論小麥高分子量谷蛋白14亞基(HMWGS14)基因的原核表達課件

1、論小麥高分子量谷蛋白14亞基(HMWGS14)基因的原核表達課件論小麥高分子量谷蛋白14亞基(HMWGS14)基因的原核表達小麥高分子量谷蛋白14亞基（HMW-GS14）基因的原核表達 摘要關鍵詞前言材料與方法結(jié)果與分析討論結(jié)論參考文獻致謝小麥高分子量谷蛋白14亞基（HMW-GS14）基因的原核表摘要 用限制性內(nèi)切酶 EcoR和Sal雙酶切pMDHMW,回收長約2.2kb的高分子量谷蛋白14亞基（HMW-GS14）基因，將其亞克隆到表達載體pET-30a(+)的相應位點上，構(gòu)建了該基因的原核表達載體pET-HMW 。SDS分析結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導，高分子量谷蛋白14亞基(HMW-GS14)

2、基因在大腸桿 Rosetta(DE3)pLysS中得到了表達。 摘要 用限制性內(nèi)切酶 EcoR和Sal雙酶切pAbstract After slicing the pMD-HMW with two restriction endonucleases EcoRand Sal,recollect the high molecular weight glutenin subunit 14(HMW-GS14) gene which is about 2.2kb in length, then subclone it into the relative site of the expression ve

3、ctor pET-30a(+),and eventually the prokaryotic expression vector pET-HMW is constructed . The analysis result of SDSshows that after induction of IPTG, the high molecular weight glutenin subunit 14 (HMW-GS14) gene is expressed in the E.coli Rosetta(DE3)pLysS Abstract After slicing the p關鍵詞高分子量谷蛋白14亞

4、基基因 原核表達 亞克隆 關鍵詞高分子量谷蛋白14亞基基因 Keywords HMW-GS14 gene prokaryotic expression subclone Keywords HMW-GS14 gene 前言 小麥是最重要、種植面積最廣的糧食作物之一。由于高產(chǎn)量新品種的選育推廣、耕作栽培技術的提高及農(nóng)業(yè)投入的增加，我國小麥產(chǎn)量不斷提高，數(shù)量上暫時告別短缺。然而，隨著社會飲食業(yè)、旅游業(yè)的發(fā)展和人民生活水平的提高，以小麥面粉為原料的各種精致面食和方便食品、保健食品及營養(yǎng)食品的生產(chǎn)增長很快，使得全國各地對小麥特別是優(yōu)質(zhì)小麥的需求，呈現(xiàn)不斷增長的勢頭，并對小麥的品質(zhì)提出了更高的要求。 前言

5、 小麥是最重要、種植面積最廣的糧食作物之一。由于高 小麥的加工品質(zhì)與小麥種子中麥谷蛋白及醇溶蛋白的含量和組成關系極為密切，高分子量麥谷蛋白與加工品質(zhì)之間的關系已通過遺傳、分子結(jié)構(gòu)分析、顯微電鏡等方法得以闡明。在不同高分子量麥谷蛋白亞基對加工品質(zhì)的貢獻的研究中,發(fā)現(xiàn)5+10亞基為優(yōu)質(zhì)亞基，而2+12亞基為劣質(zhì)亞基。然而我國的一些優(yōu)質(zhì)小麥品種如小偃6號（亞基組成為1，14+15，2+12）等缺乏5+10，而且具有被認為是劣質(zhì)的2+12亞基。分析結(jié)果表明，導致其優(yōu)質(zhì)的原因在于其所具有的14+15亞基，14+15亞基具有5+10亞基的功能 。因此，研究14+15亞基功能對于從分子水平上改良小麥品質(zhì)具有

