輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析

1、輔助生殖試驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析 劉平 黃錦 北京大學第三醫(yī)院輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第1頁背景介紹試驗室工作是決定ART成敗關(guān)鍵步驟各試驗室間：形態(tài)學分級標準不一致、操作步驟和時間點不一致、培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)環(huán)境不一致、采取技術(shù)不一致等等，很多造成極難比較各試驗室結(jié)果，也不利于取得ART良好結(jié)局綜述國際領(lǐng)域ART試驗室相關(guān)共識輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第2頁背景介紹, Revised guidelines for good practice in IVF年, Consensus on embryo assessment(Istanbul ) 年, ESHRE- em

2、bryology guideline for diagnosis 年,Current issues in medically ART and genetics 年, ACE consensus meeting report 年, ESHRE task force on ethics and law22輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第3頁背景介紹卵母細胞及胚胎形態(tài)學受精卵和胚胎觀察時間點非男性原因ICSI輔助孵化囊胚培養(yǎng)PGD/PGS實時觀察系統(tǒng)（Time-lapse imaging）統(tǒng)一命名培養(yǎng)液系統(tǒng)、培養(yǎng)環(huán)境輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第4頁形態(tài)學共識由 Alpha 和 E

3、SHRE 兩個學術(shù)團體胚胎學教授達成共識2月，土耳其，伊斯坦布爾此共識在年Hum Reprod, 和RBM Online同時發(fā)表這是首次由教授組推薦卵和胚胎評分共識，而且將會定時進行更新本共識僅為對卵和胚胎形態(tài)最基本描述形態(tài)評分形成國際共識有利于在“臨床試驗”中，將胚胎形態(tài)作為觀察指標，評定IVF相關(guān)新技術(shù)和新產(chǎn)品本共識不限制各試驗室做更細致形態(tài)描述和觀察統(tǒng)計，換言之，全部ART試驗室最少應(yīng)該能提供本共識所要求形態(tài)觀察內(nèi)容Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第5頁形態(tài)學共識應(yīng)該提醒，延長對卵和胚胎觀察時間會對胚胎發(fā)育潛能有不利影響相關(guān)從業(yè)人員在擬使用那些還未確定實際價

4、值其它觀察伎倆時，必須先考慮其代價和是否獲益全部觀察必須遵照標準是將對胚胎發(fā)育有不利影響風險降低到最小Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第6頁對受精卵和胚胎觀察時間點共識 類 型 時 間 胚胎發(fā)育階段以D0 2PM 受精為例受精檢驗 17 1原核階段D1: 6-8AM受精卵檢驗23 1約50%處于原核期， 20% 處于兩細胞期D1: 1-3PM早期卵裂檢驗26 1 ICSI28 1 IVF2-細胞期D1: 3-5PM ICSID1: 5-7PM IVFDay 2 胚胎評定44 14-細胞期D2: 9-11AMDay 3 胚胎評定68 18-細胞期D3: 9-11AM

5、Day 4 胚胎評定92 1桑葚胚期D4: 9-11AMDay 5 胚胎評定116 1囊胚期D5: 9-11AMIstanbul 共識，*觀察時間點輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第7頁卵母細胞形態(tài)學共識卵評分： 正常卵母細胞應(yīng)該是由一個均一透明帶、沒有包含物透明或半透明狀細胞質(zhì)和一個大小適當極體所組成球形結(jié)構(gòu)。 “好卵形態(tài)”: 圓形結(jié)構(gòu),透明帶均質(zhì),胞質(zhì)均勻，不包含其它結(jié)構(gòu), 第一極體大小適當 卵母細胞成熟包含細胞核和細胞質(zhì)成熟。COC 評分： 擴張卵丘和放射冠形成透明帶評分： 當前沒有足夠證據(jù)表明測量透明帶厚度含有尤其意義 透明帶情況因人而異，對于特殊患者，關(guān)注其透明帶厚度和顏色Is

6、tanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第8頁卵母細胞形態(tài)學共識卵周間隙 卵周隙中內(nèi)含物需要引發(fā)重視，不過沒有必要去統(tǒng)計或測量它們 當前認為除非卵周隙非常大，普通情況下沒有必要過多關(guān)注極體評分 假如極體有異常大，不主張用于受精,非整倍體風險高胞質(zhì)評分 granularity:異常結(jié)構(gòu)，調(diào)整顯微鏡下可見 clustering：任意顯微鏡下均可見，低著床率 sER disks：異常結(jié)構(gòu)，能夠不用做受精；提議統(tǒng)計是單一還是數(shù)個sER胞質(zhì)中空泡 注意有沒有較大空泡(14 um in diameter)，低囊胚形成率 Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第9頁

7、卵母細胞形態(tài)學共識Human Reproduction Update, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第10頁受精檢驗及原核評分原核檢驗和受精觀察同時進行原核評分共識: 評分等級描述1對稱Z1 和 Z2 同等對稱2非對稱其它分布, 包含位于周圍 3不正常0 或 1 NPBIstanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第11頁卵裂期胚胎評定 (Days 2 and 3)分裂球細胞數(shù) 取決于“授精”后時間(小時) Day 2： 4 細胞； Day 3：8 細胞 卵裂速度過快或過慢胚胎，著床能力均下降 注意：胚胎培養(yǎng)體系有可能影響卵裂速度碎片形成 輕度 (25%)多核分裂球形

