Bio-rad MicroPulser電穿孔儀中文說明書

1、MicroPulser電穿孔儀操作手冊2018年 12月 27日1、 介紹（1）基本原理MicroPulser 電穿孔儀用于細(xì)菌、酵母和其他眾多微生物的電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時，高壓電 脈沖作用于懸浮在小體積高阻介質(zhì)中的樣品。本系統(tǒng)由一個脈沖發(fā)生器（pulse generator） 模塊、一個電擊腔（shocking chamber）和一個裝有電極的電擊杯（cuvette）組成。樣 本放置于電擊杯的電極之間。MicroPulser模塊包含一個電容器，將電容器充電至高電壓, 然后模塊將電容器中的電流放電到試管中的樣品中。MicroPulser的電容放電電路產(chǎn)生具有指數(shù)衰減波形的電脈沖，如下圖。當(dāng)電容器放

2、電 至樣品時，跨越電極的電壓迅速上升至最大電壓（or峰值電壓，peak voltage；也稱為初 始電壓，Vo），并隨時間（t）減小，如下式：vt = vo e Equation 1其中T =RC,為時間常數(shù)，是脈沖長度的簡便表達式。R為電路電阻，單位為ohms （歐姆）。C為電容，單位為microfarad （微法拉）。根據(jù)方程1，t是電壓下降至峰值電壓1/e （37%）的時間。MicroPulser的內(nèi)部電 路被設(shè)計以使E.coli、釀酒酵母及其他許多微生物可以得到最佳電穿孔，最佳轉(zhuǎn)化效率發(fā)生在大約5ms的時間常數(shù)內(nèi)。這些電穿孔條件是通過使用10微法拉電容器和將600歐姆電阻與樣品池并聯(lián)以

3、及將30歐姆電阻與樣品池串聯(lián)來實現(xiàn)的。Time (msec)阻與樣品池并聯(lián)以及將30歐姆電阻與樣品池串聯(lián)來實現(xiàn)的。Time (msec)Fig. 2. Exponential decay pulse from a capacitance discharge system. When the capacitor, charged to an initial voltage, is discharged into cells, the voltage applied to ttie cells decreases over time so that at time t = t, the volta

4、ge is (1/e) x VQ of the initial value.除時間常數(shù)外，電場強度是另一個決定轉(zhuǎn)化效率的重要參數(shù)。電場強度E,是施加于電 極間的電壓，公式為：E - V/d Equation 2其中，V為施加的電壓，d為電極間的距離，單位為cm。電場強度和細(xì)胞的尺寸（size） 決定了橫貫每個細(xì)胞的電壓降，正是電壓降可能是電穿孔中電壓效應(yīng)的重要表現(xiàn)。30 歐姆串聯(lián)電阻的目的是在發(fā)生電弧的情況下保護設(shè)備電路。在正常操作條件下，當(dāng) 樣本在高電阻介質(zhì)中，電阻不會影響施加在樣本上的電壓。但是，當(dāng)樣本的電阻較低時，電 阻將極大地降低施加在樣品上的電壓。施加在樣品上的電壓的分壓降（frac

5、tio nal dr op） 由下式得到：R抑（RjO 1 Rsjmp J當(dāng)Rsamp為600歐姆，對于樣品就會有5%的電壓降（30/（30+600） =0.048）。 基于這個原因，當(dāng)樣品溶液的電阻低于600歐姆時，不應(yīng)進行電穿孔試驗。這包括培養(yǎng)基 未徹底從細(xì)胞中去除的樣本，殘留有NaCI的DNA樣本或連接混合物。MicroPulser能夠 測量樣本的電阻，若樣本介質(zhì)電阻過低則不會進行操作。(2)儀器參數(shù)操作(Manipulation of instrument parameters)Mic roPulser儀器的一些參數(shù)可以進行設(shè)置以達到最大轉(zhuǎn)化效率，包括場強E,時間常 數(shù)T,截斷指數(shù)衰減