6、重要意義。 小麥的加工品質(zhì)與小麥種子中麥谷蛋白及醇溶蛋白的 本研究擬在以前的工作基礎上，構(gòu)建高分子量谷蛋白14亞基（HMW-GS14）基因的原核表達載體，并實現(xiàn)其在大腸桿菌表達宿主菌株Rosetta(DE3)pLysS中的特異表達，為進一步純化HMW-GS14及研究其功能、性質(zhì)奠定基礎。 本研究擬在以前的工作基礎上，構(gòu)建高分子量谷蛋白14材料與方法 （一）材料 （二）方法 材料與方法 （一）材料 （一）材料 1.菌株和質(zhì)粒： 大腸桿菌JM109菌株、 Rosetta(DE3)pLysS菌株、含HMW-GS14基因的重組質(zhì)粒pMD-HMW以及原核表達載體pET30a(+)均為本實驗室提供。 2.

7、酶與試劑：限制性內(nèi)切酶EcoR和Sal購自大連寶生物工程有限公司，凝膠回收試劑盒購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司，T4DNA ligase購自Promega公司，其他酶與試劑均為本實驗室常規(guī)儲備。（一）材料 1.菌株和質(zhì)粒： 大腸桿菌JM109菌株、 （二）方法 1. pMD-HMW的提取 2. pMD-HMW的酶切鑒定3. 連接反應 4. 感受態(tài)細胞的制備 5. 轉(zhuǎn)化 6. 菌落PCR 7. 重組表達質(zhì)粒pET-HMW的提取與酶切鑒定 8. 重組表達質(zhì)粒pET-HMW轉(zhuǎn)化表達宿主菌 9. 誘導表達及SDS分析 （二）方法 1. pMD-HMW的提取 1. pMD-HMW的提取 挑取含有重組質(zhì)粒p

8、MD-HMW的單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中（含氨卞青霉素 100ug/ml）,于37，180rpm振搖培養(yǎng)1214h。 含有原核表達載體pET-30a(+)的單菌落（卡那霉素 50ug/ml）做相同處理。 然后按照“SDS堿裂解法”小量制備質(zhì)粒pMD-HMW和pET30a（+）。 1. pMD-HMW的提取 挑取含有重組質(zhì)粒pMD-HMW的2. pMD-HMW的酶切鑒定 用限制性內(nèi)切酶 EcoR和Sal雙酶切重組質(zhì)粒pMD-HMW。在20ul酶切體系中，加入10ul pMD-HMW、2ul 10buffer、1ul EcoR、1ul Sal和6ul ddH2O。置于37水浴中,酶切2

9、3h。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。 2. pMD-HMW的酶切鑒定 用限制性內(nèi)切酶 EcoR和3. 連接反應 重組質(zhì)粒pMD-HMW用限制性內(nèi)切酶 EcoR和Sal雙酶切處理，回收HMW-GS14基因（長約2.2kb），同時原核表達載體pET-30a(+)也用EcoR和Sal雙酶切處理。將酶切處理后的pET-30a(+)和回收的HMW-GS14基因進行連接。20ul連接反應體系：ddH2O 4ul、目的基因片斷 10ul、原核表達載體 3ul、10buffer 2ul、T4DNA ligase 1ul。于16，過夜連接。連接產(chǎn)物可以暫存于-40備用。 3. 連接反應 重組質(zhì)粒pMD-HMW

10、用限制性內(nèi)切酶 Eco 4.感受態(tài)細胞的制備 挑取大腸桿菌JM109單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中；37，180rpm,振搖培養(yǎng)1214h；吸取1ml過夜菌液, 轉(zhuǎn)入50ml新鮮LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，條件同上；約23個小時（OD值約為0.4左右）后，將菌液轉(zhuǎn)移到冰預冷的50ml聚丙烯管中，冰浴10min，使細胞冷卻至0；4，4100rpm，離心10min，棄上清，并盡可能吸干；用10ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2，重懸沉淀；4，4100rpm，離心10min，棄盡上清；最后，用2ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2 （含15%的甘油），重懸沉淀。將制備的感受態(tài)細胞分裝

