木質(zhì)素生物降解的研究進(jìn)展

1、木質(zhì)素生物降解的最新研究進(jìn)展潘明鳳 a 姜曼b 周祚萬(wàn)a西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031b材料先進(jìn)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院成都 610031摘要 木質(zhì)素廣泛存在于幾乎所有的植物類生物質(zhì)材料中，利用微生物降解木質(zhì)素不僅可以緩解環(huán)境污 染，還可以變廢為寶，實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)利用。本文對(duì)降解木質(zhì)素的微生物種類、木質(zhì)素降解酶的理化性質(zhì) 和作用機(jī)理、營(yíng)養(yǎng)調(diào)控等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為木質(zhì)素生物降解法的深入研究提供參考。 關(guān)鍵詞 木質(zhì)素生物降解 木質(zhì)素降解酶 營(yíng)養(yǎng)調(diào)控The nearest research advances in Biodegradati

2、on of LigninPan Mingfeng a, Jiang Manb, Zhou Zuowan b(aCollege of Life Scienee and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610031;bKey Laboratory of Advanced Materials Technology, Ministry of Education, Chengdu 610031;College of Materials Science and Engineering, Southwest Jiaotong Unive

3、rsity, Chengdu 610031)Abstract Lignin, a resistant cell-wall constituent of all vascular plants, is the second most abundant organic substance on earth. Biodegradation of lignin could not only alleviate pollution but also can turn “ waste i”nto wealth as well as realize resource recycling. Research

4、advances in biodegradation of lignin, including: microorganisms, physical and chemical characteristics of the lignin-degrading enzymes ， degradation mechanism and the nutrition regulations have been reviewed in this paper for purpose of development and application of lignin bio- degradationKey words

5、lignin; Biodegradation; Lignin-degrading enzymes; nutrition regulations0 前言木質(zhì)素廣泛存在于幾乎所有的植物類生物質(zhì)材料中，是植物細(xì)胞壁的重要組成部分，在自然界中的產(chǎn) 量?jī)H次于纖維素是一種極具潛力的可再生資源 1,2。同時(shí)，其分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，自然降解速度緩慢，成 為地球生物圈中碳循環(huán)的主要障礙之一。木質(zhì)素是由苯丙烷單元通過(guò)醚鍵和碳碳鍵連接而成的聚酚類三維 網(wǎng)狀高分子化合物，研究證實(shí)共有三種基本結(jié)構(gòu)單元 （非縮合型結(jié)構(gòu) ） ，即愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)、紫丁香基結(jié)構(gòu)和 對(duì)羥苯基結(jié)構(gòu)。從 20世紀(jì)開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直在尋找降解木質(zhì)纖維

6、素的最佳途徑，涉及的研究主要包括：物理法、化學(xué)法、物理化學(xué)法、生物降解法。而利用微生物降解木質(zhì)素不僅可以緩解環(huán)境污染，還可 以變廢為寶，實(shí)現(xiàn)資源再利用，已引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注 4-7。鑒于可再生資源循環(huán)利用的重大現(xiàn)實(shí)意義， 我們就微生物降解木質(zhì)素的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，特別關(guān)注了降解木質(zhì)素的微生物種類、木質(zhì)素降解酶 系的理化性質(zhì)和作用機(jī)理、木質(zhì)素降解酶的活性調(diào)控等熱點(diǎn)學(xué)術(shù)問(wèn)題。可降解木質(zhì)素的微生物種類自然界中，木質(zhì)素的完全降解是真菌、細(xì)菌、放線菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果，其中真菌起 著主導(dǎo)作用，放線菌降解能力次之，細(xì)菌降解能力最弱。降解木質(zhì)素的真菌主要分為三類：白腐菌、褐腐菌、軟腐菌。