8、成 D2觀察； 多核胚胎：著床能力下降，染色體異常機率增多，自然流產(chǎn)機率增加其它形態(tài)特征 細胞質(zhì)中顆粒度、細胞膜外觀、液泡、卵裂球3D分布等等Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第12頁分裂球期胚胎評分系統(tǒng)共識（不包含分裂球數(shù)目）Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第13頁Day 4 桑葚胚期評定胚胎致密化進入第四個分裂階段假如有超出二分之一卵裂球沒有融進去，此胚胎預(yù)后不好Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第14頁 將Gardner囊胚評分體系數(shù)字化Day 5 囊胚期評定等級評定描述1早期2囊泡期3擴張期4孵化期I

9、CM1優(yōu)突出，輕易分辨，細胞多而相互結(jié)合，結(jié)協(xié)力強。ICM2中輕易分辨，細胞少而渙散ICM3差難以分辨，極少細胞TE1優(yōu)很多細胞形成一個致密上皮細胞層TE2中極少細胞形成一個渙散上皮細胞層TE3差極少細胞Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第15頁“失去發(fā)育能力胚胎”定義和共識胚胎24h內(nèi)發(fā)育停滯或全部細胞發(fā)生退化和溶解Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第16頁Istanbul 共識小結(jié)希望本共識能成為全世界胚胎學家描述卵和胚胎形態(tài)“通用語言”可以了解和允許某些實驗室沿用其他一些胚胎形態(tài)評分，假如這個評分不影響發(fā)展軌跡以上有關(guān)共識進展可認為

10、未來提供預(yù)后指標參數(shù)，鼓勵使用同時，利用此形態(tài)共識可在發(fā)表文章時可簡化形態(tài)描述隨著參考新版本胚胎圖譜，將促進對日常所見形態(tài)變化了解，進而改善病人結(jié)局Istanbul 共識，輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第17頁IVM卵母細胞當前對于卵母細胞搜集最正確時間沒有確定標準，大多數(shù)研究采取優(yōu)勢卵泡直接到達10mm優(yōu)勢卵泡直徑大于13 mm 獲取卵母細胞數(shù)目將會降低，這與內(nèi)源性FSH支持降低后非優(yōu)勢卵泡閉鎖相關(guān)一些操作要求子宮內(nèi)膜厚度大于5 mm ，但這不是一條必須要求卵母細胞體外培養(yǎng)最正確體系當前還沒有統(tǒng)一共識培養(yǎng)基中需要有丙酮酸、必需和非必需氨基酸，如組織培養(yǎng)液ASRM committee

11、opinion, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第18頁IVM卵母細胞卵母細胞成熟動力學卵巢良性腫瘤手術(shù)取得卵母細胞，體外培養(yǎng)0小時：均為GV28.5-31小時：60%為MI，仍無M43-46小時：M占50%50-52小時：M占80%ASRM committee opinion, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第19頁IVM卵母細胞IVM適應(yīng)證：OHSS風險，PCOS或者卵巢PCO改變授精方式：ICSI并非必須應(yīng)該通知患者：與標準IVF相比較，IVM著床率、妊娠率均低于標準IVFASRM committee opinion, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第20頁非男性

12、原因ICSI現(xiàn)實狀況：不明原因不孕卵子質(zhì)量欠佳卵子數(shù)目少高齡女性前次授精失敗全部IVF周期全部采取ICSIPGD/PGS周期IVM周期解凍卵子周期ASRM committee opinion, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第21頁非男性原因ICSI小結(jié)：對于男性原因不育，ICSI是一個非常有效治療辦法前次IVF授精失敗或受精率低患者，采取ICSI能夠提升受精率不明原因不孕患者，采取ICSI不會改進臨床結(jié)局獲卵數(shù)少或者女方高齡周期，采取ICSI不會改進臨床結(jié)局全部患者都采取ICSI能夠防止授精失敗發(fā)生，不過大約每30例無需ICSI患者，才會防止1例授精失敗對于IVF或者常規(guī)受精失敗患者

13、,即使是與卵巢功效差相關(guān),ICSI也能夠提升受精率PGD/PGS、IVM、解凍卵周期中，能夠采取ICSI總結(jié)：非男性原因不孕周期無需常規(guī)采取ICSIPGD/PGS、IVM、解凍卵周期，采取ICSI，患者會從中受益非男性原因進行ICSI，需要考慮技術(shù)安全性與花費ASRM committee opinion, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第22頁輔助孵化Medline, 1966 to October 1. (Assisted OR zona hatching OR drilling OR thinning) AND (pregnancy OR implantation OR live