11、至1.5ml的微量離心管中，每管200ul。-80保存，也可以直接用于轉(zhuǎn)化。大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS菌株做同樣處理，制備感受態(tài)細胞。 4.感受態(tài)細胞的制備 挑取大腸桿菌JM109單菌落，接種5.轉(zhuǎn)化 吸取5ul連接反應產(chǎn)物，加入到含200ul JM109感受態(tài)細胞的微量離心管中，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰浴30min；42，熱激90sec（勿搖動離心管）后，立即將管轉(zhuǎn)入冰浴，使細胞冷卻12min；加入800ul LB液體培養(yǎng)基， 37，180rpm，振搖培養(yǎng)1h，使菌復蘇；吸取適當體積（80ul）的已轉(zhuǎn)化細胞，均勻地涂布到LB固體培養(yǎng)基上（含卡那霉素 50ug/ml）；37，倒

12、置培養(yǎng)1214h。 5.轉(zhuǎn)化 吸取5ul連接反應產(chǎn)物，加入到含200ul JM16. 菌落PCR 從5.步涂布的平板上，隨即挑取數(shù)個或數(shù)十個單菌落，將其一部分進行菌落PCR，以篩選陽性克??；對應部分轉(zhuǎn)印至新的平板上（含卡那霉素 50ug/ml），37，倒置培養(yǎng)1216h。在10ul總反應體積中，加入ddH2O 7ul、10buffer 1ul、引物P014和P024各0.3ul（濃度為0.5 mmol/L）、甘油1ul以及Taq DNA聚合酶0.4ul（1U），進行PCR擴增。PCR程序為：95預變性5min、95變性50sec、55退火50sec、72延伸30sec、72延伸10min、4

13、forever。共25個循環(huán)。1.0瓊脂糖凝膠電泳觀察記錄結(jié)果，篩選出陽性克?。ê亟M表達質(zhì)粒pET-HMW）。 6. 菌落PCR 從5.步涂布的平板上，隨即挑取數(shù)個或數(shù)十個 7.重組表達質(zhì)粒pET-HMW的提取 與酶切鑒定 同步驟2.小量制備重組表達質(zhì)粒pET-HMW做EcoR和Sal雙酶切處理，1.0瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切結(jié)果。 7.重組表達質(zhì)粒pET-HMW的提取 與酶切鑒8.重組表達質(zhì)粒pET-HMW轉(zhuǎn)化 表達宿主菌 將鑒定好的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)pLysS感受態(tài)細胞，操作方法如5.所述。將適當體積的已轉(zhuǎn)化細胞均勻地涂布在平板上（含卡那霉素 50ug/ml、氨卞青

14、霉素 25ug/ml），37，倒置培養(yǎng)1214h。 8.重組表達質(zhì)粒pET-HMW轉(zhuǎn)化 表達宿主菌 9.誘導表達及SDS分析 挑取含重組表達質(zhì)粒pET-HMW的陽性單克隆，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中（含Kan 50ug/ml、Cm 25ug/ml），于37，180rpm振搖培養(yǎng)1214h；按1：100稀釋加入到5ml LB液體培養(yǎng)基中（含Kan 50ug/ml、Cm 25ug/ml）；振搖培養(yǎng)至OD600值為0.5左右，加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L；繼續(xù)于37振搖培養(yǎng)45h。 12000rpm，離心30sec,收集菌體；加入1SDS loading buffer【50mM Tr