7、其中白腐真菌的降解能力最強(qiáng) , 并且分 泌胞外酶對(duì)木質(zhì)素降解過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生色素 , 開(kāi)發(fā)利用前景較好，被認(rèn)為是目前最為理想的一類降解木質(zhì) 素的真菌 8,9。其主要分布在革蓋菌屬 (Coriolus )、煙管菌屬 ( Sjekandera) 、平革菌屬 (Phanerochaete) 、側(cè) 耳屬 (Pleurotus)及臥孔菌屬 (Poria ) 等10。目前，用于木質(zhì)素降解研究的白腐菌主要有黃孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium)11,12、雜色云芝 (Coridus versicolor )13-15、平菇 ( Pleurotus ostreatus) 13 、

8、變色 栓菌 (Thametes versicolor )、朱紅密孔菌 ( Pycnoporus cinnabarinus ) 等，其中黃孢原毛平革菌是研究最透 徹的模式菌 16-18。降解木質(zhì)素的細(xì)菌主要有厭氧梭菌 (Clostridium sp.)、不動(dòng)桿菌 (Acinetobacter)、黃桿菌屬 (Flavobact -erium )、微球菌屬 (Micrococcus )、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、雙芽孢桿菌屬 ( Amphibacillus )、黃單胞菌 屬 (Xanthomonas)、枝動(dòng)桿菌屬 (Mycoplana ), 還有粘膜炎布蘭漢氏球菌 ( Branhame

9、llacatarrhalis )、環(huán)絲菌 ( Brochothrix )、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌 (Bacillus firmus )，其中假單胞菌屬是最有效的降解菌 19,20。細(xì)菌在初級(jí)代謝 階段降解木質(zhì)素，在生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期合成木質(zhì)素降解酶21 。細(xì)菌在降解過(guò)程中主要是使木質(zhì)素一定程度上發(fā)生變性 , 成為水溶性的聚合物，很少將木質(zhì)素礦化為CO2。另外，細(xì)菌在木質(zhì)素降解過(guò)程中主要起著間接的作用，即細(xì)菌與真菌協(xié)同作用使木質(zhì)素易于受到真菌的攻擊，且可去除對(duì)腐朽真菌有毒性的物質(zhì) 19。放線菌類是公認(rèn)降解能力較強(qiáng)的細(xì)菌，降解木質(zhì)素的放線菌主要有鏈霉菌屬(Streptomyces)22,23 、高溫放線菌

10、屬 (Thermoactinomyces) 、節(jié)桿菌屬 (Arthrobacter ) 、小單孢菌屬 ( Micromonospora ) 、諾卡氏菌屬 ( Nocardia ) 和褐色高溫單胞菌 (Thermonospora fusca)。Tuomela M 等 20研究表明，鏈霉菌屬的絲狀細(xì)菌降 解木質(zhì)素最高可達(dá) 20，在木質(zhì)素降解中起主要作用。近年來(lái)的研究也發(fā)現(xiàn)了一些非常規(guī)降解菌種,如張金萍等 24發(fā)現(xiàn)的靈芝屬某些菌種對(duì)木質(zhì)素都有較好的降解能力。 RC Bonugli-Santos25研究發(fā)現(xiàn)三株海洋真菌在不同碳源及鹽濃度下可以產(chǎn)生不同酶活力的木 質(zhì)素酶，其中 M. racemosu-s

11、 CBMAI 847 產(chǎn)生的 LiP 、MnP、 Lac的酶活力最高值分別達(dá) 75376.34、 4484.30、 898.15 UL-1。 關(guān)于土壤低等真菌降解木質(zhì)素的研究報(bào)道也時(shí)有出現(xiàn), 主要有產(chǎn)黃青霉 (Penicilliumchrysogenum) 、鐮刀霉 (Fusarium proliferatum )、簡(jiǎn)青霉( Penicillium simplicissimum )等 26。木質(zhì)素微生物降解酶系的理化性質(zhì)及作用機(jī)理木質(zhì)素的微生物降解過(guò)程中發(fā)生的主要化學(xué)變化有側(cè)鏈氧化、去甲基化、去甲氧基化、芳環(huán)開(kāi)環(huán)等。 木質(zhì)素高聚物在微生物 /酶的作用下，結(jié)構(gòu)單元間連接鍵的斷裂并對(duì)側(cè)鏈進(jìn)行一定的

