r(shí)候在 分辨率消失或者鬼峰出現(xiàn)前能承受很大的污染，使用者經(jīng)常會(huì)等到出現(xiàn)了異常情 況才開始注意。然而，污染物過多的累積會(huì)導(dǎo)致清洗柱子的難度加大。所以，如 果你知道經(jīng)常用雜質(zhì)較多的樣品上樣時(shí)，

11、我建議你們有規(guī)律地清洗柱子，你越是 頻繁清洗柱子，就清洗起來就越不費(fèi)勁。清洗硅膠鍵合反相柱的蛋白質(zhì)殘余如果是生物物質(zhì)如血漿或血清等積累在反相色譜柱上，操作者必須采用不同 的清洗程序。大部分情況下，純有機(jī)溶劑如乙晴或甲醇不溶解多肽和蛋白質(zhì)因此 不能有效地清洗柱子。然而，有機(jī)溶劑和緩沖液、酸、離子對(duì)試劑等的混合物則 能有效地溶解。一開始，先開始嘗試用百分比含量高的高強(qiáng)度溶劑（溶劑B）沖 洗一體積Freiser和他的合作者發(fā)現(xiàn)重復(fù)變化三氟乙酸水溶液和三氟乙酸-丙醇 之間梯度的高低可以再生被污染的反相柱子。Bhadwaj和Day認(rèn)為在250mmx 46mm的柱子中注入100pL的三氟乙醇就能起到效果。

12、如果上述幾個(gè)方法都不成 功，Cunico和他的同事推薦了幾種強(qiáng)溶劑和增溶劑來除去蛋白質(zhì)（見表三）。 在使用這些溶劑之前，可以先咨詢柱子的廠商確保這些溶劑能與柱子的填料相 容。硅膠基質(zhì)的柱子通常來說都是相容的，但有機(jī)聚合物基質(zhì)的柱子可能會(huì)在某 些溶劑組合中膨脹或收縮，這樣會(huì)影響其色譜行為。當(dāng)用前述的溶劑系列時(shí)，確保表三所提到的溶劑能與系列中的溶劑互混。對(duì) 每個(gè)溶劑系統(tǒng)至少要沖洗20體積。由于有些溶劑系統(tǒng)黏性很大，沖洗的流速應(yīng) 該相應(yīng)調(diào)整以確保不會(huì)超過泵壓。用完胍或尿等溶劑侯，至少應(yīng)該用40-50體 積的HPLC級(jí)水來沖洗柱子。對(duì)于反相柱子，不建議用表面活性劑如十二烷基磺酸鈉（SDS ）和三硝基甲

13、苯， 因?yàn)檫@些化合物必然會(huì)牢固吸附在硅膠鍵合相柱子上很難除去。用表面活性劑會(huì) 影響裝填表面而改變其性質(zhì)。然而有一個(gè)分離小組的研究表明由某個(gè)小組做的污 染后的柱子可以用500pL1%SDS溶液用1ml/min的流速清除下多肽合成產(chǎn)物。 如果繼續(xù)用從5%95%含1%（v/v）三氟乙酸的乙晴梯度洗脫，可以恢復(fù)多肽 的分離。清洗反相柱的特殊技巧有時(shí)候，用有機(jī)溶劑清洗污染柱子并不能成功。如果金屬離子吸附在硅膠或 鍵合相上這種情況更有可能發(fā)生。用鰲合劑如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA ）通 過色譜柱時(shí)，含有很多金屬離子的EDTA復(fù)合物能溶解他們。用完EDTA溶液 后，分析者一定要用水完全沖洗柱子。如果樣

14、品含有離子化合物，變化pH可以 使他們轉(zhuǎn)為非離子狀態(tài)，這樣他們就可以被水-有機(jī)溶劑混合物洗脫下來。例如， 強(qiáng)堿性物質(zhì)能在pH低于3時(shí)被除去，在這個(gè)條件下質(zhì)子銨變得水溶性更好。酸 性物質(zhì)能在pH調(diào)整到大于其pKa時(shí)被洗下來-大約時(shí)pH8或9 ,這個(gè)狀態(tài)酸性 物質(zhì)處于離子狀態(tài)。然而，要注意硅膠柱子在長時(shí)間處于高pH條件下容易被破 壞。要避免緩沖液或用緩沖液保存的柱子長菌，可以用普通家用漂白劑1 ：10或1 :20來沖洗。在這之間至少要打50體積色譜純的水。不能讓漂白水通過檢測器因?yàn)槠姿畷?huì)腐蝕檢測池。避免溶劑瓶中緩沖液長菌，每次只取足夠的緩沖液用， 把沒用的保存在冰箱里，添加0.1%疊氮化鈉在緩沖