15、isCl(pH6.8)、100mM DTT、2SDS、0.1溴酚蘭、10甘油】重懸沉淀；煮沸10min，12000rpm，離心5min，取上清，置于4備用。將誘導產(chǎn)物經(jīng)SDS（凝膠配置如表1）分析，用考馬斯亮藍R250染色6h左右；然后，先用高甲醇脫色液脫色12h，再用低甲醇脫色液脫色至背景清晰為止。9.誘導表達及SDS分析 挑取含重組表達質(zhì)粒pET表1 聚丙烯酰胺凝膠制備 返回表1 聚丙烯酰胺凝膠制備 返回結(jié)果與分析 （一）重組質(zhì)粒pMDHMW的酶切鑒定 （二）菌落PCR （三）重組表達質(zhì)粒pET-HMW的雙酶切鑒定 （四）表達產(chǎn)物的SDS分析 結(jié)果與分析 （一）重組質(zhì)粒pMDHMW的酶切鑒

16、定 （一）重組質(zhì)粒pMDHMW的酶切鑒定 重組質(zhì)粒pMDHMW經(jīng)EcoR和Sal雙酶切處理后，進行1瓊脂糖凝膠電泳檢測，重組質(zhì)粒pMDHMW理論上應切出兩條帶，分別為HMW-GS14基因（長約2.2kb）以及空克隆載體pMD18（長約2.7kb）。 （一）重組質(zhì)粒pMDHMW的酶切鑒定 重組質(zhì)粒pMD（二）菌落PCR EcoR和Sal雙酶切處理后的pET-30a(+)和回收的HMW-GS14基因進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達宿主菌Rosetta(DE3)pLysS 后，用引物P014、P024進行菌落PCR。陽性克隆能擴增出長約400bp的片段。 （二）菌落PCR EcoR和Sal雙酶切處

17、理后的pET-（三）重組表達質(zhì)粒pET-HMW的雙酶切鑒定 重組表達質(zhì)粒pET-HMW理論上應切出兩條帶，分別為HMW-GS14基因（長約2.2kb）和空載體pET30a (+)（長約5.4kb）。 （三）重組表達質(zhì)粒pET-HMW的雙酶切鑒定 重組表達質(zhì)粒p（四）表達產(chǎn)物的SDS分析 將重組表達載體pET-HMW轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)pLysS,并進行誘導表達。取15ul上樣，SDS后，考馬斯亮藍R250染色結(jié)果表明：經(jīng)IPTG誘導，含有重組表達質(zhì)粒pET-HMW的菌株可特異地產(chǎn)生一條與HMW-GS14分子量相當?shù)牡鞍讞l帶。取誘導的空載體pET30a (+)和未誘導的pET-H

18、MW做對照；小偃6號做Marker，含14亞基。 返回（四）表達產(chǎn)物的SDS分析 將重組表達載體pE討 論 大腸桿菌表達宿主菌株Rosetta(DE3)pLysS是T7 RNA聚合酶/啟動子表達系統(tǒng)。其染色體上，帶有一拷貝由lacUV5啟動子控制的T7 RNA聚合酶基因,這類菌株能配合pET載體一起表達。pLysS是帶有可以與pET共存的、編碼T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的質(zhì)粒。Rosetta(DE3)pLysS菌株在被誘導前，T7 RNA聚合酶的基礎表達被抑制，這樣可以使重組體（表達外源蛋白，可能會影響宿主細胞的生長和活力）在宿主中更穩(wěn)定。 討 論 pET系列載體是含有T7噬

19、菌體啟動子的表達載體。在這類載體中，外源基因的表達是受T7噬菌體RNA聚合酶調(diào)控的，這類載體是Studier等于1990年首先構(gòu)建的，后來得到很大發(fā)展。它們的典型特點就是帶有pBR322的大腸菌素E1（colE1）復制區(qū)，從而賦予宿主氨卞青霉素或卡那霉素抗性。在這些載體中，編碼序列在多克隆位點插入，置于天然T7RNA聚合酶啟動子的控制之下。 基因在T7RNA聚合酶控制下的表達,與依賴大腸桿菌RNA聚合酶表達系統(tǒng)相比,有許多優(yōu)越之處:首先T7RNA聚合酶合成RNA的速度數(shù)倍于大腸桿菌RNA聚合酶,并較少發(fā)生轉(zhuǎn)錄的終止；第二, T7RNA聚合酶只識別自己的啟動序列,不能啟動大腸桿菌DNA任何序列的