12、修飾，使原來(lái)的高分子化合物分解為低分子物質(zhì)。 木質(zhì)素降解酶系主要包括 3種酶：錳過(guò)氧化物酶 (Manganese Perxidases MnP) 、 木質(zhì)素過(guò)氧化物酶 (Lignin Peroxidases LiP) 和漆酶 (Laccase)。另外，芳醇氧化酶 (Aryl-alcoholoxidase AAO) 、乙二醛氧化酶 (Gyoxaloxidase GLOX) 、葡萄糖氧化酶 (gucose-l-oxidase GIO) 、酚氧化酶、過(guò)氧化氫 酶、新阿魏酰酯酶、對(duì)香豆酰酯酶也與木質(zhì)素的降解密切相關(guān)27 。錳過(guò)氧化物酶( MnPs)1984年 Masaaki等首次從白腐真菌(Phane

13、roehaete Chrysosporium )木質(zhì)素裂解培養(yǎng)液中分離檢測(cè)到MnPs 。 MnPs是一種血紅素蛋白，含有多種同工酶，分子量約為3262.5 KDa之間，大多數(shù)純化后的 MnPs分子量都在 45 kD 左右，最適 pH為47，最適溫度為 4060 28-30。MnPs由一個(gè)鐵血紅素基和一個(gè) Mn2+構(gòu)成 了活性中心，另外還有兩個(gè)起穩(wěn)定結(jié)構(gòu)作用的Ca2+，其分子中有十條長(zhǎng)的蛋白質(zhì)單鏈，一條短的單鏈，在溫度大于 40時(shí)開(kāi)始失活，最佳穩(wěn)定 pH值是 4.8。MnPs的產(chǎn)生菌主要是一些白腐真菌 31，多屬擔(dān)子菌亞門， 無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱，無(wú)褶菌目的多孔菌科。在 Mn2+和 H202存在時(shí)，

14、MnPs能氧化分解芳香環(huán)多聚體，被認(rèn)為是 木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一 32,33。MnPs在過(guò)氧化氫存在時(shí)可氧化酚型木質(zhì)素及木質(zhì)素模型物，即由Mn 2+及一種螯合物催化木質(zhì)素發(fā)生降解， Mn2+被氧化成 Mn 3+，Mn3+反過(guò)來(lái)又氧化酚型化合物， 并保護(hù) MnPs不受活性 自由基的破壞 34。R-OHFig.1 MnP catalytic reaction mechanism木質(zhì)素過(guò)氧化物酶( LiP )1990年Kent和Ming 等首次從白腐真菌屬的黃孢原毛平革菌(Phanerochete chrysosporium) 的限制性培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了 LiP ，在木質(zhì)素降解中起關(guān)鍵性作用。 LiP也

15、是一種血紅素蛋白，它的活性中心與MnP近似，但卻不含 Mn 2+。其分子中也有十條長(zhǎng)的蛋白質(zhì)單鏈,一條短的單鏈，其氨基酸順序有43%與MnP相同。Asgher36和Hirai 37等研究表明 LiP的糖基化亞鐵血紅素蛋白質(zhì)通常以多種復(fù)合的形式產(chǎn)生，即含有多種同工酶，分子質(zhì)量一般在 3750 KD 。經(jīng)過(guò)純化后的 LiP的分子質(zhì)量在 40 KD 左右，等電點(diǎn)為 3.5左右，最適酶活 溫度為 3555，最適 pH為2.05.030,38,39。LiP氧化還原電位為 1.5 V，在 H202存在時(shí)， LiP能氧化分解芳香 環(huán)多聚體 , 通過(guò)催化木質(zhì)素側(cè)鏈的 C一 C鏈?zhǔn)蛊鋽嗔褟亩到饽举|(zhì)素，被認(rèn)為是