15、液中，用緩沖液保存的柱子 不能長期不用。色譜工作者經(jīng)常會(huì)討論到離子對(duì)色譜中離子對(duì)試劑對(duì)固定相的影響。顯然離 子對(duì)試劑如辛烷-磺酸（用于陽離子）和四烷基銨漠（用于陰離子）在一定濃度 的有機(jī)修飾劑下能很強(qiáng)地吸附在硅膠鍵合柱子上。柱子因此被污染很難回復(fù)到起 始狀態(tài)，因此人們都認(rèn)為任何用于離子對(duì)的柱子都會(huì)被破壞而且用于不能再用于 普通的反相色譜。Bidlingmeyer不同意這種觀點(diǎn)，他認(rèn)為用于離子對(duì)色譜苛刻的pH值會(huì)通過水 解鍵合相和在酸性條件下（pH1-3 ）硬化硅膠或在高pH條件下（pH7-8 ）溶解硅 膠使一些柱子的性質(zhì)改變。要清除離子對(duì)試劑中的磺酸，他建議首先用相同的沒 有離子對(duì)的緩沖液（至

16、少20體積）沖洗然后用沒有緩沖液的流動(dòng)相（在清洗過程 中甲醇可能比乙晴更有效；如果是長鏈的離子對(duì)試劑，用四氫呋喃）。很明顯， 磺酸離子對(duì)試劑和銨離子對(duì)試劑有著不同的表現(xiàn)。Bidlingmeyer和他的合作者證 明了在C18柱子上用流動(dòng)相濃度大于70%的甲醇，長鏈離子對(duì)試劑，SDS不會(huì) 吸附在固定相上。這個(gè)發(fā)現(xiàn)跟分離組的結(jié)果一致。硅膠鍵合整體柱如Chromolith 柱子（默克公司，德國）可認(rèn)為跟別的硅膠柱一樣。聚合柱子的再生用來分離生物分子的聚合柱也會(huì)被污染也需要清潔。聚合材料的化學(xué)穩(wěn)定性 通常以作用力來衡量。事實(shí)上，很多廠家建議用1.0M的硝酸或1.0M的氫氧化 鈉來清洗。一些反相聚合柱如用

17、聚（苯乙烯-二乙烯基苯）（PS - DVB ）小球 和聚合單體如CIM RP - SDVB片（BIA分離，Ljublijana，前蘇聯(lián)）和Swift柱 子( Isco , Lincoln , Nebraska , 美國)能耐寬的pH范圍(通常pH1113或有時(shí) pH014 ),但使用者用強(qiáng)有機(jī)溶劑沖洗柱子時(shí)要注意。由其交聯(lián)度決定，當(dāng)柱 子用某些有機(jī)溶劑沖洗時(shí)就會(huì)膨脹或收縮。高于8 10%交聯(lián)度的聚合物通常有較好的機(jī)械性能在水溶液中收縮很少在有機(jī)溶劑中膨脹也不大。用一系列溶劑洗 聚合柱子之前最好能咨詢生產(chǎn)者或技術(shù)支撐部門。根據(jù)BIA分離，使用者可以再生聚合PS - DVB整體柱通過下面的方法：含

18、0.1%三氟乙酸的2 -丙醇在一半工作流速下沖洗10個(gè)柱體積以上100%流動(dòng)相B在工作流速一半的條件下沖洗5個(gè)柱體積以上用100%流動(dòng)相A在工作流速下至少平衡10個(gè)體積以上如果要含有丁基和乙基化學(xué)物質(zhì)甲基丙烯酸酯基質(zhì)的整體柱要清洗，沉淀的 蛋白質(zhì)可以通過按順序反向沖洗10個(gè)柱體積的1.0M氫氧化鈉、水、20%乙醇 溶液和工作緩沖液來清除。如果有很多疏水蛋白質(zhì)，使用者應(yīng)該在水以后插入一 個(gè)30%異丙醇或70%乙醇的步驟。如果要清洗或滅活微生物菌落，PS - DVB可以用0.5 1.0M的氫氧化鈉完全 清洗。整體柱在室溫下至少要用氫氧化鈉洗一個(gè)小時(shí)。用傳統(tǒng)聚合基質(zhì)裝填的柱子來分離一些溶解度很小的蛋白質(zhì)如膜蛋白、結(jié)構(gòu) 蛋白、和病毒外殼蛋白等需要用較強(qiáng)的清洗條件。例如含3M鹽酸胍的50%異 丙醇溶液在60。才能把這些蛋白質(zhì)除去。在固相樹脂中去除合成肽能產(chǎn)生重新激活被苯甲醚和苯硫基甲烷清除的正離 子。清除正離子反應(yīng)產(chǎn)生了大的芳香族分子，這些芳香族分子會(huì)在肽純化時(shí)污染 柱子。這種污染物在C18柱子上有非常高的保留沒法被100%的甲醇或乙晴洗出。 要清洗這類柱子，必須把柱子反向用5體積100%異丙醇，三到五個(gè)體積二氯甲烷，然后三到五體積異丙醇，最后到初始溶劑系統(tǒng)。芳香族不純物的洗脫可以通 過260nm紫外檢測。氧化鋯基質(zhì)HPLC柱子的再生ZirChrom Sep