6、脈沖的寬度。場強的設(shè)置可以有兩種方式進行操作。一是，介于 200-3000V 電壓可以直接在儀器上設(shè)置，這是最容易控制的。改變電壓而保持其他條件不 變是大多數(shù)電穿孔優(yōu)化程序的基礎(chǔ)。第二，使用不同電極間隙寬度的電轉(zhuǎn)杯也是改變場強的 一種方法。對于微生物的電穿孔，0.1和0.2cm間隙的電轉(zhuǎn)杯最常被使用。E.coli的電穿 孔當(dāng)使用0.1cm電轉(zhuǎn)杯時通常使用1.8kV電壓(E=18kV/cm)，而使用0.2cm電轉(zhuǎn)杯 時使用2.5kV電壓(E=12.5kV/cm)。這些電穿孔條件作為預(yù)設(shè)程序內(nèi)置于MicroPulser 中，分別位于細(xì)菌設(shè)置菜單中的Ec1 (V=1.8kV)和Ec2 (V=2.5k

7、V)。另外，細(xì)菌設(shè)備 菜單中的第三個程序Ec3的電壓為3.0kV (當(dāng)電轉(zhuǎn)杯為0.2cm時E=15kV/cm)，我們 發(fā)現(xiàn)可以得到比2.5kV更高的轉(zhuǎn)化效率。時間常數(shù)可以通過改變樣品的電阻而改變。樣品電阻的改變可以通過兩種方式。一是， 增加電穿孔介質(zhì)的鹽濃度或緩沖濃度會降低樣品的電導(dǎo)，反之亦然，結(jié)果導(dǎo)致時間常數(shù)的改 變。第二，電轉(zhuǎn)杯中樣品體積與樣品電阻呈反比，降低樣品體積會增加樣品電導(dǎo)。樣品體積 對電導(dǎo)的影響在低電阻介質(zhì)中是最顯著的。這些影響因素將會在后面部分進一步介紹。Mic roPulser還包括一種在電壓大于600V時比預(yù)期時間常數(shù)更快截斷指數(shù)衰減脈沖的 方法。當(dāng)脈沖被MicroPuls

8、er終止時，電壓只在樣品上作用指定長度的時間，可能在1.0 4.0 ms之間。下圖顯示了這種波形和真正的指數(shù)衰減脈沖的差異。Fig. 3. Truncatun of an exponential decay pulse by tfw MicroPuler. The sold lire shuvus Lhe voltFig. 3. Truncatun of an exponential decay pulse by tfw MicroPuler. The sold lire shuvus Lhe voltage applied t(j the cell as a hjnclion of time

9、 dunng 日 pule iBnninat&d alter 2.5 m$ec. The dashed line shows rho vdtago that would normEilly be applied 1u lhe celi& during 日 tru exponential decay pulso.Time (msec)2、 影響電穿孔的因素通過多年的研究，證實了微生物電穿孔的電條件( see Chang, et al., 1992, and Nickoloff, 1995, for overviews as well as for protocols on electropora

10、tion of nume rous species)。對大多數(shù)微生物而言，最佳電轉(zhuǎn)化發(fā)生在與E.coli和釀酒酵母所 使用的電轉(zhuǎn)化條件相似的條件下， E.coli 和釀酒酵母是當(dāng)今研究中最常使用的兩個物種。對 于E.coli的電穿孔,文獻報道最常使用的條件是0.2cm電轉(zhuǎn)杯,40川細(xì)胞樣本，電壓2.5kV, 時間5ms。對釀酒酵母，報告中最常使用的條件是0.2cm電轉(zhuǎn)杯，40川細(xì)胞樣品，1.5kV 電壓和時間常數(shù)5ms。對許多細(xì)菌而言，如沙門氏菌屬(Salmonella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、幽門螺桿菌(Helicobacter)、包柔式螺旋體屬(Borrelia)、鏈球 菌

11、屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)和腸球菌屬(Enterococcus),電 穿孔條件與 E.coli 一樣。而對于其他的細(xì)菌，改變電場強度可以得到更高的電轉(zhuǎn)化效率。 一個相似的案例可見于其他種屬的酵母。Mic roPulser的設(shè)計可以精確施加E.coli和釀酒酵母獲得最佳轉(zhuǎn)化效率所需的脈沖參數(shù)。 當(dāng)使用高阻樣本時，時間常數(shù)被設(shè)置為5ms。對于這些微生物，MicroPulser預(yù)先設(shè)定了 在 0.1 或0.2 cm 的電擊杯中電穿孔大腸桿菌，或在0.2 或0.4 cm 的電擊杯中電穿孔釀 酒酵母時輸送正確電壓的程序。細(xì)胞生長(Cell Gr owth)對于大