16、木質(zhì)素降解的關(guān)鍵酶之一。LiP 的產(chǎn)生菌在自然界分布相當(dāng)廣泛，許多腐朽木材的白腐菌、褐腐菌都可以產(chǎn)生。LiP 能催化木質(zhì)素中富含電子的酚型或非酚型芳香化合物發(fā)生氧化，產(chǎn)生活性基團(tuán)， 然后發(fā)生一系列的非酶促裂解反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的部分氧化或徹底的氧化 40 ，具體反應(yīng)機(jī)制如下 41:圖2 LiP 的催化循環(huán)Fig.2 Catalytic cycle of LiPLiP化合物 I攜帶H 202的兩個(gè)氧化當(dāng)量，一個(gè)為 Fe4+-O中心，另一個(gè)形成卟啉的陽(yáng)離子自由基。基質(zhì)R被化合物 I 氧化成芳基陽(yáng)離子自由基，然后通過(guò)一系列的非酶反應(yīng)生成最終的產(chǎn)物。漆酶( Lac)1883年，日本學(xué)者 Yoshi首次從

17、日本紫膠漆樹(shù) (Rhus vemieittua) 漆液中發(fā)現(xiàn)一種可催化漆固化過(guò)程的蛋 白質(zhì)， 1895年， Bertrand 將這種蛋白質(zhì)命名為漆酶 (Laccase)，隨后人們研究發(fā)現(xiàn)它廣泛存在于植物、昆蟲(chóng) 和高等真菌中， 甚至一些動(dòng)物腎臟 (如豬腎) 和血清中也發(fā)現(xiàn)了漆酶。 漆酶按其來(lái)源主要分為漆樹(shù)漆酶 (Rhus Laccase)和真菌漆酶( Fungal Laccase)兩大類。在真菌中，漆酶廣泛存在于擔(dān)子菌(Baidimycetes)、多孔菌 ( Polyporus )、子囊菌( Asomycetes)、脈孢菌( Neurospora )和柄孢殼菌( Podospora )等中。有文

18、獻(xiàn) 42 報(bào)道，單獨(dú)培養(yǎng)黃孢原毛平革菌( P. chrysosporium )很難檢測(cè)到漆酶活性。 Lac是一種含銅的多酚氧化酶， 屬藍(lán)色多銅氧化酶家族， 由肽鏈、 糖配基和 cu2+三部分組成，肽鏈一般由 500 550個(gè)氨基酸組成， 糖配基主 要包括氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和阿拉伯糖，其分子量在5890 KDa 之間43,44。對(duì)于不同白腐真菌，漆酶的最適 pH變化范圍為 210，最適的溫度范圍為 4065 43-46 。同一漆酶對(duì)不同底物作用 時(shí)，最適作用 pH 也有差異 47。迄今已有較耐高溫真菌漆酶的報(bào)道， Marasmium quercophilus 所產(chǎn)漆酶在 7

19、5 條件下半衰期為 10 min48。漆酶催化反應(yīng)不需要過(guò)氧化氫參與，一般認(rèn)為漆酶催化反應(yīng)是木質(zhì)素降解的啟 動(dòng)步驟 49。漆酶可在僅有碳源存在的條件下由菌體分泌，并且具有780 mV氧化還原電位，在沒(méi)有 H202和其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的存在下可催化有機(jī)污染物的氧化42。Lac所催化的主要是氧化反應(yīng)， 表現(xiàn)在底物自由基的生成和4個(gè)銅離子的協(xié)同作用，主要攻擊木質(zhì)素中的苯酚結(jié)構(gòu)單元，在反應(yīng)中，苯酚被氧化產(chǎn)生含苯氧基自由基的活性基團(tuán)，可導(dǎo)致芳香基的裂解。 Lac同時(shí)具有催化解聚和聚合木質(zhì)素的作用，因此單獨(dú)存在時(shí)不能降解木質(zhì)素，只有同時(shí)存在 MnP 等其他酶，避免反應(yīng)產(chǎn)物重新聚合時(shí)，才有較高的木質(zhì)素降解效率