14、birth) AND blastocyst 2. Assisted hatching AND IVF (Humans Mesh AND English lang)證據(jù)強弱分級 A級：支持或反對該提議證據(jù)強有力 B級：支持或反對該提議證據(jù)中等強度 C級：沒有足夠證據(jù)來支持或反對該提議ASRM guideline, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第23頁輔助孵化輔助孵化方法： 化學法（Tyrodes酸法、蛋白水解酶法）、激光法、機械法小結(jié)：沒有足夠證據(jù)顯示輔助孵化能夠提升分娩率（證據(jù)C級）對于一些預(yù)后較差患者（既往IVF失敗史或預(yù)期結(jié)局不佳），輔助孵化能夠輕微地提升臨床妊娠率（證據(jù)A級）輔

15、助孵化造成多胎妊娠增加（證據(jù)A級），不過沒有證據(jù)顯示輔助孵化與單卵雙胎相關(guān)（證據(jù)C級）對全部預(yù)后不良患者都提議輔助孵化，為時尚早ASRM guideline, 提議：不應(yīng)該對全部進行IVF患者都常規(guī)實施輔助孵化！輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第24頁囊胚培養(yǎng)此處囊胚培養(yǎng)不包含PGD/PGS用途囊胚培養(yǎng)序貫培養(yǎng)、單一培養(yǎng)囊胚冷凍： 玻璃化冷凍囊胚培養(yǎng)對子代影響 多胎、性別、表觀遺傳學囊胚培養(yǎng)對試驗室要求： 場地、設(shè)施、人員、低氧培養(yǎng)環(huán)境ASRM committee opinion, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第25頁囊胚培養(yǎng)小結(jié)仍有必要建立確認胚胎能夠發(fā)育成囊胚標準對于“預(yù)后

16、良好”患者，移植多枚囊胚會造成多胎妊娠在非特定人群中，囊胚移植并沒有比卵裂期移植增加活產(chǎn)率在“預(yù)后較差”患者中，囊胚移植也沒有比卵裂期移植增加活產(chǎn)率囊胚培養(yǎng)周期中可用于冷凍胚胎數(shù)目降低盡管數(shù)據(jù)尚存爭議，不過囊胚移植周期中單卵雙胎百分比輕度增高囊胚培養(yǎng)輕微增加了子代安全性風險，盡管二者因果關(guān)系還未被證實ASRM committee opinion, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第26頁囊胚培養(yǎng)結(jié)論：在“預(yù)后良好”患者中，支持囊胚移植；采取單囊胚移植能夠降低多胎妊娠發(fā)生率在“預(yù)后較差”或者非特定患者中，囊胚移植妊娠率、活產(chǎn)率與卵裂期移植并無差異；在這些人群中，假如采取囊胚移植，沒有胚胎移

17、植或可移植胚胎數(shù)目降低風險相對高于卵裂期移植ASRM committee opinion, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第27頁PGD/PGS基因芯片、二代測序等技術(shù)促進PGD/PGS發(fā)展ESHRE PGD指南， Hum Reprod, Fertil Steril, PGS:一個有效挑選胚胎方法PGS:卵裂球+FISH方法逐步淘汰，更趨于滋養(yǎng)層活檢+基因芯片/二代測序Fertil Steril, ; ESHRE, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第28頁Time-lapse imaging實時觀察系統(tǒng)非侵入性胚胎挑選方法雖未廣泛使用，不過越來越受到關(guān)注歐洲7個使用Time-la

18、pse中心共同提出統(tǒng)一命名依據(jù)：-會議資料命名指南, Hum Rrprod, 輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第29頁Time-lapse imaging時間定義t0IVF受精時間或ICSI/IMSI操作中間時間tPB2第二極體完全排出時間tPN確認受精時間tPNa原核出現(xiàn)時間點；tPN1a, tPN2a, tPN3a tPNf原核消失時間點；tPN1f, tPN2f tZ原核評分時間t2 to t92細胞到9細胞出現(xiàn)時間tSC最初出現(xiàn)融合時間tMf/p融合結(jié)束時間（出現(xiàn)囊腔前）（f: 完全融合，p：部分融合）tSB囊胚開始形成時間tByz囊胚完全形成時間（透明帶變薄之前時間）（y：內(nèi)細

19、胞團；z：滋養(yǎng)層細胞）tEyz開始擴張時間，透明帶開始變薄最初時間tHNyz擴張胚結(jié)束，開始孵化時間tHDyz囊胚完全孵出時間命名指南, Hum Rrprod, online輔助生殖實驗室技術(shù)應(yīng)用相關(guān)國際共識解析第30頁Time-lapse imaging命名指南, Hum Rrprod, online命名計算公式動態(tài)改變VPtPNf-tPNaPN連續(xù)時間ECC1t2 -tPB2第一次細胞分裂連續(xù)時間ECC2t4 -t2 cc2a=t3-t2 cc2b=t4-t2第二次細胞分裂連續(xù)時間ECC3t8 t4 cc3a=t5-t4 cc3b=t6-t4 cc3c=t7-t4 cc3d=t8-t4第三次細胞分裂連續(xù)時間S2t4 t3 細胞分裂同時化S3t8 t5 分裂模式同時化docmtMf-tSC