12、多數(shù)細(xì)菌而言，在對數(shù)生長期的早期或中期收獲細(xì)胞，可以得到最高的轉(zhuǎn)化效率。 對于E.coli,當(dāng)細(xì)胞進行穩(wěn)定期，轉(zhuǎn)化效率劇烈下降(Dower, 1990)。相反，大多數(shù)酵 母通常在對數(shù)生長的中期至晚期收獲細(xì)胞。對于釀酒酵母(S.cerevisiae),對數(shù)生長晚期 的培養(yǎng)物相比早期的培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)化效率提高了 60倍(Becker and Guarente, 1991)。 獲取細(xì)胞的最佳生長期通常隨細(xì)胞種類而異。當(dāng)制備一種新的物種的感受態(tài)細(xì)胞時，最好使 用為同種屬而制定的程序。對所需考慮因素的建議和常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法在 Dower et al(1992) 和 Trevors et al(19

13、92)的文章中被詳細(xì)討論。DNA大多數(shù)的電穿孔應(yīng)用是將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，需要提及的是，幾乎任何形式的分子 都可以通過電穿孔被導(dǎo)入細(xì)胞中，包括DNA、蛋白、糖類、小分子等。除了少數(shù)例外，當(dāng) 導(dǎo)入自主復(fù)制質(zhì)粒時，使用超螺旋質(zhì)粒進行電穿孔可以提高轉(zhuǎn)化效率。但是，將整合入宿主 基因組的質(zhì)粒當(dāng)使用線性化質(zhì)粒時，轉(zhuǎn)化效率較高。例如，假絲酵母、畢赤酵母和四膜蟲使 用線性質(zhì)粒比超螺旋質(zhì)粒效率更高。在E.coli和單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)電穿孔轉(zhuǎn)化時， 使用松弛型環(huán)狀質(zhì)粒(relaxed circular plasmid)僅比使用超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率略低(Le

14、onardo and Sedivy， 1990， Park and Stewart， 1990)。但是，在 E.coli 和 Streptococcus pyogenes (釀膿鏈球菌)的電穿孔轉(zhuǎn)化時，線性質(zhì)粒比環(huán)狀質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 效率低 103-104 倍(Shigekawa and Dowe r, 1988, Sim on and Ferr etti, 1991 )。在大多數(shù)物種中，每mol數(shù)量的質(zhì)粒的電穿孔效率隨著質(zhì)粒大小的增加而降低，包括E. coli (Leonardo and Sedivy, 1990, Siguret et al., 1994)，Pseudomonas aerugin

15、osa (假單胞菌屬)(De nnis and Sokol, 1995)，和 Str eptococcus the rmophilus (嗜 熱鏈球菌屬)(Somkuti and Ste in be rg 1988)。但是，有些物種，包 括Lactococcus lactis (乳球菌屬)(Holo and Nes， 1995)， Enterococcus faecalis (腸球菌屬) (Cruz-Rodz and Gilmore 1990)和 Clostridium perfringens(產(chǎn)氣莢膜梭菌)(Allen and Blaschek，1990),轉(zhuǎn)化效率似乎與質(zhì)粒大小(即使高達2

16、0-30Kb)無關(guān)。盡管微生物的轉(zhuǎn)化使用各種方法提取的質(zhì)粒都可以完成，但質(zhì)粒的純度是影響轉(zhuǎn)化效率 的一個因素。未純化的小量制備的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化效率明顯低于經(jīng)過各種方法純化的質(zhì)粒 DNA。利用Bio-Rad Quantum matrix制備的質(zhì)粒與CsCl純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)。通常，對于所有種類的微生物，轉(zhuǎn)化頻率隨著 DNA 濃度的增加而增加。對于 E.coli， 轉(zhuǎn)化頻率(轉(zhuǎn)化子/活細(xì)胞)受DNA濃度影響的范圍在106 (10 pg/ml to 7.5 g/ml), 在這個范圍內(nèi)，DNA濃度決定了細(xì)胞被轉(zhuǎn)化的概率。在較高的DNA濃度，高達80%的活 細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化(Dower et al，19

17、88)。因為獲得的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量是轉(zhuǎn)化頻率和細(xì)胞數(shù)量 的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化效率(轉(zhuǎn)化子/ug DNA)在109-3x101。細(xì)胞/ml范圍內(nèi)隨細(xì)胞濃度增加而 增加。因此，為了獲得高的轉(zhuǎn)化頻率(transformation frequency)，請使用高的DNA 濃度。為了獲得高的轉(zhuǎn)化效率(transfor mation efficie ncy),請使用高的細(xì)胞濃度(和 低的DNA濃度以防止共轉(zhuǎn)化cotransformation)。在每個實例中，小的樣本體積(20-50卩1) 允許經(jīng)濟地使用 DNA 和細(xì)胞(see Dower et al., 1988, for a detailed discussion