20、轉(zhuǎn)錄；最后, T7RNA聚合酶對抑制大腸桿菌RNA聚合酶的抗生素(如利福平等)有抗性,可使T7RNA噬菌體啟動子(PT7)控制下的基因得到充分表達。在適宜的條件下, T7RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)表達的基因產(chǎn)物可占細胞總蛋白的25%以上，但多數(shù)情況下產(chǎn)量比這個比例要低得多。 pET系列載體是含有T7噬菌體啟動子的表達載體。在這類載體 本研究中，HMW-GS14的表達量較低。其原因可能是：一、目的基因是真核基因，在原核表達系統(tǒng)中存在稀有密碼子的問題，譬如密碼子的偏愛性等。二、HMW-GS14分子量高達89KD，可能會對宿主細胞產(chǎn)生一定的毒性，影響宿主細胞的生長和活力。三、在大腸桿菌中表達外源蛋白，

21、尤其是真核蛋白時，穩(wěn)定性是經(jīng)常遇到的問題；本實驗中表達出來的HMW-GS14，可能部分發(fā)生酶解或降解。四、培養(yǎng)溫度對外源蛋白的表達可能也有影響：不同的蛋白對溫度的要求不同，有些蛋白對溫度的變化很敏感；而另外一些，溫度對其的影響不大甚至沒有影響。五、IPTG加入的時機（即OD值）、終濃度以及誘導時間對表達也有影響：一般要在細菌達到一定的豐度（達對數(shù)生長期或穩(wěn)定期）時，進行誘導，以獲得較大量的外源表達；另外，IPTG對宿主細胞有一定的毒性，所以要在不影響表達的前提下，盡量降低IPTG的濃度；還有誘導時間的問題，表達和降解達到平衡時為最佳，時間過短或過長均會使目的蛋白的量降低。不同的蛋白對這些條件的

22、要求不同，這需要在實驗中具體地去摸索。 本研究中，HMW-GS14的表達量較低。其原因可能是：一 功能驗證需要一定量的、較純的HMW-GS14，所以，HMW-GS14的優(yōu)化表達還需要進一步的探索。 返回 功能驗證需要一定量的、較純的HMW-GS14，所以，HMW結(jié) 論 成功構(gòu)建了高分子量谷蛋白14亞基（HMW-GS14）基因的原核表達載體pET-HMW；HMW-GS14基因在大腸桿菌表達宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中得到了特異表達。 結(jié) 論 成功構(gòu)建了高分子量谷蛋白14亞基（HMW-GS14參考文獻 鄧志英，田紀春.小麥儲藏蛋白已小麥品質(zhì)行狀的關系及研究進展.生命科學學報.2003

23、，4（15）：233236. Y.Wan D.Wang, P.R.Shewry N.G.Halford(2002) Isolation and characerization of five novel high molecular weight subunit of glutenin genes from Triticum and Aegilops cylindrical. Theor Appl Genet 104:829839 Halford NG, Field JM, Blair H, Urwin P, Moore K, Robert L, Thompsom R, Flavell RB,

24、 Tatham AS, Shewwwry RP(1992) Analysis of HMW glutenin subunits encoded by chromosome 1A of breed wheat indicates quantitative effects on grain quality. Theor Appl Genet 83:373378 Johansson E, Svensson G(1995).Contribution of the high molecular weight glutenin subunit 21* to breadmaking quality of S

25、wedish wheats. Cereal Chem 72:287290 Studier FW(1991) Use of bacteriophage-T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol 219:3744 Olind.Anderson, Josephc.Kuhl, Angie Tam(1996).Construction and expression of a synthetic wheat storage protein gene. Gene 174:5158 王瑞、寧錕. 一些優(yōu)質(zhì)小麥及其雜種