20、。對(duì)其作用機(jī)理，目前比較廣泛接受的是其催化多酚化物如氫醌，此過(guò)程須經(jīng)過(guò)四次單電子傳遞。首先，底物氫醌向漆 酶轉(zhuǎn)移一個(gè)電子生成半醌 -氧自由基中間體，而后兩分子半醌生成一分子氫醌和一分子苯醌，氧自由基中間體還能轉(zhuǎn)變成碳自由基中間體，它們可以相互結(jié)合或相互偶聯(lián)。因此，在菌體內(nèi)，漆酶與其它氧化木質(zhì)素酶系協(xié)同降解木質(zhì)素。在體外實(shí)驗(yàn)中，木質(zhì)素單體在Laccase/O2條件下會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)。 O2存在條件下，還原態(tài)漆酶被氧化，O2被還原成水 , 漆酶催化底物氧化和對(duì)02的還原實(shí)現(xiàn)過(guò)程可用下式表示502+（氧 化態(tài)）Cu2+Cu Cu42+2e底物分子內(nèi)+ + 4+ 2+ 2+ 2+Cu+ Cu+ Cu24

21、+Cu2+ Cu2+ Cu22+電 子轉(zhuǎn) 移 22e +Cu+ 底物還C原u2態(tài)+2+Cu2+O2,2H-H O2 , 快Cu2+2+Cu（ Cu2 O ）3+ 2H-H O2+,慢Cu2+ Cu2+ Cu24+（ 氧 化 態(tài) ） 圖3 Lac 的催化作用過(guò)程Fig.3 Catalytic action process of Lac白腐真菌木質(zhì)素降解酶系的降解機(jī)理 白腐真菌以其獨(dú)特的生理生化機(jī)制和強(qiáng)大的降解代謝能力而成為木質(zhì)素降解研究的模式菌株，是已知 的唯一能在純系培養(yǎng)中有效地將木質(zhì)素降解為CO2和H2O的一類微生物 51。近年來(lái)， 有研究報(bào)道白腐菌對(duì)木質(zhì)素的降解主要依靠特殊的胞外水解酶和氧

22、化酶的作用52-57 。白腐菌對(duì)木質(zhì)素的降解過(guò)程復(fù)雜，但至少存在三種方式的降解反應(yīng) 56 ：(1) 丙烷基側(cè)鏈 C-C鏈的氧化斷裂形成苯甲酸； (2)-芳醚鍵和側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的改變： (3)芳香環(huán)通過(guò)氧化開(kāi)環(huán)發(fā)生降解。白腐菌對(duì)木質(zhì)素的降解是以自由基為基礎(chǔ)的鏈反應(yīng)過(guò)程58。首先，在有氧條件下， H2O2激活過(guò)氧化物酶，過(guò)氧化物酶觸發(fā)生成許多高度反應(yīng)性的自由基活性中間體，然后以鏈反 應(yīng)的方式繼續(xù)產(chǎn)生多種自由基， 導(dǎo)致各種連接鍵的斷裂， 使木質(zhì)素解聚成各種低分子量片段， 其中小于 l KD 的占多數(shù)，再?gòu)氐椎难趸蔀?CO259 。 這種自由基反應(yīng)是高度非特異性和無(wú)立體選擇性的，即白腐真菌與 被降解底物并