18、 of these factors)。(3)電穿孔介質(zhì)(Elect ropo ration Media)MicroPulser被設(shè)計以使用具有高阻介質(zhì)的樣本。基于此，當(dāng)制備感受態(tài)細(xì)胞時，洗滌 以徹底去除培養(yǎng)基是非常重要的。若未徹底去除細(xì)胞中的培養(yǎng)基將導(dǎo)致電穿孔時在樣本中產(chǎn) 生電弧。細(xì)胞應(yīng)該用水或低離子強度的溶液如蔗糖、甘油、葡萄糖、山梨醇或PEG洗滌至 少3 次。對許多微生物而言，甘油是一種方便的電穿孔介質(zhì)，因甘油通常被用于細(xì)胞保存 的冷凍保存液。下圖展示了幾種不同生物學(xué)上的重要離子溶液對樣品電阻的濃度效應(yīng)。注意幾點：體積對樣品的電阻有重要影響一一對離子溶液，樣品電阻和電轉(zhuǎn)杯中樣品的體積呈 反

19、比；含有二價離子的溶液的電阻比含有相同濃度單價離子的溶液電阻低；緩沖溶液的電阻受pH值影響。 即使極低濃度的離子化合物的加入都可以顯著降低樣品的電導(dǎo)，進而引發(fā)電弧作用。通 過乙醇沉淀法制備的DNA中殘留的鹽應(yīng)該在用水或TE buffer溶解DNA前洗滌DNA以降低鹽濃度。40003500 +30002500Cp n 40003500 +30002500Cp n (:*nt rstiQn (m M)Fig. 4. Resistance of solutions of (A) NaCI and MgCI2 and of (B) buff&rs af NaPQ4 at pH 6.1 and 7.3

20、and HEPES at pH 7.5. Resistance was measjretj in 0.2 cm cuvettes containing either 40 pl or 200 pl of solution at room temperature.表 1 表明，雖然將含有 10mM Tris， 1mM EDTA，pH8.0 溶液的質(zhì)粒加入水中，確 實會降低樣品的電導(dǎo)，但這應(yīng)該不會導(dǎo)致不能使用Mic roPulser進行電穿孔試驗?？梢灾?接使用酶反應(yīng)的 DNA 進行轉(zhuǎn)化，但進行高壓脈沖操作時，最終電穿孔樣品中的鹽濃度應(yīng)該 保持在低于5meq的水平。最后，連接混合物可能可以用于轉(zhuǎn)化

21、，但DNA加入量必須極 低或者通過稀釋(Wills on and Gough 1988)、透析(Hee ry and Dun ican 1989； Jacobs et al., 1990)或乙醇沉淀(Bottger, 198& Zabarovsky and Winberg 1990)降低離子強度。Table 1. Resistance of Water in 0.2 cm Cuvettes To Which TE Has Been Added1.tamphe(40 pl volume)sample(200 pl volume)6x 10s6x 10s35.0001120087004,8504,

22、700SAMPLEWaterWater + 1 pl TEWater + 5 p TEWater + 10$TE1 The resistance of 0.2 cm cuveues coniaining either 40 or 200 川 waler and the indicated volume of TE 00 inM Tris, pH 8U mM EDTA) was measured at 1000 V.3、 MicroPulser 操作說明參見圖1 了解MicroPulser的各個組件，圖5標(biāo)注了各個按鈕和LED的名稱。.BIO HAD.MfcroPu/ser*Settings*F

23、unofHI MvnulMeafiurMientsAciuai*kVPulseRaise.BIO HAD.MfcroPu/ser*Settings*FunofHI MvnulMeafiurMientsAciuai*kVPulseRaiseandLowerButtonsDisplay LEDSettingsSettirbgs buttonLEDsMeasurementsbuttonPulsebuttonMeasurementsLEDsFig+ 乩 MicroPulser control panel,3.1 設(shè)置 MicroPulser 系統(tǒng) 將黑色電源線連接到 MicroPulser 脈沖發(fā)生器

24、模塊的后面板。將電源線插入墻上 的插座或電源線。 拉下 MicroPulser 底部的折疊腳。將該腳插入電擊腔底部的軌道中。將電擊腔滑 塊滑入電擊腔。 將從電擊腔引出的導(dǎo)線連接到 MicroPulser 前面板上的輸出接口上；極性對電穿 孔過程并不重要。 打開電源開關(guān)。LED燈應(yīng)亮起并且顯示為“Ec1 ”，隨后LED指示細(xì)菌設(shè)置狀態(tài) (Bacteria Setteing)。3.2 MicroPulser 的操作1)選擇預(yù)設(shè)的程序MicroPulser 預(yù)設(shè)了數(shù)種常見的微生物的電擊程序如下:ProgrpmCuvtt? Siz-?Pnet CqrMjrtkknSBacteriiaEc1Escbef

25、icZwa coftOJ cmLBQ1 pufeeEcfEschfict cofi12,50 kX 1 pUseSlA2 cm2.50kX 1 pUse* 2.5 ms陌AgDnodactienLm ibmgfeiQRen-s2.20 kV；l pUseEc3Eteroha cofi0.2 cm3.00 N 1 ixiseFungiSc2SaccAaranyces cerensiafl02 cm1,50 幗 1 pUtesSC4Saccftaro/nyces cereinsiae02 cm3,00 K i (AtseShSScnoosacchafomyces p(x?iie2 cm.00 Wr

26、 1 pUseDieOcfyaEfeSLun dZsracfeum0/ emi.DO k i pLtse. 1.0 m&Pc%1治朋s?o畔0-2 cm2-00 i pawUnless tl昭 ptise tnue 總 hunched below 5 ms, the unrt 新II deliver the optimal timconslant of -5 ms to 國mptes in hgh-600 W load:voltage and currentbmted at 100 A peak maximumOutput waveformDecaying or truncated-decay

27、ing exponewaveform wrth RC time consta ntOutput vottage andVoltage adjustable in 200-3,000 V rangepulse duration adjustmentwith 10 V precision; 5 ms defauft or1-4 ms with 0J ms precision; 5 bacterial and 5 fungal preset programsAmbient operating temperature35-35弋Dimensions (W x D x H)29x21 x 8 errWe

28、ht2,9 kg系統(tǒng)特點：處理樣品的速度更快簡單的一鍵“Pulse”操作、快速的充電時間?？焖俚某绦蜻x擇內(nèi)置的、優(yōu)化的程序適合細(xì)菌和酵母的通用研究。電弧淬滅系統(tǒng)(ARQ, Arc quenching system)減少電弧效應(yīng)，保護有價值樣本的損失。更寬的參數(shù)手動優(yōu)化空間一一手動程序允許在200-3000V范圍內(nèi)設(shè)置電壓，精 度10v；脈沖時間可以在1.0-4.0ms范圍內(nèi)調(diào)整，精度0.1ms。3000V容量一一可以提高大體積的轉(zhuǎn)化效率。緊湊型、節(jié)省空間的設(shè)計?？陕犚姾涂梢暬拿}沖指示。可顯示時間常數(shù)和實際釋放電壓可監(jiān)測重復(fù)性。為什么要用電轉(zhuǎn)化？電轉(zhuǎn)化是目前可用的效率最高的轉(zhuǎn)化方法。它比化學(xué)轉(zhuǎn)

29、化方法的轉(zhuǎn)化效率高幾個數(shù)量級 并且比其他方法重復(fù)性更好。MicroPulser被設(shè)計為E.coli、fungi和其他微生物的電轉(zhuǎn)化 提供最佳的電條件，可以獲得最高的轉(zhuǎn)化效率。Example ResultsSpeciesStrainVolumeEfficiencyBacteriaE. cofiDH10B20 pl1,6 x 10E COfiDH10B20 pl3-2 x 10S aureusRN422O50 Ml1.2x 1CBA tumefaciensLBA44O420 Ml7.0 x 10fiE. cofiDH10B20 pl9,1 x 10uFungiS cerevisiaeSc94840 m8J x 104S cerevisiaeSC94830 pl22 k QS pombeCHP4O3200 pl1.4 x 10dD. discoideumKAx3800 pl88P pastonsX3340 pl1.6x 心Experiments were carried out in an ordinary laboratory and represent average efficiencies obtained using the preset programs. The efficiencies were measured per 1 pg plasmid b