23、非酶與底物的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，而是與一類乃至多類底物的關(guān)系60 。木質(zhì)素降解酶的活性調(diào)控影響木質(zhì)素降解酶產(chǎn)生的外界因素主要有：碳源、氮源、誘導(dǎo)劑和表面活性劑、微量元素等。C和 N這兩種重要的營(yíng)養(yǎng)調(diào)控著真菌木質(zhì)素降解酶的合成和活性。C源和 N源的種類以及 C N比是影響木質(zhì)素降解酶含量的主要因素。因此，近年來(lái)已成為被廣泛研究的熱點(diǎn) 61-63。誘導(dǎo)物不僅能誘導(dǎo)木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生，還起到分散劑和保護(hù)劑的作用，研究較多的是藜蘆醇（VA ）。表面活性劑主要是提高細(xì)胞膜的滲透性，菌種不同，最適的表面活性劑也不同，研究最多的是吐溫80。同時(shí)，關(guān)于其他誘導(dǎo)劑和表面活性劑的研究也有很多 64,65。已有研究表明在

24、培養(yǎng)體系中加入苯甲醇，可以顯著提高木質(zhì)素酶的活性61。一般而言，重金屬對(duì)酶主要起抑制作用。然而最新研究發(fā)現(xiàn)，重金屬如Zn和Cu在低濃度下能夠提高真菌的 LiP和 MnP活性，而Mn 和Cu更是分別直接參與了 MnP和Lac的催化循環(huán)，是木質(zhì)素降解酶所需的主要微量元素。因此，重金 屬對(duì)木質(zhì)素降解酶的誘導(dǎo)作用受到普遍關(guān)注66,67。培養(yǎng)溫度、氧濃度、通氣狀況、 pH值、代謝產(chǎn)物乃至環(huán)境濕度等，也是影響木質(zhì)素降解酶產(chǎn)生的因素。培養(yǎng)溫度和pH值對(duì) Lac的影響因具體菌種而異，不同的菌種有不同的適宜培養(yǎng)溫度和 pH 值。4 結(jié)語(yǔ)利用微生物降解木質(zhì)素是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)作用過(guò)程，不同酶活性的高低還可能與它

25、們?cè)谀举|(zhì)素降 解中的作用大小和不同降解階段中的作用順序有關(guān)。 其中， 酶系組成和生物化學(xué)反應(yīng)機(jī)制尚有許多未知數(shù)， 因此仍需對(duì)其催化機(jī)制和木質(zhì)素降解酶基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制等進(jìn)行綜合研究。目前，生物降解多采用混合發(fā) 酵68-74，由于菌種彼此間木質(zhì)素降解酶系、生活史長(zhǎng)短、營(yíng)養(yǎng)需求及生長(zhǎng)因子等不同的生物學(xué)特性互補(bǔ)， 在分泌木質(zhì)素降解酶系上表現(xiàn)了較好的種屬互惠性，使混合發(fā)酵降解率以及酶活顯著高于單一菌種，達(dá)到 高降解的目的。因此，采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建具有木質(zhì)素降解基因的工程菌 75-78，以及篩選出更加高效 降解木質(zhì)素的復(fù)合菌系均是未來(lái)的發(fā)展方向。相信在不久的將來(lái),隨著對(duì)木質(zhì)素酶催化機(jī)理認(rèn)識(shí)的加深，以及

26、應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)木質(zhì)素降解酶相關(guān)基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控機(jī)理等深入研究 , 木質(zhì)素的生物降解將取 得重大突破；同時(shí)，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，開(kāi)發(fā)出高效降解木質(zhì)素的復(fù)合菌劑，對(duì)于解 決能源緊張、糧食短缺及環(huán)境污染等難題也同樣具有重要的指導(dǎo)作用。參考文獻(xiàn)蔣挺大 . 木質(zhì)素 （第二版 ） M. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社 , 2008, 116.Zhang G M（ 張桂梅 ）, Liao S Q（ 廖雙泉 ）, Lin H L（ 藺海蘭 ）, et al. Progress in studying the extraction and comprehensive utilization of

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